Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Realtidsmålinger af calcium- og kontraktilitetsparametre i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Her beskrives en etableret metode til at udføre kontraktilitets- og calciummålinger i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter ved hjælp af en optikbaseret platform. Denne platform gør det muligt for forskere at studere effekten af mutationer og responsen på forskellige stimuli på en hurtig og reproducerbar måde.

Abstract

Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere mutationsmedierede ændringer i kardiomyocytfunktion og definere virkningerne af stressorer og lægemiddelinterventioner. I denne undersøgelse demonstreres det, at dette optikbaserede system er et kraftfuldt værktøj til at vurdere de funktionelle parametre for hiPSC-CM'er i 2D. Ved at bruge denne platform er det muligt at udføre parrede målinger i et velbevaret temperaturmiljø på forskellige pladelayouter. Desuden giver dette system forskere øjeblikkelig dataanalyse.

Dette papir beskriver en metode til måling af kontraktiliteten af umodificerede hiPSC-CM'er. Kontraktionskinetikken måles ved 37 °C baseret på pixelkorrelationsændringer i forhold til en referenceramme taget ved afslapning ved en 250 Hz samplingfrekvens. Derudover kan samtidige målinger af intracellulære calciumtransienter opnås ved at indlæse cellen med en calciumfølsom fluorofor, såsom Fura-2. Ved hjælp af en hyperswitch kan ratiometriske calciummålinger udføres på et belysningspunkt med en diameter på 50 μm, svarende til arealet af kontraktilitetsmålingerne.

Introduction

Hjertesvigt er den største dødsårsag på verdensplan. I 2019 forårsagede hjerte-kar-sygdomme 18,6 millioner dødsfald globalt, hvilket afspejler en stigning på 17,1% i løbet af det sidste årti1. På trods af forskernes bestræbelser på at identificere lægemiddelmål for at forebygge og helbrede hjertesvigt er patientresultaterne stadig dårlige2. Forskellen i patofysiologien af dyremodeller med hensyn til mennesker kan være en af de underliggende faktorer i den begrænsede succes for optimering af hjertesvigtsbehandling3. Yderligere menneskelignende modeller er berettiget til at modellere sygdom og teste toksiciteten og effektiviteten af nye lægemiddelforbindelser.

Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at definere cellulære patomekanismer induceret af stressorer, iskæmi, ændret metabolisme eller patogene genvarianter og effektiviteten og toksiciteten af lægemiddelinterventioner4. For at definere effekter på hiPSC-CM'ers funktionelle egenskaber er et højhastighedssystem, der måler de systoliske og diastoliske egenskaber af cellulære sammentrækninger på en upartisk og reproducerbar måde, berettiget. Dette overordnede mål med den aktuelle undersøgelse er at demonstrere, at et optikbaseret system er et kraftfuldt værktøj til at udføre realtidsanalyser af de funktionelle parametre for hiPSC-CM'er.

I øjeblikket er der flere platforme til evaluering af kontraktiliteten af hiPSC-CM'er. Imidlertid tilbyder nuværende systemer enten en langsom aflæsning, eller det krævede antal celler kan være en udfordring. Etiketfri videomålingssystemer5,6 er afhængige af post-hoc-analyse af videoer, hvilket kræver meget lagerplads og mangler direkte feedback under videooptagelse. Desuden er det vanskeligt at opnå tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning, og det kan resultere i undersampling. Andre metoder til bestemmelse af kardiomyocytegenskaber, såsom grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas9-redigerede hiPSC-CM'er7 med fluorescerende reportere, kan forstyrre cellernes genstabilitet og kræve specialiseret laboratorieekspertise.

For at overvinde de ovennævnte begrænsninger blev et unikt optikbaseret målesystem udviklet og introduceret i denne undersøgelse. Denne platform muliggør kontraktilitetsmålinger på umodificerede hiPSC-CM'er ved blot at genbelægge dem på ethvert påkrævet pladeformat uden nogen begrænsning i pladestørrelse. Desuden muliggør realtidsmålinger direkte observation og analyse af de funktionelle parametre for hiPSC-CM'er og giver derved en eksperimentel indstilling til øjeblikkeligt at justere og optimere protokoller. Desuden gemmes placeringen af hver måling, hvilket muliggør parrede målinger på den samme prøve og derved øger eksperimenternes effekt.

For at demonstrere det optikbaserede system blev kontraktilitetsmålinger udført på en kontrol hiPSC-CM-linje. Denne kontrol hiPSC-linje blev genereret fra dermal fibroblast hos en sund mandlig donor med en normal karyotype8. Kontraktionskinetikken blev målt ved 37 °C baseret på pixelkorrelationsændringer i forhold til en referenceramme taget under afslapning ved en 250 Hz samplingfrekvens. Da den nøjagtige begyndelse af sammentrækningen ikke altid kan bestemmes entydigt, blev det tidspunkt, hvor 20% af tophøjden blev nået (tid til top 20%), taget som udgangspunkt for målinger af tid til top. Ved at gøre dette blev der fundet mindre variabilitet for denne parameter inden for en prøve. Da det nøjagtige tidspunkt, hvor signalet vender tilbage til baseline, er vanskeligt at vurdere, blev den tid, det tog at nå 80% af tilbagevenden til baseline fra peak (tid til baseline 80%) ), brugt til at beskrive afslapningstiden.

Samlede kontraktilitetsmålinger omfattede hvileslagfrekvenser, tiden fra 20% peak til peak kontraktion (TP. Con), og tiden fra peak sammentrækning til 80% af baseline (TB. Con80) (figur 1B). For at teste effekten af en stressor blev celler inkuberet med isoprenaline (ISO). Derudover blev Ca 2+ transienter sammen med kontraktilitetsmålinger målt ved at indlæse cellerne med Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2 AM) med en prøveudtagningsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriske Ca 2+ målinger 9 ved hjælp af en hyperswitch blev udført på et 50 μm diameter belysningsområde, svarende til arealet af kontraktilitetsmålingerne. Ca 2+ måledata er vist som tiden fra 20% top til top i Ca2+ transient (TP.Ca) og tiden fra top til 80% af baseline (TB.Ca80) (figur 1C). Et hurtigt, automatisk dataanalyseværktøj blev brugt til at give gennemsnitlige kontraktile og calciumkinetiske parametre for hvert område.

Protocol

1. Fremstilling af cellekulturmedier og reagenser

  1. Forbered hiPSC-CM-medier ved at tilføje 1 ml B27-supplement (50x) til 49 ml RPMI1640.
  2. Klargør overfladebehandlingsmediet ved først at tilsætte 5 ml knockout-serumerstatning til 45 ml hiPSC-CM-medie. Derefter tilsættes 22,5 μL Y-27632 ROCK-hæmmer (1:2.000 fortynding; stamkoncentration: 10 mM) og blandes grundigt.
  3. Forbered membranbelagte plader i kælderen som beskrevet nedenfor:
    1. Optø et hætteglas med kældermembran natten over i køleskabet eller på en isboks.
    2. Fortynd kældermembranen med en passende mængde Dulbeccos modificerede Eagle's medium/Ham's F12 (DMEM/F12). Da hvert parti kældermembran har en forskellig koncentration, skal du beregne den mængde DMEM / F12, der er nødvendig for at nå en 1 mg / 1 ml fortynding. Der fremstilles 0,5 eller 1 ml alikvoter til opbevaring ved -20 °C.
      BEMÆRK: Trin 1.3.2 skal udføres på is inde i en flowhætte.
    3. Optø 0,5 ml alikvoten af kældermembranen og fortynd den med 6 ml DMEM/F12. Bland grundigt.
    4. Overtræk pladen ved at pipettere 250 μL fortyndet kældermembran/brønd i en plade med 24 brønde. Beregn baseret på overfladearealet af hver brønd for forskellige pladeformater, for eksempel 1 ml / brønd i en 6-brøndplade.
    5. Pladen inkuberes i 1 time i en inkubator på 37 °C.
  4. Forbered Fura-2 AM-alikvoter ved at opløse Fura-2 AM i dimethylsulfoxid (DMSO) i henhold til producentens manual til fremstilling af 1 mM alikvoter. De delvise prøver opbevares ved -20 °C.

2. Dyrkning af hiPSC-CM'er

  1. Optø et hætteglas med hiPSC-CM'er i et 37 °C vandbad. Overfør hætteglassets optøede indhold til et 15 ml glas. Tilsæt 10 ml af pletteringsmediet dråbevis til cellerne.
  2. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 100 × g.
  3. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml forpletteringsmedium. Pipet forsigtigt op og ned for at resuspendere pelleten og fjerne eventuelle celleklumper.
  4. Brug et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller til at tælle antallet af celler.
  5. Fjern kældermembranen fra den inkuberede plade og erstat den med pletteringsmediet.
  6. Plade cellerne med en passende celletæthed på en 6/12/24/48/96-brøndplade belagt med kældermembran (f.eks. 250.000 celler / brønd i en 24-brøndplade).
    BEMÆRK: For Ca2+ forbigående eksperimenter skal cellerne plades på glasbundsplader.
  7. Udskift mediet med hiPSC-CM dyrkningsmediet næste dag, og opdater derefter mediet hver anden dag med 0,5 ml/hul i en plade med 24 huller.
  8. Udfør kontraktilitetsmålingerne, når hiPSC-CM'erne er kommet sig efter optøning og genplettering (3-5 dage efter genplettering i denne protokol).
    BEMÆRK: I tilfælde af ujævn cellebelægning er det muligt, at en gruppe celler ikke er i kontakt med resten af de genbelagte celler og kan vise et uregelmæssigt eller ikke-synkroniseret slagmønster. For at undgå asynkroni anbefales det at have en jævn fordeling af celler og et synkroniseret godt forbundet monolag af hiPSC-CM'er i hver brønd.

3. Måling af kontraktilitet

  1. Tænd for det optikbaserede målesystem, mikroskoplysdiode (LED) lyskilde og computer (se materialetabel).
  2. Åbn programmet, og åbn en ny fil. Under Filer øverst til venstre på skærmen skal du klikke på Ny.
  3. Klik på Indsaml, vælg Eksperimenter, og vælg derefter "iPSC + Calcium".
  4. Tænd for klimaanlægget. Indstil temperaturen til 37 °C og CO2 -niveauet til 5%.
  5. Udskift hiPSC-CM dyrkningsmediet med Tyrode-opløsning (0,5 ml/hul i en plade med 24 huller). Sæt pladelåget på igen med klimakontrollåget.
    BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt at udføre transiente calciummålinger, fyldes cellerne med Fura-2 AM som beskrevet i afsnit 4.
  6. Pladen anbringes inde i det optikbaserede målesystem, når klimaanlægget viser, at temperaturen er 37 °C.
    BEMÆRK: Sammentrækning måles ved hjælp af brightfield-forhold.
  7. Klik på Åbn cellefinder under værktøjslinjen, og vent på, at en ny skærm dukker op. Vælg pladeformatet og feltet øverst til højre på skærmen.
  8. Vælg en brønd, vælg et område i brønden for at observere synkroniseret sammentrækning og afslapning, Tryk på starten, klik på Tilføj måling. Vælg varigheden af målingerne i indstillingerne (10 s pr. Område). Kassér asynkroniserede sammentrækningsmålinger med det samme, og vælg et nyt område.
    BEMÆRK: Kontraktilitetstransienterne i realtid kan ses på skærmen. For synkroniserede sammentrækninger observeres en glat kontinuerlig transient, mens der for asynkroniserede sammentrækninger observeres små ekstra toppe.
  9. Mål flere områder i brønden afhængigt af brøndens størrelse. For eksempel, for at følge denne undersøgelse, måle 10 områder pr. Brønd i en 24-brønds plade. Hvis der kun er behov for baselinemålinger, og der ikke er nogen plan om at teste nogen forbindelse, skal du fortsætte fra trin 3.13.
  10. Når områderne i en brønd er målt, skal du trykke på komplet og åbne det optikbaserede måleinstrument for at tilføje stressoren/forbindelsen til brønden (f.eks. 500 nM ISO, opløst i tyrod).
  11. Vælg inkubationstiden afhængigt af forbindelsen af interesse (2 min med ISO i denne protokol).
  12. Klik på automatisk måling for at lade det optikbaserede måleinstrument udføre målinger i de samme områder, hvor baselinemålingerne blev udført, hvilket resulterer i parrede målinger i brønden.
  13. Tryk på fuldfør , når alle målinger i brønden er udført.
  14. Vælg det næste felt øverst til højre på skærmen.
  15. Fortsæt målingerne for alle de nødvendige brønde.
  16. Klik på stop , når alle de nødvendige brønde er målt, og gem filen.
    BEMÆRK: Klimakontrollen bruges til at opretholde stabil CO2. Dette gør det muligt at måle effekten af forbindelser/stressorer på hiPSC-CM'er på en højhastighedsmåde.

4. Transiente calciummålinger

  1. Forbered 37 °C Tyrode-opløsning.
  2. Fura-2 AM-alikvoterne opløses i Tyrode-opløsningen, således at der tilsættes en slutkoncentration på 1 μM Fura-2 AM til cellerne.
    BEMÆRK: Når du bruger Fura-2 AM, skal du sørge for, at lysene i flowhætten er slukket for at minimere lyseksponering.
  3. Opsug mediet og erstat det med Tyrode-opløsning indeholdende Fura-2 AM.
  4. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 °C i en inkubator eller i det optikbaserede målesystem.
  5. Fjern Tyrode-opløsningen, der indeholder Fura-2 AM, og vask derefter 2x med frisk Tyrode-opløsning. Til sidst inkuberes cellerne i Tyrode-opløsningen i yderligere 5 minutter ved 37 °C for at muliggøre deesterificering af Fura-2 AM.
  6. Pladen anbringes inde i det optikbaserede målesystem, og målingerne påbegyndes som beskrevet i punkt 3.
    BEMÆRK: I trin 4.6. Ved at starte målingerne samtidig med sammentrækningsmålingerne registreres en ratiometrisk calciumtransient: excitation ved 340 nm og 385 nm i et 100 μm spot; emission indsamlet ved 510 ± 40 nm. Ud over kontraktilitetssporene vises realtidsratiometriske calciumtransienter på skærmen.

5. Analyse af data

  1. Hvis du vil analysere dataene, skal du klikke på CytoSolver på skrivebordet.
  2. Klik på import, og vælg den eller de filer, der skal analyseres.
  3. Når programmet har udført analysen, skal du observere de accepterede (blå) og afviste (røde) transienter, der vises på skærmen (figur 1A).
    BEMÆRK: Her blev følgende standardafvisningskriterier, defineret ved signal/støjforhold (SNR) og tilpasningsgrad (R2), anvendt: R 2 > 0,9 og SNR > 4 for kontraktionstransienter og R2 > 0,5 og SNR > 3 for calciumtransienter. Disse afvisningskriterier kan justeres af brugeren afhængigt af kvaliteten af målingerne, cellernes kvalitet og det primære resultat for forskeren. For eksempel, hvis forskerens interesse hovedsageligt er afslapningskinetik, kan kriterierne sænkes for tiden til topvariabler. Hvis der opnås meget stærke calciumtransienter, skal SNR muligvis øges for at udelukke data, der er mere støjende.
  4. Klik på eksport, og marker for de gennemsnitlige forbigående data. Undersøg de analyserede data, der præsenteres i et regneark.
  5. Sluk computeren og alle de andre instrumenter.

Representative Results

Efter denne protokol blev målinger af kontraktilitet, Ca2+ transienter og respons på en forbindelse i hiPSC-CM'er udført. Ved at bruge dette optikbaserede målesystem kunne hiPSC-CM'er simpelthen genbelægges på de krævede plader, og kontraktilitetsmålingerne kunne udføres. Kontraktilitet måles i et interesseområde på 100 μm x 100 μm ved 250 billeder pr. sekund ved at beregne pixelkorrelationen i forhold til en referenceramme. Referencerammen registreres automatisk af systemet ved enddiastolen. Samtidig med sammentrækningsmålingerne registreres en ratiometrisk calciumtransient.

I denne undersøgelse blev tre forskellige differentieringsrunder anvendt som tre biologiske replikater. For hver batch af differentiering blev tre brønde målt som tekniske replikater. Denne undersøgelse blev udført ved hjælp af 24-brøndplader, og 10 områder inden for hver brønd blev målt. Efter målingerne blev CytoSolver-programmet brugt til straks at analysere dataene. Følgende parametre blev rapporteret: hvilefrekvensen, TP. Con og TB. Con80 af kontrol-hiPSC-CM'erne (figur 2A-C). For at visualisere variabiliteten af data for hver nævnt parameter præsenteres målingerne inden for hver brønd og gennemsnitsværdierne for tre brønde for hver differentieringsrunde som superplots10. For bedre at evaluere variabiliteten af data for hver differentieringsrunde og mellem de tre runder blev varianskoefficienten (figur 2D) for hver parameter beregnet. Som vist i figur 2D ligger værdierne af tekniske replikater svarende til en biologisk replikat inden for et meget tæt interval i forhold til hinanden (dvs. lav varianskoefficient), hvilket illustrerer denne metodes robusthed.

Denne applikation er meget velegnet til at teste lægemiddeleffekter. Her blev effekten af 500 nM ISO, en ikke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, på kontraktiliteten af kontrol-hiPSC-CM'er testet. Denne forbindelse er kendt for at øge hjertefrekvensen og udøve en positiv lusitropisk effekt. Som vist i figur 3A øgede ISO slagfrekvensen i alle brønde betydeligt. ISO øgede også kinetikken, hvilket fremgår af et fald i TP. Con og TB. Con80 (figur 3B, C). Samlet set blev slagfrekvensen ved inkubation med ISO signifikant øget i alle brønde sammen med en reduktion i sammentræknings- og afslapningstiden, hvilket indikerede, at det forventede respons på denne forbindelse blev registreret af denne platform.

Parallelt med kontraktilitetsmålinger blev calciummålinger også udført. På samme måde som kontraktilitetsdata (figur 2) er hiPSC-CM'ers calciummåledata vist i figur 4. TB.Ca80 er betydeligt langsommere end i isolerede kardiomyocytter hos rotter eller mus, hvilket delvis forklares af arter og hjertefrekvensforskelle11 samt af den umodne calciumhåndtering i hiPSC-CM'er på grund af lavere calciumdynamik i det sarkoplasmatiske retikulum og lavere ekspression af calciumhåndteringsproteiner sammenlignet med primære celler12. I lighed med kontraktilitetsdata blev varianskoefficienten for calciummålinger beregnet og viser lav variabilitet inden for de tekniske og biologiske replikater (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Øjeblikkelig brug af CytoSolver-transientanalyseværktøjet efter eksperimentet til at analysere dataene. (A) Et eksempel på de accepterede transienter (alle i blåt) af et område målt i en brønd. Panel A1 viser de kontraktile transienter. Panel A2 repræsenterer calciumtransienterne. B) Gennemsnitlig kontraktilitetstransient opnået ved målinger i tre brønde af en differentieringsrunde. Fra hver enkelt eller gennemsnitlig transient, data fra forskellige tidspunkter til peak (TP. Con) og tid til baseline (TB. Con) af kontraktiliteten forbigående kunne ekstraheres. Da den nøjagtige start af sammentrækningen ikke altid kan bestemmes entydigt, tages tid til top 20% som udgangspunkt for målinger af tid til top. På samme måde er det vanskeligt at vurdere det nøjagtige tidspunkt, hvor signalet vender tilbage til basislinjen. Derfor bruges tid til baseline 80% til at beskrive afslapningstiden. Her TP. Con (tid til peak - tid til peak 20%) og TB. Con80 (tid til baseline 80% - tid til peak) anvendes. C) Gennemsnitlige calciumtransiente data opnået ved målinger i tre huller i en differentieringsrunde. Fra hver enkelt eller gennemsnitlig calciumtransient kunne data fra forskellige tidspunkter for tid til top (TP.Ca) og tid til baseline (TB.Ca) for calciumtransienter ekstraheres. For tid til topmålinger er udgangspunktet tid til top 20%, og for tid til baseline er slutpunktet tid til baseline 80%. I denne undersøgelse anvendes TP.Ca (tid til spidsbelastning - tid til top 20%) og TB.Ca 80 (tid til baseline 80% - tid til top). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Baseline kontraktilitetsmålinger udført på tre forskellige differentieringsrunder. Tre biologiske replikater og tre brønde for hver differentieringsrunde (dvs. tre tekniske replikater). Tre hovedsymboler for hver differentieringsrunde repræsenterer gennemsnitsværdien af de målte områder (baggrundssymbolerne i falmede farver) inden for hvert felt. Data vises som gennemsnit ± SEM. Data vedrørende hvileslagfrekvens er repræsenteret i Hertz og for TP. Con og TB. Con80, dataene er på få sekunder. (A) Hvileslagfrekvens. (B) Tid til spidsbelastning (TP. Ulempe). (C) Tid til baseline 80% (TB. Con80). (D) For at vurdere variationen mellem de data, der blev opnået i hver runde og mellem alle tre differentieringsrunder, blev varianskoefficientprocenten beregnet ved hjælp af gennemsnitsværdierne for hver brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kontraktilitetsmålinger ved baseline (-) og efter inkubation med ISO (+) på tre huller fra tre differentieringsrunder. A) Hvileslagfrekvensen (-) og slagfrekvensen efter inkubation med 500 nM ISO (+). (B) Tid til spidsbelastning (TP. Con) målinger ved baseline og efter inkubation med ISO. (C) Tid til baseline 80% (TB. Con80) målinger ved baseline og efter inkubation med ISO. For at evaluere effekten af ISO på kontraktilitetsparametrene blev der udført en tovejs Anova med Bonferroni-korrektion. Data vises som gennemsnit ± SEM. Data vedrørende hvileslagfrekvens er repræsenteret i Hertz og for TP. Con og TB. Con80, dataene er repræsenteret i sekunder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Baseline calcium transiente målinger udført på tre huller fra tre differentieringsrunder . (A) Tid til peak (TP.Ca) og (B) tid til baseline 80% (TB.Ca80) af calciumtransienter. Data vises som gennemsnit ± SEM. TP.Ca ogTB.Ca 80 data er repræsenteret i sekunder. (C) For at vurdere variationen mellem de data, der blev opnået i hver runde og mellem alle tre differentieringsrunder, blev varianskoefficientprocenten beregnet ved hjælp af gennemsnitsværdien af hver brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

I denne undersøgelse beskrives en metode til at udføre kontraktilitets- og calciumtransiente målinger på hiPSC-CM'er og undersøge effekten af stressorer / lægemidler på disse celler. Kontraktilitetsmålinger, ratiometriske calciummålinger og responsen på ISO blev udført på tre forskellige differentieringsrunder som biologiske replikater. For hver biologisk replikat blev der udført målinger på tre brønde, da de tekniske replikaterer. Årsagen til at udføre målingerne på denne måde var at sikre, at den biologiske variabilitet og den tekniske variabilitet af prøven og platformen kunne evalueres. Bortset fra at overveje det passende antal biologiske og tekniske replikater, kan hiPSC-CM-dyrkningstilstanden spille en vigtig rolle for at opnå konstante og robuste resultater. Det er vigtigt at være i overensstemmelse med kriterier, såsom alderen på hiPSC-CM'er, sammensætning af medium, genbelægningsbetingelser og sammensat inkubationstid under målinger. I denne undersøgelse tog det i gennemsnit 568 ± 24 s at måle 11 områder to gange i 10 s i en brønd. Dette inkluderer en ISO-inkubationstid på 79 ± 11 s. Dette kommer ned på ca. 10 minutter pr. Brønd, hvilket skulle gøre det muligt for forskere at måle en fuld 24-brøndplade i ~ 4 timer. Klimakontrollen bruges til at opretholde stabil CO2. Dette gør det muligt at måle effekten af forbindelser/stressorer på hiPSC-CM'er på en højhastighedsmåde.

For at måle kontraktilfunktionen af iPSC-CM'er er der flere eksisterende systemer, der er afhængige af optogenetik13 eller etiketfri videobaseret mikroskopi 5,6. Optogenetiske systemer er ret komplekse og kræver særlige teknikker til at opnå enten elektrofysiske og / eller kontraktilitetsdata. Andre systemer er afhængige af post-hoc-analyse af videoer, hvilket kræver meget lagerplads og mangler direkte feedback under videooptagelse. Desuden er det vanskeligt at opnå tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning, hvilket kan resultere i undersampling. Ligeledes kan CRISPR/CAS-9-redigerede hiPSC-CM'er med fluorescerende reportere7 introducere uønskede virkninger på kardiomyocytadfærd. Brugen af fluorescerende farvestoffer til kontraktionsafslapningsmålinger er også en elegant tilgang, men begrænser udførelsen af eksperimenter på den samme prøve over en længere periode14.

Denne optikbaserede måleplatform kunne dog bruges til måling af sammentræknings-afslapningstider uden brug af fluorescerende farvestof eller invasive metoder. Da pixelkorrelation imidlertid ikke giver geografisk information, kan denne metode ikke bruges til at måle styrken af sammentrækning, men kan kun pålideligt registrere ændringer i hastigheden af sammentrækning og afslapning. Det indførte målesystem er temperaturstyret og kan indsamle calcium- og kontraktilitetsdata i realtid med en opløsning på >200 billeder pr. Sekund. Derudover gemmes placeringen af hver måling, hvilket muliggør parrede målinger og derved øger eksperimenternes effekt. Desuden giver denne platform forskere mulighed for at gemme data og analysere dem øjeblikkeligt efter eksperimentet. Samlet set viser dette optikbaserede målesystem sig at være en lovende metode til at studere cellulære patomekanismer, kan evaluere effekten af forbindelser på funktionaliteten af hiPSC-CM'er og kan være nyttigt med den prækliniske proces i lægemiddelscreening.

Disclosures

EM er ansat hos CytoCypher BV. MH er administrerende direktør for CytoCypher BV. De resterende forfattere erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskning er delvist finansieret af Eurostars-bevillingen Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) og NWO-VICI grant 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

Biologi nr. 195

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Realtidsmålinger af calcium- og kontraktilitetsparametre i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter