Studere epiteleffekter av tarmbetennelse in vitro på etablerte murinkolonoider

Summary

Vi beskriver en protokoll som beskriver isolering av murine kolonkrypter for utvikling av 3-dimensjonale kolonoider. De etablerte kolonoidene kan deretter terminalt differensieres for å reflektere den cellulære sammensetningen av vertsepitelet før de mottar en inflammatorisk utfordring eller blir rettet mot å etablere et epitelmonolag.

Abstract

Tarmepitelet spiller en viktig rolle i menneskers helse, og gir en barriere mellom verten og det ytre miljø. Dette svært dynamiske cellelaget gir den første forsvarslinjen mellom mikrobielle og immunpopulasjoner og bidrar til å modulere den intestinale immunresponsen. Forstyrrelse av epitelbarrieren er et kjennetegn på inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og er av interesse for terapeutisk målretting. Det 3-dimensjonale kolonoidkultursystemet er en ekstremt nyttig in vitro-modell for å studere intestinal stamcelledynamikk og epitelcellefysiologi i IBD-patogenese. Ideelt sett ville etablering av kolonoider fra betent epitelvev av dyr være mest fordelaktig for å vurdere de genetiske og molekylære påvirkningene på sykdom. Vi har imidlertid vist at in vivo epitelforandringer ikke nødvendigvis beholdes i kolonoider etablert fra mus med akutt inflammasjon. For å løse denne begrensningen har vi utviklet en protokoll for å behandle kolonoider med en cocktail av inflammatoriske mediatorer som vanligvis er forhøyet under IBD. Selv om dette systemet kan brukes allestedsnærværende til forskjellige kulturforhold, legger denne protokollen vekt på behandling på både differensierte kolonoider og 2-dimensjonale monolayers avledet fra etablerte kolonoider. I en tradisjonell kulturinnstilling er kolonoider beriket med intestinale stamceller, noe som gir et ideelt miljø for å studere stamcellenisjen. Dette systemet tillater imidlertid ikke en analyse av funksjonene i tarmfysiologi, for eksempel barrierefunksjon. Videre tilbyr tradisjonelle kolonoider ikke muligheten til å studere den cellulære responsen av terminalt differensierte epitelceller til proinflammatoriske stimuli. Metodene som presenteres her gir et alternativt eksperimentelt rammeverk for å løse disse begrensningene. Det 2-dimensjonale monolagskultursystemet gir også en mulighet for terapeutisk legemiddelscreening ex vivo. Dette polariserte lag av celler kan behandles med inflammatoriske mediatorer på basalsiden av cellen og samtidig med antatte terapeutiske midler apikalt for å bestemme deres nytte i IBD-behandling.

Introduction

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en kronisk, remitterende og tilbakevendende sykdom preget av episoder av betennelse og klinisk hvile. Etiologien til IBD er multifaktoriell, men viktige karakteristiske trekk ved sykdommen inkluderer defekt barrierefunksjon og økt permeabilitet i tarmepitelet, i tillegg til proinflammatoriske signalkaskader aktivert i epitelrommet ^1,2. Flere in vitro og in vivo modeller har blitt brukt til å rekapitulere epitelresponsen under IBD, inkludert cellekultur og murine modeller av betennelse³. Imidlertid har alle disse systemene viktige mangler som begrenser deres evne til å rekapitulere epitelendringene under IBD⁴. De fleste cellelinjer som brukes til å studere IBD er transformert, har evnen til å danne et monolag, og kan skille³, men forplantes egentlig annerledes enn ikke-transformerte tarmepitelceller i verten. Flere forskjellige murine modeller av betennelse brukes til å studere IBD, hvorav noen inkluderer knockout-modeller, smittsomme modeller, kjemiske inflammatoriske modeller og T-celleoverføringsmodeller 5,6,7,8. Mens hver kan studere visse etiologiske aspekter ved IBD, som genetiske predisposisjoner, barriere dysfunksjon, immunderegulering og mikrobiomet, er de begrenset i deres evne til å studere sykdommens multifaktorielle natur.

Intestinale organoider, inkludert enteroider og kolonoider, har blitt etablert i løpet av det siste tiåret som en nyttig in vitro-modell for å studere ikke bare dynamikken til intestinale stamceller, men også deres rolle, barrieren, integriteten og funksjonen til tarmepitelet spiller i intestinal homeostase og sykdom. Disse enhetene har bidratt betydelig til vår forståelse av patogenesen av IBD⁹ og har åpnet nye muligheter for personlig medisin. Kolonoider, eller stamcelleavledede, selvorganiserende vevskulturer fra tykktarmen, er utviklet fra både murine og humant vev i en prosess som gjør at stamceller lokalisert i tarmkrypter kan forplante seg og opprettholdes på ubestemt tid¹⁰. Stamcellenisjen in vivo er avhengig av ekstracellulære faktorer for å støtte veksten, spesielt den kanoniske Wnt-signaleringen og beinmorfogene proteinsignalveier¹¹. Tilsetningen av disse faktorene fremmer helsen og levetiden til kolonoider, men driver også kulturen mot en stamcellelignende tilstand som ikke reflekterer in vivo epitelial cellulær arkitektur, som består av både selvfornyende og terminalt differensierte celler^12,13. Mens funksjonaliteten til tarmepitelet er avhengig av den kontinuerlige crosstalken mellom stamcellerommet og differensierte celler, er evnen til å ha begge i et kolonoidkultursystem ganske begrenset. Til tross for disse begrensningene forblir det organoide kultursystemet gullstandarden for å studere epitelets inneboende egenskaper ex vivo. Likevel kan alternative kulturstrategier måtte vurderes for å svare på det vitenskapelige spørsmålet.

Det er vist at mus på et kontinuerlig 7-dagers regime med dekstrannatriumsulfat (DSS) utvikler både epitelinflammasjon og barrieredysfunksjon¹⁴. Videre har mitokondriell biogenesesvikt og metabolsk omprogrammering i tarmepitelet, som har vist seg å være tydelig i human IBD, også blitt fanget opp i denne DSS-modellen av kolitt¹⁵. Våre foreløpige data viser imidlertid at karakteristika ved mitokondriell biogenesesvikt ikke beholdes i kolonoider avledet fra kryptene til DSS-behandlede dyr (tilleggsfigur 1). Alternative dyrkningsmetoder må derfor brukes når man undersøker hvordan inflammasjon driver epitelforandringer under murine tarmbetennelse. Her skisserer vi en protokoll vi har utviklet som beskriver 1) hvordan man isolerer krypter fra hele kolonvev for etablering av murine kolonoider, 2) hvordan man terminalt differensierer denne cellepopulasjonen for å gjenspeile cellepopulasjonen som den står in vivo, og 3) hvordan man induserer betennelse i denne in vitro-modellen . For å studere legemiddelinteraksjoner i det betente epitelet, har vi utviklet en protokoll for å etablere 2-dimensonale (2D) monolayers fra murine colonoids som kan behandles basalt med inflammatoriske mediatorer og apikalt behandles med medikamentelle terapier.

Protocol

All eksperimentering med murinvev beskrevet her ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Pittsburgh og utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Animal Research and Care Committee ved University of Pittsburgh og UPMC.

1. Forberedelse til kultur

MERK: Alle reagensene er oppført i delen Materialfortegnelse , og alle løsningssammensetninger finnes i løsningssammensetningstabellen (tabell 1).

1. Klargjør musevaskmediet som beskrevet i tabell 1. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
2. Klargjør kryptisolasjonsbuffer 1 (CIB1) som beskrevet i tabell 1. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
   FORSIKTIG: Dithiothreitol (DTT) anses som farlig i henhold til OSHA Hazard Communication Standard på grunn av potensiell akutt toksisitet ved inntak og hud- og øyeskader hvis disse områdene blir utsatt for det. Vernehansker, øyevern og ansiktsbeskyttelse bør brukes ved håndtering av dette kjemikaliet.
3. Klargjør kryptisolasjonsbuffer 2 (CIB2) som beskrevet i tabell 1. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
4. Forbered L-WRN-betinget medium i henhold til en tidligere publisert protokoll¹⁶.
5. Klargjør komplett kolonoidmedium som beskrevet i tabell 1. Komplett vekstmedium for kolonoid kan oppbevares i opptil 5 dager ved 4 °C uten tap av aktivitet.
6. Klargjør differensieringsmediet som beskrevet i tabell 1. Denne protokollen ble endret fra en tidligere publisert artikkel¹⁷. Differensieringsmediet kan oppbevares i opptil 5 dager ved 4 °C uten tap av aktivitet.
7. Klargjør inflammasjonsmediatormediet som beskrevet i tabell 1. Denne protokollen ble endret fra en tidligere publisert artikkel¹⁸. Inflammasjonsmediatormediet kan oppbevares i opptil 5 dager ved 4 °C uten tap av aktivitet.
8. Forbered murine monolagsmediet. Utelat Y-27632 når du utfordrer monolagene med inflammatoriske faktorer og/eller legemiddel(er). Murine monolayer-mediet kan oppbevares i opptil 5 dager ved 4 °C uten tap av aktivitet.
9. Forbered betennelsesmediatoren monolagsmedium. Inflammasjonsmediatorens monolagsmedium kan oppbevares i opptil 5 dager ved 4 °C uten tap av aktivitet.

2. Kryptisolasjon fra murine kolonvev

MERK: Overfør vevet på is. Ta riktig mengde kjellermembranmatrise ut av -20 ° C lagring, og tine på is. Hver 24-brønn er belagt med 15 μL kjellermembranmatrise. Klargjør CIB1, CIB2 og komplett vekstmedium for kolonoider som beskrevet i avsnitt 1.

1. Avlive en C57BL/6J-mus (6-8 uker gammel) i henhold til protokollen godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee, og trekk ut den distale enden (ca. 5-7 cm) av tykktarmen ved hjelp av ren pinsett og saks.
   MERK: I denne studien ble fagene euthanized ved hjelp av karbondioksidkammerinkubasjon i 2-3 minutter etterfulgt av cervikal dislokasjon.
   1. For dette, plasser musen på ryggen, gjør et horisontalt snitt like under brystkassen og deretter et vertikalt snitt fra midten av det horisontale snittet mot bunnen av halen for å eksponere bukhulen.
   2. Med pinsett, flytt tynntarmen ut av feltet, identifiser tykktarmen, og følg den ned til bunnen av halen. Bryt bekkenet med saks for å fullstendig eksponere distal kolon om nødvendig. Bruk saksen til å klippe de mest distale 5-7 cm av tykktarmen.
2. Plasser kolonvevet på en ren overflate. Fjern overflødig serosalfett som omgir tykktarmen. Fjern avføringen ved å skylle luminalinnholdet i tykktarmen med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) ved hjelp av en sprøyte festet til en 18 G 1 1/2 nål. Deretter plasserer du tykktarmen i et 50 ml konisk rør som inneholder 10 ml iskald DPBS, og legg den på is.
   MERK: Hvis du isolerer tykktarmen fra mer enn ett dyr, legg vevet på is før du fortsetter til neste dyr.
3. Overfør kolonvevet til en petriskål med 10 ml iskald DPBS, og skyll lumen to ganger med DPBS ved hjelp av en P1000-pipette.
4. Åpne tykktarmen i lengderetningen ved hjelp av saks, og rist forsiktig med pinsett for ~ 30 s i DPBS for å fjerne gjenværende avføring.
5. Overfør vevet til en ny petriskål med 10 ml iskald DPBS, og rist igjen forsiktig med pinsett før du skjærer tykktarmen i 2 cm biter ved hjelp av saks og plasserer dem i et 50 ml konisk rør med 7 ml iskald CIB1. Inkuber vevet i CIB1 på is i 20 minutter.
   MERK: De resterende trinnene utføres inne i et biologisk sikkerhetsskap.
6. Overfør vevet med pinsett til et forvarmet 50 ml konisk rør inneholdende 7 ml CIB2, og inkuber i et vannbad ved 37 °C i 5 minutter.
7. Fjern CIB2 fra det koniske 50 ml røret ved å la vevet sette seg i bunnen av det koniske røret og deretter pipettere av CIB2. Tilsett deretter 10 ml iskaldt musevaskemedium til det samme koniske røret.
8. Skaff et nytt 50 ml konisk rør, og plasser et 70 μm filter på toppen av det åpne røret.
9. Mens du holder røret med koloninnholdet, roterer du hånden ca. 45°. Rist røret på en gyngende og kraftig måte i 45 s for å frigjøre kryptene. Hell deretter kryptsuspensjonen gjennom 70 μm cellesilen i et nytt 50 ml konisk rør.
10. Bruk pinsett, plasser tykktarmsvevet tilbake i det tomme 50 ml koniske røret, og tilsett 10 ml iskaldt musevaskemedium. Skaff en ny 70 μm cellesil, og plasser den på toppen av det 50 ml koniske røret som inneholder den forrige filtrerte oppløsningen.
11. Igjen, plukk opp 50 ml røret som inneholder kryptfragmentene, og rist det på samme måte som i trinn 2.9. Filtrer mediet gjennom 70 μm cellesilen inn i det 50 ml koniske røret for å kombinere med de tidligere filtrerte kryptene.
    MERK: Hvis kryptutbyttet er lavt, rist tykktarmsvevet en ekstra gang ved å plassere vevet i et tomt 50 ml konisk rør med 10 ml musevaskmedium. Rist vevet i 45-50 s for å frigjøre kryptene. Også, hvis kryptutbyttet er lavt, øker du kraften i ristingen. Til slutt, hvis det totale kryptutbyttet er lavt, kan både pipetene og rørene belegges med føtalt bovint serum (FBS) for å forhindre at vevet fester seg til plasten.
12. Sentrifuger det 50 ml koniske røret som inneholder de filtrerte kryptene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    MERK: En pellet skal observeres i bunnen av det koniske røret på 50 ml.
13. Dekanter mediet ved pipettering, resuspender kryptene ved å pipettere opp og ned med 10 ml iskaldt musevaskemedium, og overfør til et 15 ml konisk rør. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
14. For å få et renere preparat, vask kryptene med ytterligere 10 ml musevaskmedium. Dekanter det forrige mediet, og resuspender kryptene ved å pipettere opp og ned i 10 ml musevaskmedium. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C ved bruk av et 15 ml konisk rør.
    MERK: Forsiktighet bør utvises ved pipettering av mediet fordi pelleten til tider ikke sentrifugeres tett. Hvis pelleten ikke er tett, pipetter du av det meste av mediet, og etterlater 500 μL til 1 ml. Deretter resuspenderes pelleten ved pipettering i 10 ml musevaskmedium, og overfør oppløsningen til et 15 ml konisk rør. Sentrifugering i et mindre konisk rør kan forbedre pelletens tetthet.
15. Dekanter mediet, og resuspender kryptene ved å pipetere opp og ned med 10 ml iskaldt musevaskemedium. Når kryptene er resuspendert, teller kryptene under et lysfeltmikroskop ved umiddelbart å pipetere 10 μL av mediet på et glassglass.
    1. Plasser to 10 μL dråper på hver ende av lysbildet, og tell antall krypter i hver dråpe. Gjennomsnittlig tallene mellom de to dråpene for å bestemme antall krypter per 10 μL. Multipliser dette tallet med 100 for å få antall krypter i 1 ml.
       MERK: For nøyaktig telling må 10 μL av kryptsuspensjonen fjernes umiddelbart etter resuspensjon. Hvis ikke, vil kryptene falle til bunnen av røret, noe som vil resultere i en unøyaktig telling.
16. Med et mål om plating 300-500 krypter per brønn, overfør riktig volum krypter resuspendert i musevaskmediet til et nytt 15 ml konisk rør og bring til 10 ml med iskaldt musevaskmedium. Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. En liten pellet skal være synlig i bunnen av røret.
17. Fjern supernatanten med en elektrisk pipette. Bruk en P200-pipet for å fjerne restmediet forsiktig, slik at bare pelleten blir igjen.
18. Resuspender pelleten i riktig mengde iskald kjellermembranmatrise ved å pipettere sakte opp og ned. Vær forsiktig så du ikke introduserer bobler når du resuspenderer kryptpelleten. Plate 300-500 krypter / 15 μL kjellermembranmatrise i hver brønn på en plate. Etter plating, snu vevskulturplaten og legg den i en 37 ° C inkubator i 10-20 minutter.
19. Sett platen tilbake, og tilsett 500 μL av det komplette musekolonoidmediet til hver brønn. Bytt medium annenhver dag til de er klare for passering. Pass kolonoider hver 3-5 dager.

3. Passerer kolonoidene

MERK: Hver brønn kan generelt passeres 1: 4 til 1: 6 i henhold til tettheten til den opprinnelige brønnen. Ta riktig mengde kjellermembranmatrise ut av -20 °C, og legg den på is for å tine. Kolonoider kan brukes til eksperimenter etter to passasjer. Når du passerer kolonoider, utføres trinnene i et biologisk sikkerhetsskap for å forhindre forurensning.

1. Fjern mediet fra brønnene som skal passeres.
   1. Hvis det er rusk i kjellermembranmatrisen, noe som kan skje under den første isolasjonen, kan følgende protokoll brukes til å rydde opp rusk:
      1. Tilsett 1 ml iskaldt 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS uten Ca 2+ eller Mg²⁺ til hver brønn. La den sitte i 5 min i det biologiske sikkerhetsskapet.
      2. Pipett opp og ned tre til syv ganger ved hjelp av en P1000-pipette for å forstyrre membranmatrisen i kjelleren, og samle innholdet i brønnene i et 15 ml konisk rør. Sentrifuge kolonoidene i totalt 5-10 ml 0.1% BSA i DPBS uten Ca 2+ eller Mg²⁺. Gjør opp til riktig volum med 0,1% BSA.
      3. Sentrifuge ved 150 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere kolonoidene, men ikke rusk.
      4. Dekanter DPBS ved pipettering, forlater pelleten. Tilsett 1 ml romtemperatur (RT) enzymatisk dissosiasjonsreagens og pipette tre til fem ganger.
      5. Plasser det 15 ml koniske røret med det enzymatiske dissosiasjonsreagenset og forstyrrede kolonoider i et vannbad på 37 °C i 3-4 minutter.
      6. Fjern røret fra vannbadet, pipett 3-5 ganger, og bring deretter til 10 ml med musevaskmedium. Gå videre til trinn 3.6.
2. Plasser 500 μL RT enzymatisk dissosiasjonsreagens i hver brønn, og la den sitte i ca. 1 min før du pipetterer opp og ned tre til syv ganger for å forstyrre matrisen til kjellermembranen.
3. Plasser platen i en 37 ° C inkubator i 3-4 min.
4. Fjern platen fra inkubatoren, og pipett opp og ned tre til syv ganger ved hjelp av en P1000 pipette for å dissociere kolonoider.
5. Overfør innholdet til et 15 ml konisk rør og bland opptil 10 ml med iskaldt musevaskemedium.
6. Sentrifuger prøven ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
7. Fjern mediet med en kraftpipette og en P200-pipette etter behov, slik at bare en pellet er igjen i det koniske røret.
8. Resuspender i en passende mengde iskald membranmatrise i kjelleren ved å pipettere forsiktig opp og ned i henhold til hvor mange brønner som skal belagt. Ikke introduser bobler når du pipetterer. Plasser kolonoidfragmentene i 15 μL kjellermembranmatrisedråper per brønn.
9. Plate kryptene, snu vevskulturplaten, og legg deretter platen i en 37 ° C inkubator i 10-20 minutter.
10. Til slutt, tilbakestill platen, og tilsett 500 μL komplett musekolonoidmedium til hver brønn. Bytt medium annenhver dag til de har vokst seg store nok til å bli passert igjen på ca. 3-5 dager.

4. Terminalt differensiering av kolonoidcellene

1. Pass kolonoidene som ovenfor, og tilsett 500 μL av det komplette musekolonoidmediet til hver brønn.
2. Minst 48 timer etter passering, fjern hele musekolonoidmediet og tilsett 500 mikrol av differensieringsmediet til hver brønn (se avsnitt 1).
3. Inkuber kolonoider med differensieringsmedier i 48 timer, hvoretter de kan brukes i eksperimenter, inkludert samling av RNA og protein.
   MERK: Kolonoider kan vurderes for differensiering ved å samle RNA og vurdere ekspresjonen av Lgr5 og Ki67, henholdsvis en stamcellemarkør og celleproliferasjonsmarkør via kvantitativ revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (qPCR). Terminalt differensierte celler bør ha et relativt lavt uttrykk av Lgr5 og Ki67 sammenlignet med kolonoider dyrket i tradisjonelt kolonoidmedium, hvor cellene er mer stilklignende. Varigheten av tiden som kolonoidene trenger å inkubere i differensieringsmediet, må kanskje optimaliseres for hvert enkelt laboratorium. Se tilleggstabell 1 for listen over primere.

5. Indusere betennelse i differensierte kolonoider med inflammatoriske mediatorer

1. Etter at kolonoidene har blitt inkubert i 2-3 dager med differensieringsmediet, fjern det eksisterende mediet og tilsett 500 μL av betennelsesmediatormediet til hver brønn.
2. La brønnene inkubere i 24-72 timer før du samler RNA og protein (eller vurderer andre nedstrømsparametere). Bytt medium hver dag.

6. Intestinale epitelmonolag avledet fra etablerte murinkolonoider

MERK: Murine intestinal epitel monolayers er avledet fra murine colonoids som har blitt passert minst to ganger. For å muliggjøre vellykket monolagsdannelse på 3-5 dager, er det viktig å ikke skille kolonoidene i enkeltceller. Fragmenterte organoider som har blitt enzymatisk dissosiert i cellulære klynger er ideelle for vekst.

1. Forbered alle reagensene før du begynner forsøket. Tine kjellermembranmatrisen på is. Klargjør murine monolagsmediet som beskrevet i avsnitt 1. Fortynn den tinte kjellermembranen 1:20 med det kalde murine monolagsmediet. Hold på is.
2. Bruk steril tang til å plassere en 0,4 μm gjennomsiktig cellekulturinnsats i en enkelt brønn på en 24-brønns vevskulturplate (materialfortegnelse). Ta tak i en hjørnespiss av innsatsen, og overfør den i brønnen. Gjenta til riktig antall cellekulturinnlegg er tilgjengelige for dyrking.
   NOTAT: Sørg for å belegge en ekstra kontrollbrønn bare med kjellermembranmatrisen. Dette cellekulturinnlegget vil bli brukt til å måle bakgrunnsmotstanden til cellekulturinnsatsen uten celler tilstede, som beskrevet i det påfølgende trinnet (trinn 6.3).
3. Bruk en P200-pipet, dekk den apikale (øverst) overflaten av hver cellekulturinnsats med 150 μL fortynnet kjellermembranmatrise. Plasser pipetspissen i midten av innsatsen uten å berøre membranen på innsatsen, og fjern oppløsningen forsiktig. Plasser platen i en steril 37 ° C inkubator med 5% CO₂ i minst 1 time.
4. Fjern forsiktig matrisen av kjellermembranen før bruk, og la cellekulturinnsatsene tørke i et biologisk sikkerhetsskap i minimum 10 minutter.
   1. For å fjerne kjellermembranmatrisen, roter 24-brønnsplaten i en 45 ° vinkel. Plasser en enkelt finger på hjørnet av tappen for å stabilisere innsatsen, og bruk en P200-pipet, plasser pipetspissen forsiktig langs undersiden av innsatsen og fjern matrisen.
   2. Fjern overflødige rester ved å vaske hver cellekulturinnsats med 150 μL steril DPBS uten Ca 2+ eller Mg²⁺.
5. Etter 10 minutters tørking, tilsett 400 μL av murine monolagsmediet til bunnen av cellekulturinnsatsen og 75 μL på toppen. Gjenta til alle cellekulturinnsatsene er nedsenket. La platen stå i det biologiske sikkerhetsskapet, eller legg den tilbake i inkubatoren til det trengs.
6. Fjern 24-brønnsplaten av modne (organoider på dag 3-5 av vekst) tarmkolonoider fra 37 ° C, 5% CO₂ -inkubatoren, og legg den under det biologiske sikkerhetsskapet. Fjern mediet med sterile spisser, og vask hver brønn med 1 ml RT steril DPBS (uten Ca 2+ eller Mg²⁺).
   MERK: En individuell brønn på 75-125 modne kolonoider er delt i forholdet 1:4.
7. Fjern DPBS uten Ca 2 + eller Mg^{2 +} ved hjelp av sterile tips, og fordøy hver plugg i kjellermembranmatrisen ved å plassere 500 μL RT enzymatisk dissosiasjonsreagens i hver brønn som skal passeres.
8. Pipett hver brønn opp og ned ca. 6-10 ganger for å bryte opp pluggen. Ikke skrap bunnen av platen for å fjerne pluggen. Roter i stedet 24-brønnsplaten i en 45° vinkel, plasser pipetspissen på kanten av pluggen og løsne den forsiktig.
9. Plasser 24-brønnsplaten tilbake i en steril 37 ° C, 5% CO₂ -inkubator i 3-4 minutter.
10. Fjern platen, og rør det enzymatiske dissosiasjonsreagenset opp og ned fem til syv ganger for hver brønn under et biologisk sikkerhetsskap. Overfør de disassosierte kolonoidene fra hver brønn til et sterilt, 15 ml konisk rør. Få opp til et volum på 10 ml med iskaldt musevaskmedium.
11. Sentrifuge de delvis fordøyde kolonoidene ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter i en svingende bøttesentrifuge.
12. Under det biologiske sikkerhetsskapet fjernes supernatanten fra pelleten med en 10 ml pipette. Fjern gjenværende medium med en P200-pipette. Resuspender kolonoidpelleten i murine monolagsmedium. Tilsett 75 μL medium per hver cellekulturinnsats av fragmenterte kolonoider som skal belegges.
13. Tilsett 75 μL kolonoidsuspensjon til midten av hver cellekulturinnsats. Før kolonoidsuspensjonen tilsettes hver brønn, piper du forsiktig opp og ned en eller to ganger før du fjerner 75 μL, noe som gir mer jevn plettering.
14. Plasser 24-brønnsplaten med cellekulturinnsatser på en roterende plattform i 10 minutter for ytterligere å muliggjøre jevn spredning over cellekulturinnsatsen.
15. Plasser platen i en steril 37 ° C, 5% CO₂ inkubator.
16. Neste dag (dag 1) løsner du de løsrevne kolonoidfragmentene ved å pipetere mediet opp og ned tre til fem ganger med en P200-pipette. Plasser forsiktig spissen langs innsiden av cellekulturinnsatsen for ikke å forstyrre de vedlagte tarmcellene. Ikke introduser bobler i mediet, da dette forhindrer fjerning av alle de ufestede fragmentene.
17. Fjern umiddelbart mediet og kolonoidblandingen. Gjenta til alle cellekulturinnsatsene er rengjort.
18. Tilsett forsiktig 150 μL forvarmet murine monolagsmedium til den apikale siden av hver cellekulturinnsats. Tilsett 400 μL oppvarmet murine monolagsmedium til hver brønn i en ny 24-brønnsplate. Overfør cellekulturinnsatsen til den nye platen ved å ta tak i spissen ved hjelp av steril tang. Bytt medium annenhver dag til sammenløp.
    MERK: Kolonoidfragmentene skal danne et konfluent monolag 3-5 dager etter plating.

7. Måling av nettomotstanden til epitelmonolagene ved hjelp av et voltohmmeter på dagene 3 - 5 i monolagskulturen

MERK: Spisepinneelektrodene ligner tang og er asymmetriske i lengden. Den lengre armen til sonden er den basolaterale elektroden, og den kortere armen er den apikale elektroden. Sonden kan være vanskelig å sette inn mellom innsiden og utsiden av cellekulturinnsatsen. Plassering av sonden i en liten vinkel ved innsetting, etterfulgt av vertikal retting av sonden, vil forhindre at sonden setter seg fast. Sørg for å lese nettomotstanden til hver cellekulturinnsats i samme vinkel, da dette kan påvirke verdiene.

1. Plasser voltohmmeter og alle reagensene inne i et biologisk sikkerhetsskap.
   1. Koble voltohmmeteret til nærmeste stikkontakt, og koble den modulære plastkontakten til elektrodesonden til INPUT-kontakten på frontdisplayet.
   2. For å plassere voltohmmeteret i en 45° vinkel, sving metallarmen på baksiden av utstyret ut til den låses på plass.
   3. Slå nå på voltohmmeteret ved å snu strømbryteren UP på frontdisplayet. Til slutt, vri bryteren opp mot OHMS for å vise avlesningen i denne beregningen.
2. Fjern 24-brønnsplaten fra 37 ° C, 5% CO₂ -inkubatoren, og legg platen flatt i det biologiske sikkerhetsskapet. Den transepiteliale elektriske motstanden (TEER) er temperaturfølsom. Fjern platen bare umiddelbart før TEER leses.
3. Steriliser elektrodesonden i forvarmet 70% etanol i 30 s til 1 min. Fjern sonden, inverter og flikk den en til to ganger for å fjerne overflødig etanol. La sonden lufttørke i ca. 30 sekunder.
4. Vask eventuell gjenværende etanol som er igjen på sonden med forvarmet musevaskmedium.
   FORSIKTIG: Ikke la noen av de gjenværende etanoldråpene høyere på sonden falle inn i cellekulturinnsatsen. Når du vasker etanolen av med medium, må du ikke la mediet gå over det sterile etanolfeltet. Dette kan føre til at forurenset medium kommer inn i cellekulturinnsatsen.
5. Hold sonden vinkelrett på cellekulturinnsatsen. Sett inn den basolaterale elektroden (lengre ende av sonden) på utsiden av cellekulturinnsatsen til den berører bunnen av 24-brønnsplaten. Skyv den apikale elektroden (kortere ende av sonden) inn i cellekulturinnsatsen. Ikke varier avstanden mellom de to elektrodene fra brønn til brønn. Dette vil påvirke TEER-målingen.
6. Kontroller at den apikale elektroden ikke berører bunnen av cellekulturinnsatsen før du leser TEER. Start med cellekulturen for bakgrunnskontroll, og registrer verdien. Verdien vises automatisk digitalt på forsiden av voltohmmeteret.
7. Gjenta trinn 7,5-7,6 for hver cellekulturinnsats.
   MERK: Hvis forskjellige eksperimentelle forhold eksisterer mellom cellekulturinnsatsene, steriliser sonden mellom hver ny tilstand. Start på trinn 7.1, og fortsett numerisk gjennom trinnene.
8. Plasser 24-brønnsplaten tilbake i inkubatoren når alle TEER-målingene er registrert.
9. Nettoverdiene ved 350 Ω eller høyere indikerer dannelse av monolag. Gjenta igjen de påfølgende dagene til monolagsdannelse er oppnådd.
   MERK: Vanligvis kan verdier på 1000 Ω eller høyere registreres på dag 3, men over tid vil de alle konvergere på et lavere tall rundt 350 Ω.

8. Beregning av TEER ved hjelp av nettomotstandsmålinger fra voltohmmeteret

MERK: Vellykket monolagsdannelse av kolonoidene vil gi TEER-målinger større enn 115 Ω · cm².

1. Ta individuelle nettomotstandsverdier, og trekk nettomotstanden fra bakgrunnsbrønnen. Cellekulturinnsatsene belagt med kjellermatriksmembranen vil gi en nettoavlesning på rundt 100 Ω.
2. Ta bakgrunnssubtraherte nettomotstandsmålinger, og multipliser dem med overflaten av cellekulturinnsatsen. En 24-brønns cellekulturinnsats har et overflateareal på 0,33 cm².
3. Hvis verdiene er 115 Ω · cm² eller høyere, fortsett til nedstrøms eksperimentelle analyser.

9. Indusere betennelse i epitelmonolagene med inflammatoriske mediatorer

1. Når vellykkede monolayers har dannet seg, legg til inflammatoriske mediatorer til kulturen på basalsiden av kulturen. Forbered monolagsmediet for betennelsesmediatoren, som beskrevet i trinn 1.9, og tilsett 400 μL til hver brønn i en ny 24-brønnsplate.
2. Fjern mediet fra den apikale siden av cellekulturinnsatsen, og tilsett 150 μL av murine monolagsmediet uten Y-27632. Ikke suppler denne siden med inflammatoriske mediatorer. Men hvis celledøden virker overdreven, la Y-27632 være i media. Dette må bestemmes av sluttbrukeren.
3. Overfør cellekulturinnsatsene til en ny 24-brønnsplate, og plasser dem i brønnene supplert med betennelsesmediatormonolagsmediet.
4. Stimuler monolagene med inflammatoriske mediatorer i 24-72 timer, avhengig av eksperimentet.
5. For å teste legemiddelresponser ved hjelp av denne inflammatoriske modellen, suppler monolagsmediet på den apikale siden av cellekulturinnsatsen med det valgte stoffet. Legemidlet kan tilsettes når som helst i forsøket, avhengig av virkningsmekanismen til stoffet og nedstrømsparametrene som skal vurderes.

Representative Results

3D intestinal kolonoidkultursystem er et uvurderlig verktøy for å studere epitelets iboende bidrag til tarmslimhinnehomeostase. Den beskrevne protokollen gir detaljerte instruksjoner om hvordan man isolerer krypter fra C57BL / 6J (WT) mus ved 8 ukers alder og etablerer et langsiktig kolonoidkultursystem som kan manipuleres for flere nedstrøms applikasjoner. Ved isolering og plating av krypter i kjellermembranmatrisen, virker kryptene tette og flercellede i struktur når de visualiseres ved lysfeltmikroskopi. De kan være sfæriske i form eller langstrakte og sylindriske, som ligner den enkle, kryptlignende strukturen som normalt observeres i in vivo tarmarkitekturen (figur 1A). På dag 1 danner flertallet av kryptene en kompakt, sfærisk struktur, med noen få kolonoider som begynner å utvikle et indre lumen (tomt rom) uten epitelceller (figur 1B). Etter hvert som de fortsetter å vokse i løpet av de neste dagene, fortsetter kolonoidernes diametre å øke, og lumen av kolonoidene blir mer definert (figur 1C). Ved dag 5 er hver kolonoid ca. 100-250 μm i diameter, og danner et stort, fremtredende lumen omgitt av et tynt lag av epitelstamceller (figur 1D). På dette tidspunktet blir kolonoidene både enzymatisk og mekanisk forstyrret for passering. Etter to passasjer kan de brukes til eksperimentering nedstrøms.

For å vurdere om de metabolske endringene observert i kolonskraping av DSS-behandlede mus beholdes i kolonoider avledet fra mus på samme DSS-regime, ble 8 uker gamle WT-mus behandlet med 2% DSS i drikkevann ad libitum. Aldersmatchede og kjønnsmatchede WT-kontrolldyr fikk drikkevann ad libitum uten DSS. Etter 7 dager ble musene ofret, og krypter ble isolert fra kolonene til både kontrolldyrene (n = 3, hann) og DSS-behandlede dyr (n = 3, hann) for å etablere kolonoider. Etter to passasjer ble protein isolert fra hvert sett kolonoider, og ekspresjonen av peroksisomproliferatoraktivator-reseptor-gamma-koaktivator-1α (PGC1α), hovedregulatorproteinet for mitokondriell biogenese, ble vurdert via western blot-analyse (tilleggsfigur 1). Det var ingen signifikant forskjell i PGC1α-uttrykk når man sammenlignet kolonoider etablert fra DSS-behandlede mus versus kolonoider etablert fra kontrollmusene, noe som tyder på at denne kolonoidkulturmetodikken ikke reflekterer metabolske endringer in vivo som observeres hos mus¹⁵.

Manglende evne til PGC1α å initiere mitokondriell biogenese under en intestinal inflammatorisk fornærmelse er primært lokalisert til det differensierte koloneepitelet^15,19. For å speile endringene observert in vivo, bestemte vi oss for å lede colonoids mot en mer differensiert tilstand. For å indusere dette skiftet ble kolonoidene opprinnelig inkubert med tradisjonelt kolonoidmedium. Etter 24 timer til 48 timer ble kolonoidene byttet til differensieringsmedium i ytterligere 48 timer. Under differensiering gikk en liten prosentandel av kolonoider over fra en sfærisk arkitektur til spirede strukturer beriket med begerceller og kolocytter¹⁷ (figur 2A,B). Kolonoidene dyrket i WRN-supplert medium ble beriket med raskt delende Lgr5⁺ stamceller. For å bekrefte at både Lgr5⁺ stamceller og andre prolifererende celler gikk ut av cellesyklusen under differensiering, ble mRNA-nivåene analysert via qPCR. Signifikant nedregulering i både Lgr5 (97 %, p = 0,0023) og Ki67 (75 %, p = 0,0007) nivå ble observert i de differensierte kolonoidene (n = 6) sammenlignet med kolonoidene dyrket i en tradisjonell kultursetting (n = 6; Tilleggsfigur 2A,B). Man kan også forvente at de differensierte kolonoidene primært består av slimutskillende begerceller. I tillegg ble MUC2 faktisk oppregulert nesten to ganger i de differensierte kolonoidene sammenlignet med deres tradisjonelt dyrkede kolleger (n = 3, p = 0,0433, tilleggsfigur 3). Når de tas sammen, tyder disse dataene på at kolonoidene ble vellykket differensiert og var klare for nedstrøms eksperimentering. Deretter ble inflammatoriske mediatorer tilsatt i differensieringsmediet, som beskrevet i avsnitt 5 i protokollen. Protein og RNA ble samlet opptil 72 timer etter introduksjonen av de inflammatoriske mediatorene for analyse. Ved 72 timer ble det imidlertid av og til observert økt celledød.

For å vurdere om innføring av inflammatoriske mediatorer til differensierte kolonoider kunne etterligne mitokondriell biogenesesvikt observert i både human IBD og en akutt modell av murine kolitt, ble proteinuttrykket av PGC1α og transkripsjonsfaktor A, mitokondrier (TFAM) vurdert via western blot-analyse i differensierte kolonoider (n = 5) behandlet med inflammatoriske mediatorer over 72 timer. PGC1α-ekspresjon har vist seg å være redusert i murine modeller av kolitt, så vel som i human IBD¹⁵. TFAM, et protein som driver både transkripsjon og replikasjon av mitokondriegenomet, har også vist seg å bli redusert i murine modeller av kolitt, og dets genuttrykk har vist seg å bli redusert i human IBD^15,20. Vi observerte en lignende nedregulering i både PGC1α (50,4 %, p = 0,0442) og TFAM (88,9 %, p = 0,004) uttrykk i de differensierte kolonoidene etter 72 timers eksponering for disse inflammatoriske mediatorene (figur 3). Samlet antyder dette at behandling av differensierte kolonoider med cytokiner er en ideell modell for å studere mitokondriell dynamikk in vitro.

Mens forskjellige cellulære og molekylære funksjoner kan undersøkes i 3D-kolonoidkulturinnstillinger, er 2D-monolagskultursystemer overlegne når man vurderer barrierefunksjon, vertspatogeninteraksjoner og virkningen av oralt absorberte terapier på betennelse^21,22. Dannelsen av et kontinuerlig lag av konfluente celler med en intakt barriere gjør det mulig å plassere forskjellige biologiske eller kjemiske midler på den apikale og / eller basale siden av cellene med letthet. Denne protokollen gjør det mulig å etablere 2D-monolagskulturer fra eksisterende WT-kolonoider som har blitt passert to ganger. Kolonoider som har blitt enzymatisk og mekanisk forstyrret, er belagt på cellekulturinnsatser belagt med kjellermembranmatrise. Ved første plettering opptrer de fragmenterte kolonoidene i cellulære klynger fra 15 til 150 celler (figur 4A). På dag 3 har cellene begynt å flate ut og sakte dekke cellekulturinnsatsen, og når vanligvis konfluens (figur 4B). I løpet av de neste par dagene fortsetter monolayers å vokse og danne en kontinuerlig barriere som kan måles kvantitativt med TEER (figur 4C, D). Interessant nok svinger TEER-målingene over dag 3 til dag 5. Monolagene har høyere verdier tidligere med et bredt område (200-800 Ω ·cm 2), men disse verdiene konvergerer sakte til et lavere tall ved dag 5 (115-150 Ω^·cm², figur 5A). Når monolagene når en jevn tilstand, kan de brukes til nedstrøms eksperimentering.

For å karakterisere epitelresponsen av kolonoidavledede monolayers til betennelse, ble inflammatoriske mediatorer plassert på basalsiden (utsiden av innsatsen) av cellene i 48 timer. RNA ble ekstrahert, og mRNA-nivåene av forskjellige stam- og celledifferensieringsmarkører, samt kryssproteiner, ble analysert via qPCR. Lgr5 ble ikke påvist i noen av tilstandene, men en annen stamcellemarkør, mTERT, ble redusert med nesten 60 % i de betente monolagene sammenlignet med den ubehandlede kontrollen (tilleggsfigur 4A). Deretter analyserte vi uttrykket av to markører av differensierte celletyper, Muc2 og alkalisk fosfatase (Alpi). Begge mRNA-transkriptene var lavere i de betente monolagene sammenlignet med kontrollcellene (tilleggsfigur 4A). Både stamceller og postmitotiske celler reduseres vanligvis under kolonbetennelse^23,24,25, og en lignende respons ble observert i monolagsmodellen oppnådd i denne studien.

En fordel med monolagssystemet er evnen til å vurdere barriereresponsen. For å avgjøre om barrieren var kompromittert i immunstimulert tilstand, målte vi TEER-verdiene etter 48 timer. TEER-verdiene for kontrollmonolagene (n = 2) var i gjennomsnitt 129,16 Ω ·cm 2, men falt signifikant (p = 0,0087) til et gjennomsnitt på 98,54 Ω ·cm² i de betente monolagene (figur 5B). For ytterligere å bekrefte at barrieren ble kompromittert i inflammatorisk tilstand, vurderte vi mRNA-nivåene for tre forskjellige tette kryssmarkører, Zo-1, Occludin og Claudin. Alle tre markørene hadde reduserte nivåer i betent tilstand sammenlignet med deres ubetente kolleger (tilleggsfigur 4B). Samlet viser disse dataene at barrieredysfunksjon er tilstede i de betente monolagene og etterligner barrieredysfunksjonen observert under IBD-patogenesen.

Figur 1: Initial isolering av murine krypter for etablering av langvarig kolonioidkultur. (A) På dag 0 ble 300-500 krypter belagt i kjellermembranmatrise (bilde oppnådd 5 timer etter plating), og veksten av kolonoidene ble fanget på (B) dag 1, (C) dag 3 og (D) dag 5. På dag 5 var colonoids klar til å bli passert. Forstørrelse = 10x; skala bar = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Etablering av terminalt differensierte kolonoider fra tradisjonell kolonoidkultur. Differensieringsmedium ble plassert på kolonoidene 48 timer etter passering av murinkolonoidene. Etter (A) 24 timer og (B) 48 timer blir kolonoidene beriket med terminalt differensierte celler. Forstørrelse = 10x; skala bar = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: PGC1α og TFAM-proteinuttrykk i murine differensierte kolonoider behandlet med inflammatoriske mediatorer. Medium supplert med inflammatoriske mediatorer ble plassert på de differensierte kolonoidene, og protein ble samlet 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer etter eksponering. (A) Proteinuttrykket av PGC1α viste en samlet signifikant reduksjon (p = 0,0442) over 72 timer. TFAM ble signifikant nedregulert (p = 0,004) etter eksponering for inflammatoriske mediatorer ved 72 timer, og (B) det var en nedadgående trend i proteinuttrykk ved 24 timer, 48 timer og 72 timer når det ble analysert av ANOVA. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. *p < 0,05, **p < 0,005. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Etablering og vekst av monolayers fra eksisterende colonoider. Kolonoider som hadde blitt enzymatisk og mekanisk forstyrret, ble belagt på cellekulturinnsatser belagt med en kjellermembranmatrise. Ved første plating dukket de fragmenterte kolonoidene opp i (A) cellulære klynger, og ved (B) dag 3 hadde de begynt å flate ut og sakte dekke cellekulturinnsatsen. (C) På dag 5 og (D) dag 7 fortsatte monolagene å vokse for å danne en kontinuerlig barriere som kunne måles kvantitativt med TEER. Forstørrelse = 10x; skala bar = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: TEER-verdier for etablering av monolayers fra colonoid og betente monolayers. (A) TEER-verdiene ble målt med et voltohmmeter fra dag 3 til dag 5. Monolagene hadde høyere verdier tidligere med et bredt område, men konvergerte sakte på et lavere tall ved dag 5. Når monolagene når en jevn tilstand, kan de brukes til nedstrøms eksperimentering. (B) TEER-verdiene var lavere i de betente monolagene (n = 2) sammenlignet med de betente kontrollene (n = 2). Kontrollmonolagene hadde en gjennomsnittlig TEER på 129,16 ohm·cm 2, og TEER for de betente monolagene var signifikant lavere (p = 0,0087), med et gjennomsnitt på 98,54 Ω ·cm², når de ble analysert med t-test. **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Tabell for løsningssammensetning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfigur 1: PGC1α-proteinuttrykk i murine kolonoider dyrket i tradisjonelt kolonoidmedium isolert fra WT-kontroller og 2% DSS-behandlede mus. Kolonoidene ble avledet fra både 8 uker gamle WT-kontrollmus og 2% DSS-behandlede mus etter 7 dager. Protein ble isolert fra kolonoider passert to ganger og på dag 4 etter plating. Det var ingen forskjell i PGC1α-proteinuttrykk (p = 0,9996) i kolonoidene avledet fra kontrollmusene sammenlignet med musene utsatt for 2% DSS i 7 dager når de ble analysert med en uparet t-test. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Redusert Lgr5 og Ki67 mRNA-uttrykk i differensierte kolonoider. Murine colonoids passerte 48 timer før ble utsatt for differensieringsmedium i 48 timer før isolering av RNA og cDNA-syntese. mRNA-nivåene ble bestemt via qPCR og analysert med komparativ CT-metode. (A) Lgr5 og (B) Ki67 ble signifikant redusert i de differensierte kolonoidene når de ble statistisk analysert med en t-test (p = 0,0023, p = 0,0007). Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.**p < 0,005. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Økte mucinutskillende begerceller i differensierte murinkolonoider. Murine colonoids passerte 48 timer før ble utsatt for differensieringsmedium i 48 timer. Cellene ble lysert i RIPA-buffer, og protein ble visualisert ved western blot-analyse. (A) MUC2-ekspresjon ble økt i hvert sett av differensierte kolonoider sammenlignet med de udifferensierte kolonoidene. (B) En nesten dobbelt endring i MUC2-protein ble observert under differensierende forhold, noe som var signifikant når det ble analysert med en t-test (p = 0,0433). Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. *p < 0,05. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Redusert ekspresjon av stamme- og differensieringsmarkører, samt stramme kryssmarkører, i monolag behandlet med inflammatoriske mediatorer. Murine kolonoidderiverte monolayers (dag 5) ble eksponert for inflammatoriske mediatorer i 48 timer, RNA ble deretter samlet inn, og cDNA ble syntetisert (n = 2). mRNA-nivåene av stamme, differensiering og kryssmarkører ble bestemt via qPCR og analysert ved komparativ CT-metode. (A) Stamcellemarkøren, Lgr5, ble ikke påvist i noen av tilstandene, men mTERT ble betydelig redusert ved inflammatoriske tilstander. Begercellemarkøren, Muc2, og kolocyttmarkøren, Alpi, ble begge redusert i de betente monolagene sammenlignet med de ubehandlede monolagene. (B) De stramme kryssmarkørene, Zo-1, Occludin og Claudin, var alle lavere i betennelsesbehandlede monolag sammenlignet med kontrollen. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Liste over primere. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Organoidutvikling har revolusjonert måten det vitenskapelige samfunnet studerer organsystemer in vitro med evnen til delvis å rekapitulere cellulær struktur og funksjon fra et dyr eller menneske i en tallerken. Videre tilbyr organoide systemer avledet fra mennesker med sykdommer et lovende verktøy for personlig medisin som kan veilede terapeutisk beslutningstaking. Her beskriver vi en kryptisolasjonsprotokoll som fungerer bra og introduserer viktige trinn som gjør det mulig å rydde opp overflødig rusk i isolasjonen før plating. I tillegg forklarer vi en viktig detalj som ofte blir oversett i prosessen - evnen til å telle kryptene nøyaktig for plating. Når kolonoider er etablert, skisserer vi viktige manipulasjoner som tillater deres cellulære differensiering eller monolagsdannelse, noe som kan forbedre evnen til å studere endringer i tarmepitelet under IBD.

Krypt-villus-aksen i kolonepitelet hos pattedyr er en kompleks struktur sammensatt av forskjellige celletyper med forskjellige funksjoner. Opprettholdelsen av denne aksen er avhengig av både indre og ytre cellulære faktorer, som sammen bidrar til å opprettholde epitelial homeostase¹⁸. Vi har bemerket at murine colonoids dyrket i tradisjonelt medium primært reflekterer stamceller i motsetning til konglomerasjonen av både stamceller og terminalt differensierte celler som ses in vivo. Videre er murine colonoids dyrket og vedlikeholdt på denne måten sirkulære strukturer i motsetning til flate monolayers. Disse forskjellene har potensielle implikasjoner for våre forsøk på å studere tarmsykdom in vitro. Spesielt er vi begrenset i vår evne til å bruke organoider til å studere endringer i barrierefunksjon, samt effekten av betennelse på terminalt differensierte tarmepitelceller.

Her beskriver vi protokoller for ikke bare isolering av murintkrypter for å vokse kolonoider, men også for manipulering av disse kolonoidene for å studere tarmepitelfysiologi og epitelrespons på betennelse. Blant flere ekstrinsiske faktorer som fremmer gradienten av pluripotente stamceller og terminalt differensierte celler, er Wnt-kanonisk vei, som er rik på krypter og fremmer stamcellehelse. Wnt-signalering avtar på spissen av kryptaksen, sammenfallende med utviklingen av stamceller til terminalt differensierte celler²⁶. Vi har beskrevet en protokoll som muliggjør terminal differensiering av kolonoidceller. Som andre differensierer vi ved å fjerne Wnt fra vekstmediet, men vi bruker en lavere konsentrasjon av R-spondin (500 ng/ml versus 1 μg/ml R-spondin)¹⁷. Overraskende nok påvirker en 50% reduksjon i R-spondin ikke den vellykkede differensieringen av organoider. Evnen til å differensiere med lavere konsentrasjon bidrar til å etablere et mindre kunstig system som kan ligne mer på det fysiologiske miljøet in vivo. Selv om denne protokollen resulterer i endelig terminal differensiering (tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3) og manglende evne til å opprettholde cellulær udødelighet, er det likevel en nyttig metode for bedre å forstå det fysiologiske bidraget til det terminalt differensierte epitelet, inkludert kolocytter, enteroendokrine celler og begerceller, til IBD og andre sykdomstilstander. Videre viser vi at supplering av spesifikke cytokiner i dette mediet, som tradisjonelt er forhøyet hos pasienter med IBD, styrer det differensierte organoidsystemet mot en inflammatorisk tilstand. I løpet av 72 timer reflekterer differensierte kolonoider behandlet med inflammatoriske cytokiner nærmere noen av de metabolske funnene vist i andre etablerte modeller for kolitt og human IBD (figur 3). Videre er differensierte kolonoider behandlet på denne måten sannsynligvis mer reflekterende av effekten av betennelse på cellulær homeostase på det differensierte epitelet. Vi har også skissert en protokoll for utvikling av monolag, som muliggjør dannelse av både en apikal og basal side av epitelet, noe som muliggjør en analyse av barrierefunksjon in vivo. Dette systemet er nyttig for å studere mekanismer for barrieredysfunksjon uten behov for differensiering og dyrking av nye terapeutiske mål for behandling.

Flere begrensninger og potensielle fallgruver angående protokollene beskrevet ovenfor må bemerkes. Den vellykkede isoleringen av krypter og utviklingen av kolonoider kan begrenses av kryptutbyttet fra hvert dyr, nøyaktigheten av å telle kryptene og rensligheten av forberedelsen. Hastigheten til å telle de isolerte kryptene etter resuspensjon, variasjoner i den mekaniske dissosiasjonen av kryptene fra de underliggende muscularis, og antall vasker og sentrifugalspinn bidrar til vellykket kolonioidkultur. Videre er det kritisk å ikke fullt ut disassociate organoider i enkeltceller under passaging eller plating for 2D monolagskultur. Klynger på 30 til 50 celler er ideelle for å la kulturen forplante seg for langsiktig kultur. Protokollene ovenfor noterer områder med potensielle fallgruver og valgfrie tilleggstrinn for å feilsøke disse problemene. Til syvende og sist kan protokollen kreve optimalisering av individet som utfører isolasjonen på grunn av iboende variasjon i ferdighetssett og manøvrer (dvs. risting), samt variasjon i hvert dyr. Ytterligere optimalisering kan være nødvendig av sluttbrukeren for å fange det genetiske og molekylære mangfoldet som finnes i IBD.

Til syvende og sist, mens kolonoidsystemet er et svært nyttig verktøy for å rekapitulere viktige aspekter av menneskelig fysiologi og sykdom in vivo, er dette systemet til slutt begrenset i sin evne til å studere alle aspekter av menneskelig sykdom. Tradisjonelle metoder for kolonoidutvikling har belyst viktige aspekter ved stamcelledynamikk; Imidlertid reflekterer disse funnene ofte ikke tilstrekkelig funnene i terminalt differensierte celler i vertsepitelet. Strategiene som er skissert i denne studien gir etterforskere en relativt rask og billig modell for organoidmanipulasjon som, når den brukes riktig, kan kaste lys over viktige aspekter ved tarmepitelstruktur og funksjon under betennelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)