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Biology

Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio l'isolamento delle cripte del colon murino per lo sviluppo di colonoidi tridimensionali. I colonoidi stabiliti possono quindi essere differenziati terminalmente per riflettere la composizione cellulare dell'epitelio ospite prima di ricevere una sfida infiammatoria o di essere diretti a stabilire un monostrato epiteliale.

Abstract

L'epitelio intestinale svolge un ruolo essenziale nella salute umana, fornendo una barriera tra l'ospite e l'ambiente esterno. Questo strato cellulare altamente dinamico fornisce la prima linea di difesa tra popolazioni microbiche e immunitarie e aiuta a modulare la risposta immunitaria intestinale. La rottura della barriera epiteliale è un segno distintivo della malattia infiammatoria intestinale (IBD) ed è di interesse per il targeting terapeutico. Il sistema di coltura di colonoidi tridimensionali è un modello in vitro estremamente utile per lo studio della dinamica delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali nella patogenesi delle IBD. Idealmente, stabilire colonoidi dal tessuto epiteliale infiammato degli animali sarebbe più utile per valutare le influenze genetiche e molecolari sulla malattia. Tuttavia, abbiamo dimostrato che i cambiamenti epiteliali in vivo non sono necessariamente mantenuti nei colonoidi stabiliti da topi con infiammazione acuta. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un protocollo per trattare i colonoidi con un cocktail di mediatori infiammatori che sono tipicamente elevati durante l'IBD. Mentre questo sistema può essere applicato ovunque a varie condizioni di coltura, questo protocollo enfatizza il trattamento sia su colonoidi differenziati che su monostrati 2-dimensionali derivati da colonoidi stabiliti. In un ambiente di coltura tradizionale, i colonoidi sono arricchiti con cellule staminali intestinali, fornendo un ambiente ideale per studiare la nicchia delle cellule staminali. Tuttavia, questo sistema non consente un'analisi delle caratteristiche della fisiologia intestinale, come la funzione di barriera. Inoltre, i colonoidi tradizionali non offrono l'opportunità di studiare la risposta cellulare delle cellule epiteliali terminalmente differenziate agli stimoli proinfiammatori. I metodi qui presentati forniscono un quadro sperimentale alternativo per affrontare queste limitazioni. Il sistema di coltura monostrato 2-dimensionale offre anche un'opportunità per lo screening terapeutico dei farmaci ex vivo. Questo strato polarizzato di cellule può essere trattato con mediatori infiammatori sul lato basale della cellula e in concomitanza con terapie putative apicalmente per determinare la loro utilità nel trattamento dell'IBD.

Introduction

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica, remittente e recidivante caratterizzata da episodi di infiammazione e quiescenza clinica. L'eziologia dell'IBD è multifattoriale, ma le caratteristiche chiave della malattia includono la funzione barriera difettosa e l'aumento della permeabilità dell'epitelio intestinale, oltre alle cascate di segnalazione proinfiammatoria attivate all'interno del compartimento epiteliale 1,2. Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati utilizzati per ricapitolare la risposta epiteliale durante l'IBD, compresi i modelli di coltura cellulare e murino di infiammazione3. Tuttavia, tutti questi sistemi hanno importanti carenze che limitano la loro capacità di ricapitolare i cambiamenti epiteliali durante IBD4. La maggior parte delle linee cellulari utilizzate per studiare l'IBD sono trasformate, hanno la capacità di formare un monostrato e possono differenziare3 ma propagarsi intrinsecamente in modo diverso rispetto alle cellule epiteliali intestinali non trasformate nell'ospite. Diversi modelli murini di infiammazione sono utilizzati per studiare IBD, alcuni dei quali includono modelli knockout, modelli infettivi, modelli infiammatori chimici e modelli di trasferimento delle cellule T 5,6,7,8. Mentre ognuno può studiare alcuni aspetti eziologici dell'IBD, come le predisposizioni genetiche, la disfunzione della barriera, la deregolazione immunitaria e il microbioma, sono limitati nella loro capacità di studiare la natura multifattoriale della malattia.

Gli organoidi intestinali, inclusi enteroidi e colonoidi, sono stati affermati nell'ultimo decennio come un utile modello in vitro per studiare non solo la dinamica delle cellule staminali intestinali, ma anche il loro ruolo che l'integrità della barriera e la funzione dell'epitelio intestinale svolgono nell'omeostasi e nella malattia intestinale. Queste entità hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della patogenesi di IBD9 e hanno aperto nuove opportunità per la medicina personalizzata. I colonoidi, o colture tissutali auto-organizzanti derivate da cellule staminali dal colon, sono stati sviluppati sia da tessuto murino che umano in un processo che consente alle cellule staminali situate all'interno delle cripte intestinali di propagarsi e mantenersi indefinitamente10. La nicchia delle cellule staminali in vivo si basa su fattori extracellulari per sostenere la sua crescita, in particolare le vie canoniche di segnalazione Wnt e di segnalazione delle proteine morfogeniche ossee11. L'aggiunta di questi fattori promuove la salute e la longevità dei colonoidi, ma spinge anche la coltura verso uno stato simile alle cellule staminali che non riflette l'architettura cellulare epiteliale in vivo, che consiste sia di cellule auto-rinnovanti che di cellule terminalmente differenziate12,13. Mentre la funzionalità dell'epitelio intestinale dipende dalla continua diafonia tra il compartimento delle cellule staminali e le cellule differenziate, la capacità di avere entrambi in un sistema di coltura di colonoidi è piuttosto limitata. Nonostante queste limitazioni, il sistema di coltura organoide rimane il gold standard per studiare le proprietà intrinseche dell'epitelio ex vivo. Tuttavia, potrebbe essere necessario prendere in considerazione strategie culturali alternative per rispondere alla domanda scientifica in questione.

È stato dimostrato che i topi con un regime continuo di 7 giorni di destrano solfato di sodio (DSS) sviluppano sia infiammazione epiteliale che disfunzione barriera14. Inoltre, il fallimento della biogenesi mitocondriale e la riprogrammazione metabolica all'interno dell'epitelio intestinale, che hanno dimostrato di essere evidenti nell'IBD umana, sono stati catturati anche in questo modello DSS di colite15. Tuttavia, i nostri dati preliminari dimostrano che le caratteristiche del fallimento della biogenesi mitocondriale non sono mantenute nei colonoidi derivati dalle cripte di animali trattati con DSS (Figura supplementare 1). Pertanto, i metodi di coltura alternativi devono essere utilizzati quando si esamina come l'infiammazione guida i cambiamenti epiteliali durante l'infiammazione intestinale murina. Qui, delineiamo un protocollo che abbiamo sviluppato che descrive 1) come isolare le cripte dall'intero tessuto del colon per la creazione di colonoidi murini, 2) come differenziare terminalmente questa popolazione cellulare per riflettere la popolazione cellulare così com'è in vivo e 3) come indurre l'infiammazione in questo modello in vitro . Per studiare le interazioni farmacologiche all'interno dell'epitelio infiammato, abbiamo sviluppato un protocollo per stabilire monostrati 2-dimensionali (2D) da colonoidi murini che possono essere trattati basalmente con mediatori infiammatori e trattati apicamente con terapie farmacologiche.

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Protocol

Tutte le sperimentazioni che utilizzano tessuti murini qui descritti sono state approvate dall'Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh e condotte in conformità con le linee guida stabilite dall'Animal Research and Care Committee dell'Università di Pittsburgh e da UPMC.

1. Preparazione alla cultura

NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella sezione Tabella dei materiali e tutte le composizioni della soluzione sono disponibili nella tabella di composizione della soluzione (Tabella 1).

  1. Preparare il mezzo di lavaggio del topo come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
  2. Preparare il buffer di isolamento della cripta 1 (CIB1) come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
    ATTENZIONE: Il ditiotreitolo (DTT) è considerato pericoloso dallo standard di comunicazione dei pericoli OSHA a causa della potenziale tossicità acuta se ingerito e dei danni alla pelle e agli occhi se tali aree sono esposte ad esso. Guanti protettivi, protezione per gli occhi e protezione per il viso devono essere utilizzati quando si maneggia questa sostanza chimica.
  3. Preparare il buffer di isolamento della cripta 2 (CIB2) come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
  4. Preparare il mezzo condizionato da L-WRN secondo un protocollo16 precedentemente pubblicato.
  5. Preparare il mezzo completo per i colonoidi come descritto nella Tabella 1. Il terreno di coltura completo per colonoidi può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
  6. Preparare il mezzo di differenziazione come descritto nella tabella 1. Questo protocollo è stato modificato da un documento precedentemente pubblicato17. Il mezzo di differenziazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
  7. Preparare il mezzo mediatore dell'infiammazione come descritto nella Tabella 1. Questo protocollo è stato modificato da un documento precedentemente pubblicato18. Il mezzo mediatore dell'infiammazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
  8. Preparare il mezzo monostrato murino. Omettere Y-27632 quando si sfidano i monostrati con fattori infiammatori e/o farmaci. Il mezzo monostrato murino può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
  9. Preparare il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione. Il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.

2. Isolamento della cripta dal tessuto del colon murino

NOTA: Trasferire il tessuto sul ghiaccio. Prelevare la quantità appropriata di matrice della membrana basale dallo stoccaggio di -20 ° C e scongelare sul ghiaccio. Ogni pozzetto da 24 è placcato con 15 μL di matrice a membrana basale. Preparare CIB1, CIB2 e il terreno di coltura completo per i colonidi come descritto nel paragrafo 1.

  1. Eutanasia di un topo C57BL/6J (6-8 settimane) secondo il protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee ed estrarre l'estremità distale (circa 5-7 cm) del colon usando pinzette e forbici pulite.
    NOTA: In questo studio, i soggetti sono stati eutanizzati usando l'incubazione della camera di anidride carbonica per 2-3 minuti seguita da lussazione cervicale.
    1. Per questo, posizionare il mouse sul dorso, fare un'incisione orizzontale appena sotto la gabbia toracica e poi un'incisione verticale dal centro dell'incisione orizzontale verso la base della coda per esporre la cavità addominale.
    2. Con una pinzetta, sposta l'intestino tenue fuori dal campo, identifica il colon e seguilo fino alla base della coda. Rompere il bacino con le forbici per esporre completamente il colon distale, se necessario. Usa le forbici per tagliare i 5-7 cm più distali del colon.
  2. Posizionare il tessuto del colon su una superficie pulita. Rimuovere il grasso sieroso in eccesso che circonda il colon. Rimuovere la materia fecale lavando il contenuto luminale del colon con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) utilizzando una siringa attaccata a un ago da 18 G 1 1/2. Quindi, posizionare il colon in un tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di DPBS ghiacciato e posizionarlo sul ghiaccio.
    NOTA: Se si isolano i due punti da più di un animale, posizionare il tessuto sul ghiaccio prima di passare all'animale successivo.
  3. Trasferire il tessuto del colon in una capsula di Petri con 10 ml di DPBS ghiacciato e irrigare il lume due volte con DPBS utilizzando una pipetta P1.000.
  4. Aprire il colon longitudinalmente usando le forbici e agitare delicatamente con una pinzetta per ~ 30 s nel DPBS per rimuovere eventuali contenuti fecali rimanenti.
  5. Trasferire il tessuto in una nuova capsula di Petri con 10 ml di DPBS ghiacciato e di nuovo agitare delicatamente con una pinzetta prima di tagliare il colon in pezzi di 2 cm usando le forbici e metterli in un tubo conico da 50 ml con 7 ml di CIB1 ghiacciato. Incubare il tessuto in CIB1 su ghiaccio per 20 minuti.
    NOTA: I passaggi rimanenti vengono eseguiti all'interno di un armadio di sicurezza biologica.
  6. Trasferire il tessuto con una pinzetta in un tubo conico preriscaldato da 50 mL contenente 7 mL di CIB2 e incubare a bagnomaria a 37°C per 5 minuti.
  7. Rimuovere CIB2 dal tubo conico da 50 mL lasciando che il tessuto si depositi sul fondo del tubo conico e quindi pipettando il CIB2. Quindi, aggiungere 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato allo stesso tubo conico.
  8. Procurarsi un nuovo tubo conico da 50 mL e posizionare un filtro da 70 μm sopra il tubo aperto.
  9. Mentre si tiene il tubo con il contenuto del colon, ruotare la mano di circa 45°. Scuotere il tubo in modo oscillante e vigoroso per 45 secondi per liberare le cripte. Quindi, versare la sospensione della cripta attraverso il filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico da 50 ml.
  10. Utilizzando una pinzetta, riposizionare il tessuto del colon nel tubo conico vuoto da 50 ml e aggiungere 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Procurarsi un nuovo filtro cellulare da 70 μm e posizionarlo sopra il tubo conico da 50 mL contenente la soluzione filtrata precedente.
  11. Di nuovo, prendere il tubo da 50 ml contenente i frammenti della cripta e agitarlo in modo identico a quello del punto 2.9. Filtrare il mezzo attraverso il filtro cellulare da 70 μm nel tubo conico da 50 mL per combinarlo con le cripte precedentemente filtrate.
    NOTA: Se la resa della cripta è bassa, agitare il tessuto del colon un'altra volta posizionando il tessuto in un tubo conico vuoto da 50 ml con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo. Agitare il tessuto per 45-50 s per rilasciare le cripte. Inoltre, se la resa della cripta è bassa, aumentare il vigore dello scuotimento. Infine, se la resa complessiva della cripta è bassa, sia i pipetti che i tubi possono essere rivestiti con siero bovino fetale (FBS) per impedire l'aderenza del tessuto alla plastica.
  12. Centrifugare il tubo conico da 50 mL contenente le cripte filtrate a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
    NOTA: Un pellet deve essere osservato sul fondo del tubo conico da 50 ml.
  13. Decantare il mezzo mediante pipettaggio, risospendere le cripte mediante pipettaggio su e giù con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato e trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
  14. Per ottenere una preparazione più pulita, lavare le cripte con altri 10 ml di mezzo di lavaggio del mouse. Decantare il mezzo precedente e risospendere le cripte pipettando su e giù in 10 ml di mezzo di lavaggio del topo. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4°C utilizzando un tubo conico da 15 mL.
    NOTA: È necessario prestare attenzione quando si esegue il pipettaggio del fluido perché, a volte, il pellet non viene centrifugato ermeticamente. Se il pellet non è stretto, pipettare la maggior parte del mezzo, lasciando 500 μL a 1 mL. Quindi, risospendere il pellet mediante pipettaggio in 10 ml di mezzo di lavaggio del topo e trasferire la soluzione in un tubo conico da 15 ml. La centrifugazione in un tubo conico più piccolo può migliorare la tenuta del pellet.
  15. Decantare il mezzo e risospendere le cripte pipettando su e giù con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Una volta risospese, contare le cripte al microscopio a campo chiaro pipettando immediatamente 10 μL del mezzo su un vetrino.
    1. Posizionare due gocce da 10 μL su estremità separate del vetrino e contare il numero di cripte in ciascuna goccia. Calcola la media dei numeri tra le due gocce per determinare il numero di cripte per 10 μL. Moltiplica questo numero per 100 per ottenere il numero di cripte in 1 ml.
      NOTA: Per un conteggio accurato, 10 μL della sospensione della cripta devono essere immediatamente rimossi dopo la risospensione. In caso contrario, le cripte cadranno sul fondo del tubo, il che comporterà un conteggio impreciso.
  16. Con l'obiettivo di placcare 300-500 cripte per pozzetto, trasferire il volume appropriato di cripte risospese nel mezzo di lavaggio del topo in un nuovo tubo conico da 15 ml e portare a 10 ml con mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti a 4°C. Un piccolo pellet dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
  17. Rimuovere il surnatante con una pipetta di potenza. Utilizzare un pipettuccio P200 per rimuovere con cura qualsiasi mezzo residuo, lasciando solo il pellet.
  18. Risospendere il pellet nella quantità appropriata di matrice di membrana basale ghiacciata pipettando lentamente su e giù. Fare attenzione a non introdurre bolle quando si risospende il pellet della cripta. Piastra 300-500 cripte / 15 μL di matrice di membrana basale in ciascun pozzetto di una piastra. Dopo la placcatura, capovolgere la piastra di coltura tissutale e metterla in un'incubatrice a 37°C per 10-20 minuti.
  19. Invertire la piastra e aggiungere 500 μL del mezzo completo del colonoide di topo a ciascun pozzetto. Cambia il mezzo a giorni alterni fino a quando non sono pronti per il passaggio. Passare i colonidi ogni 3-5 giorni.

3. Passare i colonoidi

NOTA: Ogni pozzo può generalmente essere fatto passare da 1:4 a 1:6 in base alla densità del pozzo originale. Prelevare la quantità appropriata di matrice della membrana basale da -20°C e metterla sul ghiaccio per scongelarla. I colonoidi possono essere utilizzati per esperimenti dopo due passaggi. Quando si passano i coloidi, i passaggi vengono eseguiti in un armadio di sicurezza biologica per prevenire la contaminazione.

  1. Rimuovere il mezzo dai pozzetti da far passare.
    1. Se ci sono detriti all'interno della matrice della membrana basale, che può verificarsi durante l'isolamento iniziale, è possibile utilizzare il seguente protocollo per ripulire i detriti:
      1. Aggiungere 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) ghiacciata allo 0,1% in DPBS senza Ca 2+ o Mg2+ a ciascun pozzetto. Lasciare riposare per 5 minuti nell'armadietto di sicurezza biologica.
      2. Pipettare su e giù da tre a sette volte utilizzando una pipetta P1000 per interrompere la matrice della membrana basale e raccogliere il contenuto dei pozzetti in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare i colonoidi in un totale di 5-10 ml di BSA allo 0,1% in DPBS senza Ca 2+ o Mg2+. Portare al volume appropriato con lo 0,1% BSA.
      3. Centrifugare a 150 x g per 5 minuti a 4°C per pellettare i colonoidi ma non i detriti.
      4. Decantare il DPBS mediante pipettaggio, lasciando il pellet. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione enzimatica a temperatura ambiente (RT) e pipettare da tre a cinque volte.
      5. Posizionare il tubo conico da 15 mL con il reagente di dissociazione enzimatica e i colonoidi interrotti in un bagnomaria a 37°C per 3-4 minuti.
      6. Rimuovere il tubo dal bagnomaria, pipettare 3-5 volte, quindi portare a 10 ml con il mezzo di lavaggio del mouse. Procedere al passaggio 3.6.
  2. Posizionare 500 μL di reagente di dissociazione enzimatica RT in ciascun pozzetto e lasciarlo riposare per circa 1 minuto prima di pipettare su e giù da tre a sette volte per interrompere la matrice della membrana basale.
  3. Posizionare la piastra in un incubatore a 37°C per 3-4 minuti.
  4. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e pipettare su e giù da tre a sette volte usando una pipetta P1000 per dissociare i colonoidi.
  5. Trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 mL e portare a 10 mL con un mezzo di lavaggio del topo ghiacciato.
  6. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
  7. Rimuovere il fluido utilizzando una pipetta di potenza e una pipetta P200 secondo necessità, in modo che nel tubo conico rimanga solo un pellet.
  8. Risospendere in una quantità appropriata di matrice di membrana basale ghiacciata pipettando delicatamente su e giù in base a quanti pozzetti devono essere placcati. Non introdurre bolle durante il pipettaggio. Posizionare i frammenti di colonoide in 15 μL di gocce di matrice della membrana basale per pozzetto.
  9. Placcare le cripte, capovolgere la piastra di coltura tissutale, quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 ° C per 10-20 minuti.
  10. Infine, invertire la piastra e aggiungere 500 μL di mezzo colonoide di topo completo a ciascun pozzetto. Cambiare il terreno a giorni alterni fino a quando non sono diventati abbastanza grandi da essere fatti passare di nuovo in circa 3-5 giorni.

4. Differenziazione terminale delle cellule colonoidi

  1. Far passare i colonoidi come sopra e aggiungere 500 μL del mezzo completo del colonoide di topo a ciascun pozzetto.
  2. Almeno 48 ore dopo il passaggio, rimuovere il mezzo colonoide di topo completo e aggiungere 500 μL del mezzo di differenziazione a ciascun pozzetto (vedere paragrafo 1).
  3. Incubare i colonoidi con mezzi di differenziazione per 48 ore, dopo di che possono essere utilizzati in esperimenti, compresa la raccolta di RNA e proteine.
    NOTA: I colonoidi possono essere valutati per la differenziazione raccogliendo RNA e valutando l'espressione di Lgr5 e Ki67, un marcatore di cellule staminali e un marcatore di proliferazione cellulare, rispettivamente, tramite la reazione a catena quantitativa trascrittasi-polimerasi inversa (qPCR). Le cellule terminalmente differenziate dovrebbero avere un'espressione relativamente bassa di Lgr5 e Ki67 rispetto ai colonoidi coltivati nel mezzo colonoide tradizionale, dove le cellule sono più simili a staminali. La durata del tempo che i colonoidi devono incubare nel mezzo di differenziazione potrebbe dover essere ottimizzata per ogni singolo laboratorio. Fare riferimento alla Tabella supplementare 1 per l'elenco dei primer.

5. Indurre l'infiammazione nei colonoidi differenziati con mediatori infiammatori

  1. Dopo che i colonoidi sono stati incubati per 2-3 giorni con il mezzo di differenziazione, rimuovere il mezzo esistente e aggiungere 500 μL del mezzo mediatore dell'infiammazione a ciascun pozzetto.
  2. Lasciare incubare i pozzetti per 24-72 ore prima di raccogliere l'RNA e la proteina (o valutare altri parametri a valle). Cambia il mezzo ogni giorno.

6. Monostrati epiteliali intestinali derivati da colonoidi murini stabiliti

NOTA: I monostrati epiteliali intestinali murini derivano da colonoidi murini che sono stati fatti passare almeno due volte. Per consentire una formazione monostrato di successo in 3-5 giorni, è imperativo non separare i colonoidi in singole cellule. Gli organoidi frammentati che sono stati dissociati enzimaticamente in cluster cellulari sono ideali per la crescita.

  1. Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l'esperimento. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio. Preparare il mezzo monostrato murino come descritto al paragrafo 1 . Diluire la membrana basale scongelata 1:20 con il mezzo monostrato murino freddo. Mantenere il ghiaccio.
  2. Utilizzare una pinza sterile per posizionare un inserto di coltura cellulare trasparente da 0,4 μm in un singolo pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (Tabella dei materiali). Prendi una punta angolare dell'inserto e trasferiscila nel pozzo. Ripetere l'operazione fino a quando non è disponibile il numero appropriato di inserti di coltura cellulare per la coltura.
    NOTA: Assicurarsi di rivestire un pozzetto di controllo aggiuntivo solo con la matrice della membrana basale . Questo inserto per coltura cellulare sarà utilizzato per misurare la resistenza di fondo dell'inserto di coltura cellulare senza cellule presenti, come descritto nella fase successiva (fase 6.3).
  3. Utilizzando un pipetta P200, coprire la superficie apicale (superiore) di ciascun inserto di coltura cellulare con 150 μL di matrice di membrana basale diluita. Posizionare la punta del pipet al centro dell'inserto senza toccare la membrana dell'inserto ed espellere delicatamente la soluzione. Porre la piastra in un incubatore sterile a 37°C con il 5% di CO2 per almeno 1 ora.
  4. Rimuovere delicatamente la matrice della membrana basale prima dell'uso e lasciare asciugare gli inserti di coltura cellulare in un armadio di sicurezza biologica per un minimo di 10 minuti.
    1. Per rimuovere la matrice della membrana basale, ruotare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45°. Posizionare un solo dito sull'angolo della punta per stabilizzare l'inserto e, utilizzando un pipet P200, posizionare delicatamente la punta del pipet lungo il lato inferiore dell'inserto e rimuovere la matrice.
    2. Rimuovere qualsiasi residuo in eccesso lavando ogni inserto di coltura cellulare con 150 μL di DPBS sterile senza Ca 2+ o Mg2+.
  5. Dopo 10 minuti di essiccazione, aggiungere 400 μL di mezzo monostrato murino sul fondo dell'inserto di coltura cellulare e 75 μL sulla parte superiore. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono immersi. Lasciare la piastra nell'armadio di sicurezza biologica o rimetterla nell'incubatore fino al momento del bisogno.
  6. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti di colonoidi intestinali maturi (organoidi il giorno 3-5 della crescita) dall'incubatore a 37°C, 5% di CO2 e posizionarla sotto l'armadio di sicurezza biologica. Rimuovere il terreno con punte sterili e lavare bene ogni pozzetto con 1 mL di DPBS sterile RT (senza Ca 2+ o Mg2+).
    NOTA: Un singolo pozzetto di 75-125 colonoidi maturi è diviso in un rapporto di 1:4.
  7. Rimuovere il DPBS senza Ca 2+ o Mg2+ utilizzando punte sterili e digerire ogni tappo della matrice della membrana basale posizionando 500 μL di reagente di dissociazione enzimatica RT in ciascun pozzetto da far passare.
  8. Pipet ogni pozzetto su e giù circa 6-10 volte per rompere la spina. Non graffiare il fondo della piastra per rimuovere la spina. Ruotare invece la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45°, posizionare la punta del pipet sul bordo della spina e spostarla delicatamente.
  9. Riporre la piastra a 24 pozzetti in un incubatore sterile a 37°C, 5% CO2 per 3-4 minuti.
  10. Rimuovere la piastra e incanalare il reagente di dissociazione enzimatica su e giù da cinque a sette volte per ciascun pozzetto sotto un armadio di sicurezza biologica. Trasferire i colonoidi dissociati da ciascun pozzetto in un tubo conico sterile da 15 ml. Portare fino a un volume di 10 ml con un mezzo di lavaggio del mouse ghiacciato.
  11. Centrifugare i colonoidi parzialmente digeriti a 300 x g a 4°C per 5 minuti in una centrifuga a secchio oscillante.
  12. Sotto l'armadio di sicurezza biologica, rimuovere il surnatante dal pellet utilizzando un pipet da 10 ml. Rimuovere qualsiasi supporto rimanente utilizzando un pipet P200. Risospendere il pellet colonoide in mezzo monostrato murino. Aggiungere 75 μL di terreno per ogni inserto di coltura cellulare di colonoidi frammentati da placcare.
  13. Aggiungere 75 μL di sospensione di colonoide al centro di ciascun inserto di coltura cellulare. Prima di aggiungere la sospensione di colonoide a ciascun pozzetto, sollevare e scendere delicatamente una o due volte prima di rimuovere i 75 μL, che consentono una placcatura più uniforme.
  14. Posizionare la piastra a 24 pozzetti con inserti di coltura cellulare su una piattaforma rotante per 10 minuti per consentire ulteriormente una dispersione uniforme attraverso l'inserto di coltura cellulare.
  15. Posizionare la piastra in un incubatore sterile a 37°C, 5% CO2 .
  16. Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere i frammenti di colonoide non attaccati pipettando il mezzo su e giù da tre a cinque volte con un pipet P200. Posizionare delicatamente la punta accanto all'interno dell'inserto di coltura cellulare per non interrompere le cellule intestinali attaccate. Non introdurre bolle nel mezzo, in quanto ciò impedisce la rimozione di tutti i frammenti non attaccati.
  17. Rimuovere immediatamente la miscela di mezzo e colonide. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono stati puliti.
  18. Aggiungere delicatamente 150 μL di mezzo monostrato murino preriscaldato sul lato apicale di ciascun inserto di coltura cellulare. Aggiungere 400 μL di mezzo monostrato murino riscaldato a ciascun pozzetto di una nuova piastra a 24 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare sulla nuova piastra afferrando la sua punta usando una pinza sterile. Cambiare il mezzo a giorni alterni fino alla confluenza.
    NOTA: I frammenti di colonoide dovrebbero formare un monostrato confluente 3-5 giorni dopo la placcatura.

7. Misurazione della resistenza netta dei monostrati epiteliali utilizzando un voltohmmetro nei giorni 3 - 5 di coltura monostrato

NOTA: Gli elettrodi delle bacchette assomigliano a una pinza e sono di lunghezza asimmetrica. Il braccio più lungo della sonda è l'elettrodo basolaterale e il braccio più corto è l'elettrodo apicale. La sonda può essere difficile da inserire tra l'interno e l'esterno dell'inserto di coltura cellulare. Posizionare la sonda con una leggera angolazione al momento dell'inserimento, seguito dal raddrizzamento verticale della sonda, eviterà che la sonda si blocchi. Assicurati di leggere la resistenza netta di ciascun inserto di coltura cellulare con un'angolazione simile, poiché ciò può influire sui valori.

  1. Posizionare il voltohmmetro e tutti i reagenti all'interno di un armadio di sicurezza biologica.
    1. Collegare il voltohmmetro alla presa CA più vicina e collegare il connettore modulare in plastica della sonda dell'elettrodo nel jack INPUT sul display anteriore.
    2. Per posizionare il voltohmmetro con un angolo di 45°, ruotare il braccio metallico sul retro dell'apparecchiatura fino a quando non si blocca in posizione.
    3. Ora, accendi il voltohmmetro capovolgendo l'interruttore di alimentazione UP sul display anteriore. Infine, ruota l'interruttore verso l'alto verso OHMS per visualizzare la lettura in questa metrica.
  2. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti dall'incubatore a 37°C, 5% di CO2 e posare la piastra piatta nell'armadio di sicurezza biologica. La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) è sensibile alla temperatura. Rimuovere la piastra solo immediatamente prima che il TEER venga letto.
  3. Sterilizzare la sonda dell'elettrodo in etanolo preriscaldato al 70% per 30 s a 1 min. Rimuovere la sonda, capovolgerla e sfiorarla una o due volte per rimuovere l'etanolo in eccesso. Lasciare asciugare la sonda all'aria per circa 30 secondi.
  4. Lavare l'etanolo residuo rimasto sulla sonda con un mezzo di lavaggio del mouse preriscaldato.
    ATTENZIONE: Non lasciare che nessuna delle goccioline di etanolo rimanenti più in alto sulla sonda cada nell'inserto della coltura cellulare. Quando si lava via l'etanolo con il mezzo, non lasciare che il mezzo vada sopra il campo di etanolo sterile. Ciò potrebbe causare l'ingresso di terreno contaminato nell'inserto della coltura cellulare.
  5. Tenere la sonda perpendicolare all'inserto della coltura cellulare. Inserire l'elettrodo basolaterale (estremità più lunga della sonda) all'esterno dell'inserto di coltura cellulare fino a quando non tocca la base della piastra a 24 pozzetti. Far scorrere l'elettrodo apicale (estremità più corta della sonda) nell'inserto della coltura cellulare. Non variare la distanza dei due elettrodi da pozzo a pozzo. Ciò avrà un impatto sulla misurazione TEER.
  6. Verificare che l'elettrodo apicale non tocchi la base dell'inserto di coltura cellulare prima di leggere il TEER. Iniziare con l'inserto per colture cellulari di controllo in background e registrare il valore. Il valore verrà visualizzato automaticamente digitalmente sulla parte anteriore del voltohmmetro.
  7. Ripetere i passaggi 7.5-7.6 per ogni inserto di coltura cellulare.
    NOTA: Se esistono diverse condizioni sperimentali tra gli inserti di coltura cellulare, sterilizzare la sonda tra ogni nuova condizione. Iniziare dal passaggio 7.1 e procedere numericamente attraverso i passaggi.
  8. Riposizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore una volta registrate tutte le misurazioni TEER.
  9. I valori netti a 350 Ω o superiori sono indicativi della formazione di monostrati. Ripetere nuovamente nei giorni successivi fino al raggiungimento della formazione del monostrato.
    NOTA: Generalmente, valori di 1.000 Ω o superiori possono essere acquisiti il giorno 3, ma nel tempo convergeranno tutti su un numero inferiore intorno a 350 Ω.

8. Calcolo del TEER utilizzando le misure di resistenza netta dal voltohmmetro

NOTA: La riuscita formazione monostrato dei colonoidi darà misure TEER superiori a 115 Ω·cm2.

  1. Prendi i singoli valori di resistenza netta e sottrai bene la resistenza netta dallo sfondo. Gli inserti di coltura cellulare rivestiti con la membrana della matrice basale daranno una lettura netta di circa 100 Ω.
  2. Prendi le misurazioni della resistenza netta sottratta dallo sfondo e moltiplicale per la superficie dell'inserto di coltura cellulare. Un inserto per coltura cellulare a 24 pozzetti ha una superficie di 0,33 cm2.
  3. Se i valori sono pari o superiori a 115 Ω cm2 , procedere alle prove sperimentali a valle.

9. Indurre l'infiammazione nei monostrati epiteliali con mediatori infiammatori

  1. Una volta che si sono formati monostrati di successo, aggiungere mediatori infiammatori alla coltura sul lato basale della coltura. Preparare il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione, come descritto al punto 1.9, e aggiungere 400 μL a ciascun pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti.
  2. Rimuovere il mezzo dal lato apicale dell'inserto di coltura cellulare e aggiungere 150 μL del mezzo monostrato murino senza Y-27632. Non integrare questo lato con mediatori infiammatori. Tuttavia, se la morte cellulare sembra eccessiva, lasciare l'Y-27632 nei media. Questo deve essere determinato dall'utente finale.
  3. Trasferire gli inserti di coltura cellulare in una nuova piastra a 24 pozzetti e posizionarli nei pozzetti integrati con il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione.
  4. Stimolare i monostrati con mediatori infiammatori per 24-72 ore, a seconda dell'esperimento.
  5. Per testare le risposte ai farmaci utilizzando questo modello infiammatorio, integrare il mezzo monostrato sul lato apicale dell'inserto di coltura cellulare con il farmaco di scelta. Il farmaco può essere aggiunto in qualsiasi momento dell'esperimento, a seconda del meccanismo d'azione del farmaco e dei parametri a valle da valutare.

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Representative Results

Il sistema di coltura di colonoidi intestinali 3D è uno strumento prezioso per studiare il contributo intrinseco dell'epitelio all'omeostasi della mucosa intestinale. Il protocollo descritto fornisce istruzioni dettagliate su come isolare le cripte dai topi C57BL / 6J (WT) a 8 settimane di età e stabilire un sistema di coltura di colonoidi a lungo termine che può essere manipolato per più applicazioni a valle. Dopo l'isolamento e la placcatura delle cripte nella matrice della membrana basale, le cripte appaiono dense e multicellulari nella struttura quando visualizzate dalla microscopia a campo chiaro. Possono essere di forma sferica o allungati e cilindrici, simili alla singola struttura simile a una cripta che viene normalmente osservata all'interno dell'architettura intestinale in vivo (Figura 1A). Entro il giorno 1, la maggior parte delle cripte forma una struttura compatta e sferica, con alcuni colonoidi che iniziano a sviluppare un lume interno (spazio vuoto) privo di cellule epiteliali (Figura 1B). Mentre continuano a crescere nei prossimi giorni, i diametri dei colonoidi continuano ad aumentare e i lumi dei colonoidi diventano più definiti (Figura 1C). Entro il giorno 5, ogni colonoide ha un diametro di circa 100-250 μm, formando un grande lume prominente circondato da un sottile strato di cellule staminali epiteliali (Figura 1D). A questo punto, i colonoidi sono sia enzimaticamente che meccanicamente interrotti per il passaggio. Dopo due passaggi, possono essere utilizzati per la sperimentazione a valle.

Per valutare se i cambiamenti metabolici osservati nei raschiamenti del colon dei topi trattati con DSS sono mantenuti nei colonoidi derivati da topi sullo stesso regime DSS, topi WT di 8 settimane sono stati trattati con DSS al 2% in acqua potabile ad libitum. Agli animali di controllo WT di età e genere è stata somministrata acqua potabile ad libitum senza DSS. Dopo 7 giorni, i topi sono stati sacrificati e le cripte sono state isolate dai due punti sia degli animali di controllo (n = 3, maschio) che di quelli trattati con DSS (n = 3, maschio) per stabilire i colonoidi. Dopo due passaggi, la proteina è stata isolata da ciascun set di colonoidi e l'espressione del perossisoma proliferatore-attivatore del recettore-gamma-1α (PGC1α), la proteina regolatrice principale della biogenesi mitocondriale, è stata valutata tramite l'analisi western blot (Figura supplementare 1). Non c'è stata alcuna differenza significativa nell'espressione di PGC1α quando si confrontano i colonoidi stabiliti dai topi trattati con DSS rispetto ai colonoidi stabiliti dai topi di controllo, suggerendo che questa metodologia di coltura dei colonoidi non riflette adeguatamente i cambiamenti metabolici in vivo osservati nei topi15.

Il fallimento di PGC1α nell'avviare la biogenesi mitocondriale durante un insulto infiammatorio intestinale è principalmente localizzato nell'epitelio differenziato del colon15,19. Per rispecchiare i cambiamenti osservati in vivo, abbiamo deciso di dirigere i colonoidi verso uno stato più differenziato. Per indurre questo cambiamento, i colonoidi sono stati inizialmente incubati con mezzo colonoide tradizionale. Dopo 24 ore a 48 ore, i colonidi sono stati passati al mezzo di differenziazione per ulteriori 48 ore. Durante la differenziazione, una piccola percentuale di colonoidi è passata da un'architettura sferica a strutture gemmate arricchite con cellule caliciformi e colonciti17 (Figura 2A,B). I colonoidi coltivati in terreno integrato con WRN sono stati arricchiti con cellule staminali Lgr5+ a rapida divisione. Per confermare che sia le cellule staminali Lgr5+ che altre cellule proliferanti sono uscite dal ciclo cellulare durante la differenziazione, i livelli di mRNA sono stati analizzati tramite qPCR. Una significativa downregulation sia nei livelli di Lgr5 (97%, p = 0,0023) che Ki67 (75%, p = 0,0007) è stata osservata nei colonoidi differenziati (n = 6) rispetto ai colonoidi coltivati in un ambiente di coltura tradizionale (n = 6; Figura supplementare 2A,B). Ci si aspetterebbe anche che i colonoidi differenziati siano costituiti principalmente da cellule caliciformi che secernono muco. Inoltre, infatti, MUC2 era sovraregolato quasi due volte nei colonoidi differenziati rispetto alle loro controparti tradizionalmente coltivate (n = 3, p = 0,0433, Figura supplementare 3). Se presi insieme, questi dati suggeriscono che i colonidi sono stati differenziati con successo ed erano pronti per la sperimentazione a valle. Successivamente, i mediatori infiammatori sono stati aggiunti al mezzo di differenziazione, come descritto nella sezione 5 del protocollo. Proteine e RNA sono stati raccolti fino a 72 ore dopo l'introduzione dei mediatori infiammatori per l'analisi. Tuttavia, a 72 ore, è stato occasionalmente osservato un aumento della morte cellulare.

Per valutare se l'introduzione di mediatori infiammatori nei colonoidi differenziati potesse imitare il fallimento della biogenesi mitocondriale osservato sia nell'IBD umana che in un modello acuto di colite murina, l'espressione proteica di PGC1α e del fattore di trascrizione A, mitocondri (TFAM) è stata valutata tramite analisi western blot in colonoidi differenziati (n = 5) trattati con mediatori infiammatori oltre 72 ore. È stato dimostrato che l'espressione di PGC1α è diminuita nei modelli murini di colite, così come nell'IBD umana15. TFAM, una proteina che guida sia la trascrizione che la replicazione del genoma mitocondriale, ha anche dimostrato di essere diminuita nei modelli murini di colite, e la sua espressione genica ha dimostrato di essere diminuita in IBD umana15,20. Abbiamo osservato una downregulation simile sia nell'espressione di PGC1α (50,4%, p = 0,0442) che di TFAM (88,9%, p = 0,004) nei colonoidi differenziati dopo 72 ore di esposizione a questi mediatori infiammatori (Figura 3). Collettivamente, questo suggerisce che il trattamento dei colonoidi differenziati con citochine è un modello ideale per studiare le dinamiche mitocondriali in vitro.

Mentre varie funzioni cellulari e molecolari possono essere esaminate in contesti di coltura di colonidi 3D, i sistemi di coltura monostrato 2D sono superiori quando si valuta la funzione di barriera, le interazioni ospite-patogeno e l'impatto delle terapie assorbite per via orale sull'infiammazione21,22. La formazione di uno strato continuo di cellule confluenti con una barriera intatta consente di posizionare facilmente diversi agenti biologici o chimici sul lato apicale e/o basale delle cellule. Questo protocollo consente di stabilire colture monostrato 2D da colonoidi WT preesistenti che sono stati fatti passare due volte. I colonoidi che sono stati interrotti enzimaticamente e meccanicamente sono placcati su inserti di coltura cellulare rivestiti con matrice di membrana basale. Dopo la placcatura iniziale, i colonoidi frammentati appaiono in cluster cellulari che vanno da 15 a 150 cellule (Figura 4A). Entro il giorno 3, le cellule hanno iniziato ad appiattirsi e coprono lentamente l'inserto della coltura cellulare, raggiungendo generalmente la confluenza (Figura 4B). Nei prossimi due giorni, i monostrati continuano a crescere e formano una barriera continua che può essere misurata quantitativamente da TEER (Figura 4C, D). È interessante notare che le misurazioni TEER fluttuano dal giorno 3 al giorno 5. I monostrati hanno valori più elevati in precedenza con un ampio intervallo (200-800 Ω cm 2), ma questi valori convergono lentamente su un numero inferiore entro il giorno 5 (115-150 Ω cm2, figura 5A). Quando i monostrati raggiungono uno stato stazionario, possono essere utilizzati per la sperimentazione a valle.

Per caratterizzare la risposta epiteliale dei monostrati derivati dai colonoidi all'infiammazione, i mediatori infiammatori sono stati posizionati sul lato basale (l'esterno dell'inserto) delle cellule per 48 ore. L'RNA è stato estratto e i livelli di mRNA di vari marcatori di differenziazione di staminali e cellule, nonché proteine giunzionali, sono stati analizzati tramite qPCR. Lgr5 non è stato rilevato in nessuna delle due condizioni, ma un altro marcatore di cellule staminali, mTERT, è stato ridotto di quasi il 60% nei monostrati infiammati rispetto al controllo non trattato (Figura supplementare 4A). Successivamente, abbiamo analizzato l'espressione di due marcatori di tipi cellulari differenziati, Muc2 e fosfatasi alcalina (Alpi). Entrambi i trascritti di mRNA erano più bassi nei monostrati infiammati rispetto alle cellule di controllo (Figura supplementare 4A). Sia le cellule staminali che quelle post-mitotiche sono comunemente diminuite durante l'infiammazione del colon23,24,25, e una risposta simile è stata osservata nel modello monostrato ottenuto in questo studio.

Un vantaggio del sistema monostrato è la capacità di valutare la risposta della barriera. Per determinare se la barriera era compromessa nella condizione immunostimolata, abbiamo misurato i valori TEER dopo 48 ore. I valori TEER per i monostrati di controllo (n = 2) erano in media 129,16 Ω cm 2, ma sono diminuiti significativamente (p = 0,0087) ad una media di 98,54 Ω cm2 nei monostrati infiammati (figura 5B). Per confermare ulteriormente che la barriera era compromessa nella condizione infiammatoria, abbiamo valutato i livelli di mRNA per tre diversi marcatori di giunzione stretta, Zo-1, Occludina e Claudiona. Tutti e tre i marcatori avevano livelli ridotti nella condizione infiammata rispetto alle loro controparti non infiammate (Figura supplementare 4B). Collettivamente, questi dati mostrano che la disfunzione barriera è presente nei monostrati infiammati e imita la disfunzione della barriera osservata durante la patogenesi dell'IBD.

Figure 1
Figura 1: Isolamento iniziale delle cripte murine per la creazione di colture di colonoidi a lungo termine. (A) Il giorno 0, 300-500 cripte sono state placcate in matrice di membrana basale (immagine ottenuta 5 ore dopo la placcatura), e la crescita dei colonoidi è stata catturata il (B) giorno 1, (C) giorno 3 e (D) giorno 5. Il giorno 5, i colonoidi erano pronti per essere trasferiti. Ingrandimento = 10x; Barra di scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Istituzione di colonoidi terminalmente differenziati dalla coltura tradizionale dei colonidi. Il mezzo di differenziazione è stato posto sui colonoidi 48 ore dopo aver passato i colonoidi murini. Dopo (A) 24 h e (B) 48 h, i colonoidi si arricchiscono di cellule terminalmente differenziate. Ingrandimento = 10x; Barra di scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Espressione delle proteine PGC1α e TFAM in colonoidi differenziati murini trattati con mediatori infiammatori. Il mezzo integrato con mediatori infiammatori è stato posizionato sui colonoidi differenziati e la proteina è stata raccolta 0 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'esposizione. (A) L'espressione proteica di PGC1α ha mostrato una diminuzione complessiva significativa (p = 0,0442) nell'arco di 72 ore. Il TFAM è stato significativamente sottoregolato (p = 0,004) dopo l'esposizione ai mediatori infiammatori a 72 ore, e (B) c'è stata una tendenza al ribasso nell'espressione proteica a 24 ore, 48 ore e 72 ore quando analizzato da ANOVA. Dati presentati come media ± deviazione standard. *p < 0,05, **p < 0,005. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Costituzione e crescita di monostrati da colonoidi preesistenti. I colonoidi che erano stati interrotti enzimaticamente e meccanicamente sono stati placcati su inserti di coltura cellulare rivestiti con una matrice di membrana basale. Dopo la placcatura iniziale, i colonoidi frammentati apparvero in (A) cluster cellulari e, entro il giorno 3 (B), avevano iniziato ad appiattirsi e a coprire lentamente l'inserto della coltura cellulare. (C) Al giorno 5 e (D) al giorno 7, i monostrati hanno continuato a crescere fino a formare una barriera continua che poteva essere misurata quantitativamente da TEER. Ingrandimento = 10x; Barra di scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Valori TEER per stabilire monostrati derivati da colonoidi e monostrati infiammati. (A) I valori TEER sono stati misurati utilizzando un voltohmmetro dal giorno 3 al giorno 5. I monostrati avevano valori più alti in precedenza con un ampio intervallo, ma lentamente convergevano su un numero inferiore entro il giorno 5. Una volta che i monostrati raggiungono uno stato stazionario, possono essere utilizzati per la sperimentazione a valle. (B) I valori TEER erano inferiori nei monostrati infiammati (n = 2) rispetto ai controlli non infiammati (n = 2). I monostrati di controllo avevano un TEER medio di 129,16 ohm ·cm 2, e il TEER dei monostrati infiammati era significativamente inferiore (p = 0,0087), con una media di 98,54 Ω·cm2, quando analizzato usando un t-test. **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Tabella di composizione della soluzione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare 1: Espressione della proteina PGC1α in colonoidi murini cresciuti in terreno colonoide tradizionale isolato da controlli WT e topi trattati con DSS al 2%. I colonoidi sono stati derivati sia da topi di controllo WT di 8 settimane che da topi trattati con DSS al 2% dopo 7 giorni. La proteina è stata isolata dai colonoidi passati due volte e il giorno 4 dopo la placcatura. Non c'era differenza nell'espressione della proteina PGC1α (p = 0,9996) nei colonoidi derivati dai topi di controllo rispetto ai topi esposti al 2% di DSS per 7 giorni quando analizzati da un t-test spaiato. Dati presentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Ridotta espressione dell'mRNA Lgr5 e Ki67 in colonoidi differenziati. I colonoidi murini transitati 48 ore prima sono stati esposti al mezzo di differenziazione per 48 ore prima di isolare la sintesi di RNA e cDNA. I livelli di mRNA sono stati determinati tramite qPCR e analizzati con il metodo CT comparativo. (A) Lgr5 e (B) Ki67 erano significativamente diminuiti nei colonoidi differenziati quando analizzati statisticamente usando un t-test (p = 0,0023, p = 0,0007). Dati presentati come media ± deviazione standard.**p < 0,005. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Aumento delle cellule caliciformi secernenti mucina in colonoidi murini differenziati. I colonoidi murini passati 48 ore prima sono stati esposti al mezzo di differenziazione per 48 ore. Le cellule sono state lisate nel tampone RIPA e la proteina è stata visualizzata mediante analisi western blot. (A) L'espressione di MUC2 è aumentata in ciascun set di colonoidi differenziati rispetto ai colonoidi indifferenziati. (B) Un cambiamento quasi doppio nella proteina MUC2 è stato osservato nelle condizioni differenzianti, che è stato significativo quando analizzato utilizzando un t-test (p = 0,0433). Dati presentati come media ± deviazione standard. *p < 0,05. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Ridotta espressione dei marcatori staminali e di differenziazione, nonché marcatori giunzionali stretti, in monostrati trattati con mediatori infiammatori. Monostrati murini derivati da colonoidi (Giorno 5) sono stati esposti a mediatori infiammatori per 48 ore, l'RNA è stato successivamente raccolto e il cDNA è stato sintetizzato (n = 2). I livelli di mRNA di marcatori staminali, differenziati e giunzionali sono stati determinati tramite qPCR e analizzati con il metodo CT comparativo. (A) Il marcatore delle cellule staminali, Lgr5, non è stato rilevato in nessuna delle due condizioni, ma mTERT è stato sostanzialmente ridotto in condizioni infiammatorie. Il marcatore delle cellule caliciformi, Muc2, e il marcatore dei colonociti, Alpi, erano entrambi diminuiti nei monostrati infiammati rispetto ai monostrati non trattati. (B) I marcatori di giunzione stretti, Zo-1, Occludina e Claudiona, erano tutti più bassi nei monostrati trattati con infiammazione rispetto al controllo. Dati presentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Elenco dei primer. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Lo sviluppo di organoidi ha rivoluzionato il modo in cui la comunità scientifica studia i sistemi di organi in vitro con la capacità di ricapitolare parzialmente la struttura e la funzione cellulare di un animale o di un essere umano in un piatto. Inoltre, i sistemi organoidi derivati da esseri umani con malattie offrono uno strumento promettente per la medicina personalizzata che potrebbe guidare il processo decisionale terapeutico. Qui, descriviamo un protocollo di isolamento della cripta che funziona bene e introduce passaggi chiave che consentono di ripulire i detriti in eccesso nell'isolamento prima della placcatura. Inoltre, spieghiamo un dettaglio chiave che viene spesso trascurato nel processo: la capacità di contare con precisione le cripte per la placcatura. Una volta stabiliti i colonoidi, delineiamo le manipolazioni chiave che consentono la loro differenziazione cellulare o la formazione di monostrati, che potrebbero migliorare la capacità di studiare i cambiamenti nell'epitelio intestinale durante l'IBD.

L'asse crypt-villus nell'epitelio del colon nei mammiferi è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule con funzioni diverse. Il mantenimento di questo asse dipende da fattori cellulari sia intrinseci che estrinseci, che insieme aiutano a mantenere l'omeostasi epiteliale18. Abbiamo notato che i colonoidi murini coltivati in terreno tradizionale riflettono principalmente le cellule staminali in contrasto con il conglomerato di cellule staminali e cellule terminalmente differenziate che si vede in vivo. Inoltre, i colonoidi murini cresciuti e mantenuti in questo modo sono strutture circolari al contrario dei monostrati piatti. Queste differenze hanno potenziali implicazioni per i nostri tentativi di studiare la malattia intestinale in vitro. In particolare, siamo limitati nella nostra capacità di utilizzare organoidi per studiare i cambiamenti nella funzione di barriera, così come gli effetti dell'infiammazione sulle cellule epiteliali intestinali terminalmente differenziate.

Qui, descriviamo protocolli non solo per l'isolamento delle cripte murine per far crescere i colonoidi, ma anche per la manipolazione di questi colonoidi per studiare la fisiologia epiteliale intestinale e la risposta epiteliale all'infiammazione. Tra i diversi fattori estrinseci che promuovono il gradiente delle cellule staminali pluripotenti e delle cellule differenziate terminalmente c'è il percorso canonico Wnt, che è ricco di cripte e promuove la salute delle cellule staminali. La segnalazione Wnt diminuisce sulla punta dell'asse della cripta, in coincidenza con l'evoluzione delle cellule staminali in cellule terminalmente differenziate26. Abbiamo descritto un protocollo che consente la differenziazione terminale delle cellule colonoidi. Come altri, ci differenziamo rimuovendo Wnt dal terreno di crescita, ma usiamo una concentrazione inferiore di R-spondina (500 ng / mL contro 1 μg / mL R-spondina)17. Sorprendentemente, una riduzione del 50% della R-spondina non influisce sulla differenziazione di successo degli organoidi. La capacità di differenziarsi con una concentrazione inferiore aiuta a stabilire un sistema meno artificiale che potrebbe assomigliare più da vicino all'ambiente fisiologico in vivo. Sebbene questo protocollo si traduca in una differenziazione terminale finita (Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3) e nell'incapacità di mantenere l'immortalità cellulare, è comunque un metodo utile per comprendere meglio il contributo fisiologico dell'epitelio terminalmente differenziato, compresi i colonciti, le cellule enteroendocrine e le cellule caliciformi, alle IBD e ad altri stati patologici. Inoltre, dimostriamo che l'integrazione di citochine specifiche in questo mezzo, che sono tradizionalmente elevate nei pazienti con IBD, dirige il sistema organoide differenziato verso uno stato infiammatorio. Nel corso di 72 ore, i colonoidi differenziati trattati con citochine infiammatorie riflettono più da vicino alcuni dei risultati metabolici mostrati in altri modelli consolidati di colite e IBD umana (Figura 3). Inoltre, i colonoidi differenziati trattati in questo modo sono probabilmente più riflettenti degli effetti dell'infiammazione sull'omeostasi cellulare sull'epitelio differenziato. Abbiamo anche delineato un protocollo per lo sviluppo di monostrati, che consente la formazione di un lato apicale e basale dell'epitelio, consentendo un'analisi della funzione barriera in vivo. Questo sistema è utile per studiare i meccanismi di disfunzione della barriera senza necessità di differenziazione e coltivare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento.

Vanno notate diverse limitazioni e potenziali insidie per quanto riguarda i protocolli sopra descritti. Il successo dell'isolamento delle cripte e lo sviluppo dei colonoidi possono essere limitati dalla resa della cripta di ciascun animale, dall'accuratezza del conteggio delle cripte e dalla pulizia della preparazione. La velocità di conteggio delle cripte isolate dopo la risospensione, le variazioni nella dissociazione meccanica delle cripte dal muscolo sottostante e il numero di lavaggi e centrifughe contribuiscono al successo della coltura dei colonidi. Inoltre, è fondamentale non dissociare completamente gli organoidi in singole cellule durante il passaggio o la placcatura per la coltura monostrato 2D. Cluster da 30 a 50 cellule sono ideali per consentire alla coltura di propagarsi per una coltura a lungo termine. I protocolli di cui sopra rilevano aree di potenziali insidie e passaggi aggiuntivi facoltativi per risolvere questi problemi. In definitiva, il protocollo può richiedere l'ottimizzazione da parte dell'individuo che esegue l'isolamento a causa della variabilità intrinseca nel set di abilità e nelle manovre (cioè scuotimento), nonché la variazione in ciascun animale. Un'ulteriore ottimizzazione potrebbe essere richiesta dall'utente finale per catturare la diversità genetica e molecolare trovata nell'IBD.

In definitiva, mentre il sistema colonoide è uno strumento molto utile per ricapitolare aspetti chiave della fisiologia umana e della malattia in vivo, questo sistema è in definitiva limitato nella sua capacità di studiare tutti gli aspetti della malattia umana. I metodi tradizionali per lo sviluppo dei colonoidi hanno chiarito aspetti chiave della dinamica delle cellule staminali; Tuttavia, questi risultati spesso non riflettono adeguatamente i risultati nelle cellule terminalmente differenziate all'interno dell'epitelio ospite. Le strategie delineate in questo studio forniscono ai ricercatori un modello relativamente veloce e poco costoso per la manipolazione degli organoidi che, se impiegato correttamente, può far luce su aspetti chiave della struttura e della funzione epiteliale intestinale durante l'infiammazione.

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Disclosures

Gli autori che hanno contribuito non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R01DK120986 (a K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

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References

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Biologia Numero 196
Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale <em>in vitro</em> su colonoidi murini accertati
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Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

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