Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64804
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 2,3
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

وصفنا بروتوكولا يوضح بالتفصيل عزل خبايا القولون الفئران لتطوير القولون ثلاثي الأبعاد. يمكن بعد ذلك تمييز القولون الثابت بشكل نهائي ليعكس التركيب الخلوي لظهارة المضيف قبل تلقي تحد التهابي أو توجيهه لإنشاء طبقة أحادية ظهارية.

Abstract

تلعب ظهارة الأمعاء دورا أساسيا في صحة الإنسان ، حيث توفر حاجزا بين المضيف والبيئة الخارجية. توفر طبقة الخلايا عالية الديناميكية هذه خط الدفاع الأول بين المجموعات الميكروبية والمناعية وتساعد على تعديل الاستجابة المناعية المعوية. اضطراب الحاجز الظهاري هو السمة المميزة لمرض التهاب الأمعاء (IBD) وهو ذو أهمية للاستهداف العلاجي. نظام زراعة القولون 3 الأبعاد هو نموذج مفيد للغاية في المختبر لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية في التسبب في مرض التهاب الأمعاء. من الناحية المثالية ، فإن إنشاء القولون من الأنسجة الظهارية الملتهبة للحيوانات سيكون أكثر فائدة في تقييم التأثيرات الجينية والجزيئية على المرض. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن التغيرات الظهارية في الجسم الحي لا يتم الاحتفاظ بها بالضرورة في القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المصابة بالتهاب حاد. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير بروتوكول لعلاج القولون بمزيج من الوسطاء الالتهابيين الذين عادة ما يكونون مرتفعين أثناء مرض التهاب الأمعاء. في حين يمكن تطبيق هذا النظام في كل مكان على ظروف الثقافة المختلفة ، فإن هذا البروتوكول يؤكد على العلاج على كل من القولون المتمايز والطبقات أحادية الأبعاد 2 المشتقة من القولون الثابت. في بيئة الثقافة التقليدية ، يتم إثراء القولون بالخلايا الجذعية المعوية ، مما يوفر بيئة مثالية لدراسة مكانة الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النظام بتحليل ميزات فسيولوجيا الأمعاء ، مثل وظيفة الحاجز. علاوة على ذلك ، لا توفر القولونات التقليدية الفرصة لدراسة الاستجابة الخلوية للخلايا الظهارية المتمايزة نهائيا للمنبهات الالتهابية. توفر الطرق المعروضة هنا إطارا تجريبيا بديلا لمعالجة هذه القيود. يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة 2 الأبعاد أيضا فرصة لفحص الأدوية العلاجية خارج الجسم الحي. يمكن علاج هذه الطبقة المستقطبة من الخلايا بوسطاء التهابيين على الجانب القاعدي من الخلية وبالتزامن مع العلاجات المفترضة قميا لتحديد فائدتها في علاج مرض التهاب الأمعاء.

Introduction

مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض مزمن وتحويل وانتكاس يتميز بنوبات من الالتهاب والسكون السريري. مسببات مرض التهاب الأمعاء متعددة العوامل ، ولكن السمات المميزة الرئيسية للمرض تشمل وظيفة الحاجز المعيب وزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء ، بالإضافة إلى شلالات الإشارات الالتهابية التي يتم تنشيطها داخل المقصورة الظهارية 1,2. تم استخدام العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتلخيص الاستجابة الظهارية أثناء مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك زراعة الخلايا ونماذج الفئران للالتهاب3. ومع ذلك ، فإن كل هذه الأنظمة لديها أوجه قصور مهمة تحد من قدرتها على تلخيص التغيرات الظهارية خلال IBD4. يتم تحويل معظم خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، ولديها القدرة على تكوين طبقة أحادية ، ويمكن أن تفرق3 ولكنها تنتشر جوهريا بشكل مختلف عن الخلايا الظهارية المعوية غير المحولة في المضيف. يتم استخدام العديد من نماذج الفئران المختلفة للالتهاب لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، وبعضها يشمل نماذج خروج المغلوب ، والنماذج المعدية ، والنماذج الالتهابية الكيميائية ، ونماذج نقل الخلايا التائية5،6،7،8. في حين أن كل منها يمكنه دراسة بعض الجوانب المسببة لمرض التهاب الأمعاء ، مثل الاستعدادات الوراثية ، واختلال الحاجز ، وإلغاء التنظيم المناعي ، والميكروبيوم ، إلا أنها محدودة في قدرتها على دراسة الطبيعة متعددة العوامل للمرض.

تم إنشاء الكائنات العضوية المعوية ، بما في ذلك الأمعاء والقولون ، على مدار العقد الماضي كنموذج مفيد في المختبر لدراسة ليس فقط ديناميات الخلايا الجذعية المعوية ولكن أيضا دورها في سلامة الحاجز ووظيفة ظهارة الأمعاء في التوازن المعوي والمرض. ساهمت هذه الكيانات بشكل كبير في فهمنا للتسبب في مرض التهاب الأمعاء9 وفتحت فرصا جديدة للطب الشخصي. تم تطوير القولون ، أو مزارع الأنسجة ذاتية التنظيم المشتقة من الخلايا الجذعية من القولون ، من كل من الفئران والأنسجة البشرية في عملية تسمح للخلايا الجذعية الموجودة داخل الخبايا المعوية بالتكاثر والحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى10. يعتمد تخصص الخلايا الجذعية في الجسم الحي على عوامل خارج الخلية لدعم نموه ، ولا سيما إشارات Wnt المتعارف عليها ومسارات إشارات البروتين المورفوجيني للعظام11. إن إضافة هذه العوامل تعزز صحة وطول عمر القولون ولكنها تدفع أيضا الثقافة نحو حالة تشبه الخلايا الجذعية لا تعكس البنية الخلوية الظهارية في الجسم الحي ، والتي تتكون من خلايا ذاتية التجديد ومتمايزة نهائيا12,13. في حين أن وظيفة ظهارة الأمعاء تعتمد على الحديث المتبادل المستمر بين حجرة الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة ، فإن القدرة على الحصول على كليهما في نظام زراعة القولون محدودة إلى حد ما. على الرغم من هذه القيود ، يظل نظام الاستزراع العضوي هو المعيار الذهبي لدراسة الخصائص الجوهرية للظهارة خارج الجسم الحي. ومع ذلك ، قد يلزم النظر في استراتيجيات الثقافة البديلة للإجابة على السؤال العلمي المطروح.

لقد ثبت أن الفئران التي تتبع نظاما مستمرا لمدة 7 أيام من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) تصاب بالتهاب ظهاري وخلل في الحاجز14. علاوة على ذلك ، تم أيضا التقاط فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا وإعادة البرمجة الأيضية داخل ظهارة الأمعاء ، والتي ثبت أنها واضحة في مرض التهاب الأمعاء البشري ، في نموذج DSS هذا لالتهاب القولون15. ومع ذلك ، توضح بياناتنا الأولية أن خصائص فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا لا يتم الاحتفاظ بها في القولون المشتق من خبايا الحيوانات المعالجة ب DSS (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، يجب استخدام طرق الثقافة البديلة عند فحص كيفية دفع الالتهاب للتغيرات الظهارية أثناء التهاب الأمعاء الفئران. هنا ، نحدد بروتوكولا قمنا بتطويره يصف 1) كيفية عزل الخبايا من أنسجة القولون الكاملة لإنشاء قولون الفئران ، 2) كيفية التمييز النهائي بين هذه الخلايا لتعكس عدد الخلايا كما هو الحال في الجسم الحي ، و 3) كيفية إحداث التهاب في هذا النموذج في المختبر . لدراسة التفاعلات الدوائية داخل الظهارة الملتهبة ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء طبقات أحادية 2-dimensonal (2D) من قولون الفئران التي يمكن علاجها بشكل أساسي باستخدام وسطاء التهابيين ومعالجتها قميا بالعلاجات الدوائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام أنسجة الفئران الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة بيتسبرغ وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة البحوث والرعاية الحيوانية في جامعة بيتسبرغ و UPMC.

1. التحضير للثقافة

ملاحظة: يتم سرد جميع الكواشف في قسم جدول المواد ويمكن العثور على جميع تركيبات المحلول في جدول تكوين المحلول (الجدول 1).

  1. تحضير وسط غسل الماوس كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت لعزل التشفير 1 (CIB1) كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
    تنبيه: يعتبر Dithiothreitol (DTT) خطيرا وفقا لمعيار اتصالات المخاطر OSHA بسبب السمية الحادة المحتملة إذا تم تناوله وتلف الجلد والعين إذا تعرضت تلك المناطق له. يجب استخدام القفازات الواقية وحماية العين وحماية الوجه عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت لعزل التشفير 2 (CIB2) كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  4. قم بإعداد وسيط مكيف L-WRN وفقا للبروتوكول16 المنشور مسبقا.
  5. تحضير وسط القولون الكامل كما هو موضح في الجدول 1. يمكن تخزين وسط نمو القولون الكامل لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  6. تحضير وسط التمايز كما هو موضح في الجدول 1. تم تعديل هذا البروتوكول من ورقة نشرت سابقا17. يمكن تخزين وسيط التمايز لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  7. تحضير وسيط الالتهاب كما هو موضح في الجدول 1. تم تعديل هذا البروتوكول من ورقة نشرت سابقا18. يمكن تخزين وسيط الالتهاب لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  8. تحضير وسط طبقة الفئران أحادي الطبقة. احذف Y-27632 عند تحدي الطبقات الأحادية بالعوامل الالتهابية و / أو الدواء (الأدوية). يمكن تخزين وسط الفئران أحادي الطبقة لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  9. تحضير وسيط الالتهاب أحادي الطبقة المتوسطة. يمكن تخزين وسيط الالتهاب أحادي الطبقة لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.

2. سرداب العزلة من أنسجة القولون الفئران

ملاحظة: نقل الأنسجة على الجليد. خذ الكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي من التخزين -20 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد. كل 24 بئر مطلية ب 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بإعداد CIB1 و CIB2 ووسط نمو القولون الكامل كما هو موضح في القسم 1.

  1. القتل الرحيم للفأر C57BL / 6J (6-8 أسابيع) وفقا للبروتوكول المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي ، واستخراج الطرف البعيد (حوالي 5-7 سم) من القولون باستخدام ملاقط ومقص نظيف.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم القتل الرحيم للأشخاص باستخدام حضانة غرفة ثاني أكسيد الكربون لمدة 2-3 دقائق متبوعة بخلع عنق الرحم.
    1. لهذا ، ضع الماوس على ظهره ، وقم بعمل شق أفقي أسفل القفص الصدري مباشرة ثم شق عمودي من منتصف الشق الأفقي باتجاه قاعدة الذيل لفضح تجويف البطن.
    2. باستخدام الملقط ، انقل الأمعاء الدقيقة خارج الحقل ، وحدد القولون ، واتبعه وصولا إلى قاعدة الذيل. كسر الحوض بالمقص لكشف القولون البعيد بالكامل إذا لزم الأمر. استخدم المقص لقطع أبعد 5-7 سم من القولون.
  2. ضع أنسجة القولون على سطح نظيف. إزالة الدهون المصلية الزائدة التي تحيط بالقولون. قم بإزالة البراز عن طريق شطف محتويات القولون اللمعية باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) باستخدام حقنة متصلة بإبرة 18 G 1 1/2. ثم ضع القولون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من DPBS المثلج ، وضعه على الثلج.
    ملاحظة: في حالة عزل القولون عن أكثر من واحد ، ضع المنديل على الثلج قبل المتابعة إلى الحيوان التالي.
  3. انقل أنسجة القولون إلى طبق بتري مع 10 مل من DPBS المثلج ، وقم بري التجويف مرتين باستخدام DPBS باستخدام ماصة P1,000.
  4. افتح القولون طوليا باستخدام المقص ، ورجه برفق باستخدام ملاقط لمدة ~ 30 ثانية في DPBS لإزالة أي محتويات برازية متبقية.
  5. انقل المنديل إلى طبق بتري جديد مع 10 مل من DPBS المثلج البارد ، ثم رجه برفق مرة أخرى باستخدام ملاقط قبل تقطيع القولون إلى قطع 2 سم باستخدام المقص ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 7 مل من CIB1 المثلج البارد. احتضان الأنسجة في CIB1 على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المتبقية داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  6. انقل المنديل باستخدام الملقط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل تم تسخينه مسبقا يحتوي على 7 مل من CIB2 ، واحتضانه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. قم بإزالة CIB2 من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل عن طريق ترك الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب المخروطي ثم سحب CIB2. ثم أضف 10 مل من وسط غسيل الماوس المثلج البارد إلى نفس الأنبوب المخروطي.
  8. احصل على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، وضع مرشحا 70 ميكرومتر أعلى الأنبوب المفتوح.
  9. أثناء إمساك الأنبوب بمحتويات القولون ، قم بتدوير اليد حوالي 45 درجة. هز الأنبوب بطريقة هزازة وقوية لمدة 45 ثانية لتحرير الخبايا. بعد ذلك ، صب تعليق القبو من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  10. باستخدام الملقط ، ضع أنسجة القولون مرة أخرى في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل ، وأضف 10 مل من وسط غسيل الفئران المثلج. احصل على مصفاة خلية جديدة 70 ميكرومتر ، وضعها فوق الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على المحلول المصفى السابق.
  11. مرة أخرى ، التقط الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على شظايا القبو ، وقم بهرجه بطريقة مماثلة كما في الخطوة 2.9. قم بتصفية الوسط من خلال مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل لتتحد مع الخبايا التي تمت تصفيتها مسبقا.
    ملاحظة: إذا كان عائد القبو منخفضا ، هز أنسجة القولون مرة إضافية عن طريق وضع الأنسجة في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل مع 10 مل من وسط غسل الماوس. هز المنديل لمدة 45-50 ثانية لتحرير الخبايا. أيضا ، إذا كان عائد القبو منخفضا ، فقم بزيادة قوة الاهتزاز. أخيرا ، إذا كان العائد الإجمالي للسرداب منخفضا ، فيمكن طلاء كل من الماصات والأنابيب بمصل الجنين البقري (FBS) لمنع التصاق الأنسجة بالبلاستيك.
  12. جهاز طرد مركزي أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على أقبية مفلترة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب ملاحظة وجود حبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  13. صب الوسط عن طريق السحب ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 10 مل من وسط غسل الماوس المثلج ، ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. للحصول على مستحضر أنظف ، اغسل الخبايا ب 10 مل إضافية من وسط غسل الماوس. صب الوسط السابق ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل في 10 مل من وسط غسل الماوس. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر عند سحب الوسط لأنه في بعض الأحيان لا يتم طرد الحبيبات بإحكام. إذا لم تكن الحبيبات ضيقة ، فقم بسحب معظم الوسط ، تاركا 500 ميكرولتر إلى 1 مل. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب 10 مل من وسط غسل الماوس ، وانقل المحلول إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يمكن أن يؤدي الطرد المركزي في أنبوب مخروطي أصغر إلى تحسين ضيق الحبيبات.
  15. صب الوسط ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 10 مل من وسط غسيل الماوس المثلج. بمجرد إعادة الشفط ، عد الخبايا تحت مجهر المجال الساطع عن طريق سحب 10 ميكرولتر من الوسط على الفور على شريحة زجاجية.
    1. ضع قطرتين 10 ميكرولتر على طرفي منفصل من الشريحة ، واحسب عدد الخبايا في كل قطرة. متوسط الأرقام بين القططتين لتحديد عدد الخبايا لكل 10 ميكرولتر. اضرب هذا الرقم في 100 لتحصل على عدد الخبايا في 1 مل.
      ملاحظة: للعد الدقيق ، يجب إزالة 10 ميكرولتر من تعليق القبو على الفور بعد التعليق. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسوف تسقط الخبايا في قاع الأنبوب ، مما سيؤدي إلى عدد غير دقيق.
  16. بهدف طلاء 300-500 سرداب لكل بئر ، قم بنقل الحجم المناسب من الخبايا المعاد تعليقها في وسط غسل الماوس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وإحضاره إلى 10 مل باستخدام وسيط غسيل الماوس البارد المثلج. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يجب أن تكون الحبيبات الصغيرة مرئية في أسفل الأنبوب.
  17. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة الطاقة. استخدم ماصة P200 لإزالة أي وسيط متبقي بعناية ، مع ترك الحبيبات فقط.
  18. أعد تعليق الحبيبات بالكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي البارد عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل. احرص على عدم إدخال فقاعات عند تعليق حبيبات القبو. لوحة 300-500 سرداب / 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في كل بئر من الصفيحة. بعد الطلاء ، اقلب لوحة زراعة الأنسجة ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.
  19. أعد اللوحة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى يصبح جاهزا للمرور. مرور القولون كل 3-5 أيام.

3. تمرير القولون

ملاحظة: يمكن تمرير كل بئر بشكل عام من 1: 4 إلى 1: 6 وفقا لكثافة البئر الأصلي. خذ الكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي من -20 درجة مئوية ، وضعها على الثلج لتذوب. يمكن استخدام القولون للتجارب بعد مقطعين. عند تمرير القولون ، يتم تنفيذ الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية لمنع التلوث.

  1. قم بإزالة الوسط من الآبار المراد مرورها.
    1. إذا كان هناك حطام داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ، والذي يمكن أن يحدث أثناء العزل الأولي ، يمكن استخدام البروتوكول التالي لتنظيف الحطام:
      1. أضف 1 مل من ألبومين مصل الأبقار المثلج 0.1٪ (BSA) في DPBS بدون Ca 2+ أو Mg2+ إلى كل بئر. اتركه لمدة 5 دقائق في خزانة السلامة البيولوجية.
      2. ماصة صعودا وهبوطا ثلاث إلى سبع مرات باستخدام ماصة P1000 لتعطيل مصفوفة الغشاء القاعدي ، وجمع محتويات الآبار في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي القولون في ما مجموعه 5-10 مل من 0.1 ٪ BSA في DPBS دون Ca 2+ أو Mg2+. تشكل ما يصل إلى الحجم المناسب مع 0.1 ٪ BSA.
      3. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير القولون ولكن ليس الحطام.
      4. صب DPBS عن طريق السحب ، وترك الحبيبات. أضف 1 مل من كاشف التفكك الأنزيمي بدرجة حرارة الغرفة (RT) ، والماصة ثلاث إلى خمس مرات.
      5. ضع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل مع كاشف التفكك الأنزيمي والقولون المعطل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق.
      6. أخرج الأنبوب من الحمام المائي ، ماصة 3-5 مرات ، ثم احضره إلى 10 مل باستخدام وسيط غسل الماوس. انتقل إلى الخطوة 3.6.
  2. ضع 500 ميكرولتر من كاشف التفكك الأنزيمي RT في كل بئر ، واتركه لمدة 1 دقيقة تقريبا قبل السحب لأعلى ولأسفل ثلاث إلى سبع مرات لتعطيل مصفوفة الغشاء القاعدي.
  3. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق.
  4. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى سبع مرات باستخدام ماصة P1000 لفصل القولون.
  5. انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واصنع ما يصل إلى 10 مل باستخدام وسط غسيل الماوس المثلج.
  6. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة الوسيط باستخدام ماصة طاقة وماصة P200 حسب الحاجة بحيث يتم ترك حبيبات فقط في الأنبوب المخروطي.
  8. أعد التعليق بكمية مناسبة من مصفوفة غشاء القاع البارد عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل وفقا لعدد الآبار التي سيتم طلائها. لا تدخل فقاعات عند الماصة. ضع شظايا القولون في 15 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر.
  9. قم بلوحة الخبايا ، واقلب لوحة زراعة الأنسجة ، ثم ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.
  10. أخيرا ، أعد اللوحة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر. قم بتغيير الوسط كل يوم حتى ينمو بشكل كبير بما يكفي ليتم تمريره مرة أخرى في حوالي 3-5 أيام.

4. التفريق النهائي بين خلايا القولون

  1. قم بتمرير القولون على النحو الوارد أعلاه ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر.
  2. بعد 48 ساعة على الأقل من المرور ، قم بإزالة وسط القولون الكامل للفأر ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط المتمايز إلى كل بئر (انظر القسم 1).
  3. احتضان القولون مع وسائط التمايز لمدة 48 ساعة ، وبعد ذلك يمكن استخدامها في التجارب ، بما في ذلك جمع الحمض النووي الريبي والبروتين.
    ملاحظة: يمكن تقييم القولون للتمايز عن طريق جمع الحمض النووي الريبي وتقييم التعبير عن Lgr5 و Ki67 ، علامة الخلايا الجذعية وعلامة تكاثر الخلايا ، على التوالي ، عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qPCR). يجب أن يكون للخلايا المتمايزة نهائيا تعبير منخفض نسبيا عن Lgr5 و Ki67 مقارنة بالقولون المزروع في وسط القولون التقليدي ، حيث تكون الخلايا أكثر شبها بالساق. قد تحتاج المدة الزمنية التي تحتاجها القولون إلى الاحتضان في وسط التمايز إلى تحسينها لكل مختبر على حدة. ارجع إلى الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة الاشعال .

5. إحداث التهاب في القولون المتمايز مع وسطاء التهابيين

  1. بعد تحضين القولون لمدة 2-3 أيام باستخدام وسيط التمايز ، قم بإزالة الوسط الموجود ، وأضف 500 ميكرولتر من وسيط الالتهاب إلى كل بئر.
  2. اسمح للآبار بالاحتضان لمدة 24-72 ساعة قبل جمع الحمض النووي الريبي والبروتين (أو تقييم معلمات المصب الأخرى). تغيير الوسيط كل يوم.

6. أحاديات الطبقة الظهارية المعوية المشتقة من القولون الفئران المعمول بها

ملاحظة: تستمد الطبقات الظهارية المعوية للفئران من قولون الفئران التي تم تمريرها مرتين على الأقل. للسماح بتكوين أحادي الطبقة بنجاح في 3-5 أيام ، من الضروري عدم فصل القولون إلى خلايا مفردة. تعتبر المواد العضوية المجزأة التي تم فصلها إنزيميا إلى مجموعات خلوية مثالية للنمو.

  1. تحضير جميع الكواشف قبل بدء التجربة. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تحضير وسط طبقة الفئران الأحادي كما هو موضح في القسم 1. تمييع الغشاء القاعدي المذاب 1:20 مع وسط أحادي الطبقة الفئران الباردة. ابق على الجليد.
  2. استخدم ملقط معقم لوضع إدخال مزرعة خلية شفافة 0.4 ميكرومتر في بئر واحدة من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا (جدول المواد). أمسك بشق زاوية من الملحق ، وانقله إلى البئر. كرر حتى يتوفر العدد المناسب من إدخالات زراعة الخلايا للثقافة.
    ملاحظة: تأكد من طلاء بئر تحكم إضافي بمصفوفة الغشاء القاعدي فقط. سيتم استخدام ملحق زراعة الخلية هذا لقياس مقاومة الخلفية لإدراج زراعة الخلية بدون وجود خلايا ، كما هو موضح في الخطوة التالية (الخطوة 6.3).
  3. باستخدام ماصة P200 ، قم بتغطية السطح القمي (العلوي) لكل ملحق مزرعة خلية ب 150 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف. ضع طرف الماصة في وسط الملحق دون لمس غشاء الملحق ، واطرد المحلول برفق. ضع اللوحة في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة على الأقل.
  4. قم بإزالة مصفوفة الغشاء القاعدي برفق قبل الاستخدام ، واترك إدخالات زراعة الخلايا تجف في خزانة أمان بيولوجي لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
    1. لإزالة مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بتدوير لوحة 24 بئرا بزاوية 45 درجة. ضع إصبعا واحدا على زاوية الشق لتثبيت الإدخال ، وباستخدام ماصة P200 ، ضع طرف الماصة برفق على طول الجانب السفلي من الملحق وقم بإزالة المصفوفة.
    2. قم بإزالة أي بقايا زائدة عن طريق غسل كل ملحق مزرعة خلية ب 150 ميكرولتر من DPBS المعقم بدون Ca 2+ أو Mg2+.
  5. بعد 10 دقائق من التجفيف ، أضف 400 ميكرولتر من وسط طبقة الفئران الأحادية إلى أسفل ملحق زراعة الخلية و 75 ميكرولتر في الأعلى. كرر حتى يتم غمر جميع إدراج ثقافة الخلية. اترك اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية ، أو ضعها مرة أخرى في الحاضنة لحين الحاجة.
  6. قم بإزالة الصفيحة المكونة من 24 بئرا من القولون المعوي الناضج (العضويات في اليوم 3-5 من النمو) من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، وضعها تحت خزانة السلامة البيولوجية. قم بإزالة الوسط باستخدام أطراف معقمة ، واغسل كل بئر ب 1 مل من RT DPBS المعقم (بدون Ca 2+ أو Mg2+).
    ملاحظة: يتم تقسيم بئر فردي من 75-125 القولون الناضج بنسبة 1: 4.
  7. قم بإزالة DPBS بدون Ca 2+ أو Mg2+ باستخدام أطراف معقمة ، وقم بهضم كل سدادة من مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق وضع 500 ميكرولتر من كاشف التفكك الأنزيمي RT في كل بئر يتم مروره.
  8. ماصة كل بئر صعودا وهبوطا حوالي 6-10 مرات لتفتيت القابس. لا تخدش الجزء السفلي من اللوحة لإزالة القابس. بدلا من ذلك ، قم بتدوير اللوحة المكونة من 24 بئرا بزاوية 45 درجة ، ضع طرف الماصة على حافة القابس ، وقم بإزاحتها برفق.
  9. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا مرة أخرى في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 3-4 دقائق.
  10. قم بإزالة اللوحة ، وقم بسحب كاشف التفكك الأنزيمي لأعلى ولأسفل من خمس إلى سبع مرات لكل بئر تحت خزانة السلامة البيولوجية. انقل القولون المنفصل من كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. أحضر ما يصل إلى 10 مل مع وسط غسيل الماوس البارد المثلج.
  11. أجهزة الطرد المركزي القولون المهضومة جزئيا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح.
  12. تحت خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة المادة الطافية من الحبيبات باستخدام ماصة سعة 10 مل. قم بإزالة أي وسيط متبقي باستخدام ماصة P200. أعد تعليق حبيبات القولون في وسط أحادي الطبقة للفئران. أضف 75 ميكرولتر من الوسط لكل إدراج مزرعة خلية من القولون المجزأ المراد طلائه.
  13. أضف 75 ميكرولتر من معلق القولون إلى مركز كل إدراج لمزرعة الخلية. قبل إضافة تعليق القولون إلى كل بئر ، قم بالسحب برفق لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين قبل إزالة 75 ميكرولتر ، مما يسمح بطلاء أكثر اتساقا.
  14. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات زراعة الخلايا على منصة دوارة لمدة 10 دقائق للسماح بمزيد من التشتت المنتظم عبر إدخال زراعة الخلية.
  15. ضع اللوحة في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  16. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بإزاحة شظايا القولون غير المرفقة عن طريق سحب الوسط لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة P200. ضع الطرف برفق بجانب الجزء الداخلي من ملحق زراعة الخلايا حتى لا يعطل الخلايا المعوية المرفقة. لا تدخل فقاعات في الوسط ، لأن هذا يمنع إزالة جميع الأجزاء غير المرفقة.
  17. قم بإزالة الخليط المتوسط والقولون على الفور. كرر حتى يتم تنظيف جميع إدخالات زراعة الخلايا.
  18. أضف برفق 150 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة المريء المسخن مسبقا إلى الجانب القمي لكل ملحق لزراعة الخلايا. أضف 400 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة الدافئ للفأر إلى كل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا. انقل ملحق زراعة الخلايا إلى اللوحة الجديدة عن طريق الإمساك بالشق باستخدام ملقط معقم. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى التقاء.
    ملاحظة: يجب أن تشكل شظايا القولون طبقة أحادية متقاربة بعد 3-5 أيام من الطلاء.

7. قياس المقاومة الصافية للطبقات الأحادية الظهارية باستخدام مقياس الفولتوم في الأيام 3 - 5 من الاستزراع أحادي الطبقة

ملاحظة: تشبه أقطاب عيدان تناول الطعام الملقط وهي غير متماثلة في الطول. الذراع الأطول للمسبار هو القطب القاعدي ، والذراع الأقصر هو القطب القمي. قد يكون من الصعب إدخال المسبار بين الجزء الداخلي والخارجي من ملحق زراعة الخلية. إن وضع المسبار بزاوية طفيفة عند الإدخال ، متبوعا بالاستقامة الرأسية للمسبار ، سيمنع المسبار من التعثر. تأكد من قراءة المقاومة الصافية لكل إدراج مزرعة خلية بزاوية مماثلة ، حيث يمكن أن يؤثر ذلك على القيم.

  1. ضع مقياس الفولتومتر وجميع الكواشف داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    1. قم بتوصيل مقياس الفولتومتر بأقرب منفذ تيار متردد ، وقم بتوصيل الموصل المعياري البلاستيكي لمسبار القطب بمقبس INPUT على الشاشة الأمامية.
    2. لوضع مقياس الفولتوم بزاوية 45 درجة ، قم بتدوير الذراع المعدني على الجانب الخلفي من الجهاز للخارج حتى يستقر في مكانه.
    3. الآن ، قم بتشغيل مقياس الفولتوم عن طريق قلب مفتاح الطاقة لأعلى على الشاشة الأمامية. أخيرا ، اقلب المفتاح لأعلى باتجاه OHMS لعرض القراءة في هذا المقياس.
  2. قم بإزالة لوحة 24 بئرا من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، ووضع اللوحة بشكل مسطح في خزانة السلامة البيولوجية. المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) حساسة لدرجة الحرارة. قم بإزالة اللوحة فقط قبل قراءة TEER مباشرة.
  3. تعقيم مسبار القطب في الإيثانول المسخن مسبقا بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. قم بإزالة المسبار ، واقلبه ، ونفضه مرة إلى مرتين لإزالة الإيثانول الزائد. اترك المسبار يجف في الهواء لمدة 30 ثانية تقريبا.
  4. اغسل أي إيثانول متبقي على المسبار باستخدام وسيط غسيل الماوس المسخن مسبقا.
    تنبيه: لا تدع أيا من قطرات الإيثانول المتبقية أعلى المسبار تسقط في ملحق مزرعة الخلية. عند غسل الإيثانول بوسط ، لا تدع الوسط يتجاوز حقل الإيثانول المعقم. قد يتسبب ذلك في دخول الوسط الملوث إلى إدخال مزرعة الخلية.
  5. امسك المسبار بشكل عمودي على إدراج ثقافة الخلية. أدخل القطب القاعدي الجانبي (الطرف الأطول من المسبار) على السطح الخارجي لمزرعة الخلية حتى يلامس قاعدة لوحة 24 بئرا. حرك القطب القمي (الطرف الأقصر للمسبار) في ملحق زراعة الخلية. لا تغير مسافة القطبين من بئر إلى بئر. سيؤثر هذا على قياس TEER.
  6. تحقق من أن القطب القمي لا يلامس قاعدة ملحق زراعة الخلية قبل قراءة TEER. ابدأ بإدراج ثقافة خلية التحكم في الخلفية ، وقم بتسجيل القيمة. سيتم عرض القيمة تلقائيا رقميا في مقدمة مقياس الفولتومتر.
  7. كرر الخطوات من 7.5 إلى 7.6 لكل إدراج لمزرعة خلية.
    ملاحظة: في حالة وجود ظروف تجريبية مختلفة بين إدخالات زراعة الخلايا ، قم بتعقيم المسبار بين كل حالة جديدة. ابدأ في الخطوة 7.1 ، وتابع عدديا خلال الخطوات.
  8. ضع لوحة 24 بئرا مرة أخرى في الحاضنة بمجرد تسجيل جميع قياسات TEER.
  9. تشير القيم الصافية عند 350 Ω أو أكثر إلى تكوين طبقة واحدة. كرر مرة أخرى في الأيام اللاحقة حتى يتم تحقيق تكوين أحادي الطبقة.
    ملاحظة: بشكل عام ، يمكن التقاط قيم 1000 Ω أو أكثر في اليوم 3 ، ولكن بمرور الوقت ، سوف تتقارب جميعها على رقم أقل حوالي 350 Ω.

8. حساب TEER باستخدام قياسات المقاومة الصافية من مقياس الفولتومتر

ملاحظة: سيعطي التكوين الناجح أحادي الطبقة للقولونويدات قياسات TEER أكبر من 115 Ω سم2.

  1. خذ قيم المقاومة الصافية الفردية ، واطرح صافي المقاومة من الخلفية جيدا. ستعطي إدخالات زراعة الخلايا المطلية بغشاء مصفوفة القاعدية قراءة صافية تبلغ حوالي 100 Ω.
  2. خذ قياسات المقاومة الصافية المطروحة في الخلفية ، واضربها في مساحة سطح ملحق زراعة الخلية. تبلغ مساحة سطح ملحق زراعة الخلايا المكون من 24 بئرا 0.33 سم2.
  3. إذا كانت القيم 115 Ω سم2 أو أكبر ، فانتقل إلى المقايسات التجريبية النهائية.

9. إحداث التهاب في أحاديات الظهارة مع وسطاء التهابيين

  1. بمجرد تشكيل أحاديات الطبقة الناجحة ، أضف وسطاء التهابيين إلى الثقافة على الجانب القاعدي من الثقافة. قم بإعداد وسط أحادي الطبقة لوسيط الالتهاب ، كما هو موضح في الخطوة 1.9 ، وأضف 400 ميكرولتر إلى كل بئر في لوحة جديدة مكونة من 24 بئرا.
  2. قم بإزالة الوسط من الجانب القمي لإدخال زراعة الخلية ، وأضف 150 ميكرولتر من وسط طبقة الفئران الأحادية بدون Y-27632. لا تكمل هذا الجانب مع وسطاء التهابية. ومع ذلك ، إذا كان موت الخلية يبدو مفرطا ، فاترك Y-27632 في وسائل الإعلام. يجب تحديد ذلك من قبل المستخدم النهائي.
  3. انقل إدخالات زراعة الخلايا إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا ، وضعها في الآبار المكملة بوسط أحادي الطبقة وسيط الالتهاب.
  4. تحفيز أحادي الطبقات مع وسطاء التهابية لمدة 24-72 ساعة ، وهذا يتوقف على التجربة.
  5. لاختبار الاستجابات الدوائية باستخدام هذا النموذج الالتهابي ، استكمل الوسط أحادي الطبقة على الجانب القمي من إدراج مزرعة الخلية بالدواء المفضل. يمكن إضافة الدواء في أي مرحلة من التجربة ، اعتمادا على آلية عمل الدواء والمعلمات النهائية المراد تقييمها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظام ثقافة القولون المعوي 3D هو أداة لا تقدر بثمن لدراسة المساهمة الجوهرية للظهارة في توازن الغشاء المخاطي في الأمعاء. يوفر البروتوكول الموصوف تعليمات مفصلة حول كيفية عزل الخبايا من الفئران C57BL / 6J (WT) في عمر 8 أسابيع وإنشاء نظام زراعة القولون طويل الأجل يمكن معالجته لتطبيقات متعددة في المصب. عند عزل وطلاء الخبايا في مصفوفة الغشاء القاعدي ، تظهر الخبايا كثيفة ومتعددة الخلايا في الهيكل عند تصورها بواسطة المجهر مشرق المجال. يمكن أن تكون كروية الشكل أو ممدودة وأسطوانية ، تشبه البنية المفردة التي تشبه القبو والتي يتم ملاحظتها عادة داخل بنية الأمعاء في الجسم الحي (الشكل 1 أ). بحلول اليوم الأول ، تشكل غالبية الخبايا بنية كروية مدمجة ، مع بدء عدد قليل من القولون في تطوير تجويف داخلي (مساحة فارغة) خال من الخلايا الظهارية (الشكل 1 ب). مع استمرارها في النمو خلال الأيام القليلة القادمة ، تستمر أقطار القولون في الزيادة ، وتصبح لومن القولون أكثر تحديدا (الشكل 1C). بحلول اليوم 5 ، يبلغ قطر كل قولون حوالي 100-250 ميكرومتر ، ويشكل تجويفا كبيرا وبارزا محاطا بطبقة رقيقة من الخلايا الجذعية الظهارية (الشكل 1 د). في هذه المرحلة ، يتم تعطيل القولون إنزيميا وميكانيكيا للمرور. بعد مقطعين ، يمكن استخدامها للتجريب النهائي.

لتقييم ما إذا كانت التغيرات الأيضية التي لوحظت في كشط القولون للفئران المعالجة ب DSS يتم الاحتفاظ بها في القولون المشتق من الفئران على نفس نظام DSS ، تم علاج الفئران WT البالغة من العمر 8 أسابيع ب 2٪ DSS في مياه الشرب ad libitum. أعطيت الحيوانات الضابطة WT المتطابقة مع العمر والمتطابقة بين الجنسين مياه الشرب حسب الطلب بدون DSS. بعد 7 أيام ، تم التضحية بالفئران ، وتم عزل الخبايا من قولون كل من المجموعة الضابطة (ن = 3 ، ذكر) والحيوانات المعالجة ب DSS (ن = 3 ، ذكر) لإنشاء القولون. بعد مقطعين ، تم عزل البروتين من كل مجموعة من القولون ، وتم تقييم التعبير عن مستقبلات التكاثر البيروكسيسوم المنشط - منشط غاما - 1α (PGC1α) ، وهو البروتين المنظم الرئيسي للتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، عن طريق تحليل اللطخة الغربية (الشكل التكميلي 1). لم يكن هناك فرق كبير في تعبير PGC1α عند مقارنة القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المعالجة ب DSS مقابل القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران الضابطة ، مما يشير إلى أن منهجية زراعة القولون هذه لا تعكس بشكل مناسب التغيرات الأيضية في الجسم الحي التي لوحظت في الفئران15.

إن فشل PGC1α في بدء التكوين الحيوي للميتوكوندريا أثناء الإهانة الالتهابية المعوية يتوضع بشكل أساسي في ظهارة القولون المتمايزة15,19. لعكس التغييرات التي لوحظت في الجسم الحي ، قررنا توجيه القولون نحو حالة أكثر تمايزا. للحث على هذا التحول ، تم تحضين القولون في البداية بوسط القولون التقليدي. بعد 24 ساعة إلى 48 ساعة ، تم تحويل القولون إلى وسط تمايز لمدة 48 ساعة إضافية. أثناء التمايز ، انتقلت نسبة صغيرة من القولون من بنية كروية إلى هياكل ناشئة غنية بالخلايا الكأسية وخلايا القولون17 (الشكل 2 أ ، ب). تم إثراء القولونويدات المزروعة في وسط مكمل ب WRN بخلايا جذعية Lgr5 + سريعة الانقسام. للتأكد من أن كلا من الخلايا الجذعية Lgr5 + والخلايا المتكاثرة الأخرى خرجت من دورة الخلية أثناء التمايز ، تم تحليل مستويات mRNA عبر qPCR. لوحظ انخفاض كبير في التنظيم في كل من مستويات Lgr5 (97٪ ، p = 0.0023) و Ki67 (75٪ ، p = 0.0007) في القولون المتمايز (n = 6) مقارنة بالقولون المزروع في بيئة الثقافة التقليدية (n = 6; الشكل التكميلي 2 أ ، ب). يتوقع المرء أيضا أن تتكون القولونات المتمايزة بشكل أساسي من خلايا كأسية تفرز المخاط. بالإضافة إلى ذلك ، في الواقع ، تم تنظيم MUC2 مرتين تقريبا في القولون المتمايز مقارنة بنظيراتها المزروعة تقليديا (n = 3 ، p = 0.0433 ، الشكل التكميلي 3). عند أخذها معا ، تشير هذه البيانات إلى أن القولون قد تم تمايزه بنجاح وكان جاهزا للتجارب النهائية. بعد ذلك ، تمت إضافة وسطاء التهابيين إلى وسط التمايز ، كما هو موضح في القسم 5 من البروتوكول. تم جمع البروتين والحمض النووي الريبي حتى 72 ساعة بعد إدخال الوسطاء الالتهابيين للتحليل. ومع ذلك ، في 72 ساعة ، لوحظ في بعض الأحيان زيادة موت الخلايا.

لتقييم ما إذا كان إدخال الوسطاء الالتهابيين إلى القولون المتمايز يمكن أن يحاكي فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا الذي لوحظ في كل من مرض التهاب الأمعاء البشري ونموذج حاد من التهاب القولون الفئران ، تم تقييم تعبير البروتين ل PGC1α وعامل النسخ A ، الميتوكوندريا (TFAM) عن طريق تحليل اللطخة الغربية في القولون المتمايز (ن = 5) المعالج بوسطاء التهابيين أكثر من 72 ساعة. وقد تبين أن تعبير PGC1α ينخفض في نماذج الفئران من التهاب القولون ، وكذلك في مرض التهاب الأمعاءالبشري 15. كما تبين أن TFAM ، وهو بروتين يقود كلا من نسخ وتكرار جينوم الميتوكوندريا ، قد انخفض في نماذج الفئران من التهاب القولون ، وقد ثبت أن تعبيره الجيني ينخفض في مرض التهاب الأمعاء البشري15,20. لاحظنا انخفاضا مماثلا في كل من PGC1α (50.4٪ ، p = 0.0442) و TFAM (88.9٪ ، p = 0.004) في القولون المتمايز بعد 72 ساعة من التعرض لهذه الوسطاء الالتهابية (الشكل 3). بشكل جماعي ، يشير هذا إلى أن علاج القولون المتمايز بالسيتوكينات هو نموذج مثالي لدراسة ديناميكيات الميتوكوندريا في المختبر.

في حين يمكن فحص الوظائف الخلوية والجزيئية المختلفة في إعدادات ثقافة القولون 3D ، فإن أنظمة الثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد متفوقة عند تقييم وظيفة الحاجز ، والتفاعلات بين المضيف والممرض ، وتأثير العلاجات الممتصة عن طريق الفم على الالتهاب21,22. يسمح تكوين طبقة مستمرة من الخلايا المتقاربة ذات الحاجز السليم بوضع عوامل بيولوجية أو كيميائية مختلفة على الجانب القمي و / أو القاعدي للخلايا بسهولة. يسمح هذا البروتوكول بإنشاء ثقافات أحادية الطبقة 2D من مستعمرات WT الموجودة مسبقا والتي تم تمريرها مرتين. يتم طلاء القولون الذي تم تعطيله إنزيميا وميكانيكيا على إدخالات زراعة الخلايا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي. عند الطلاء الأولي ، تظهر القولونات المجزأة في مجموعات خلوية تتراوح من 15 إلى 150 خلية (الشكل 4 أ). بحلول اليوم 3 ، بدأت الخلايا في التسطيح وتغطي ببطء إدخال مزرعة الخلية ، وتصل بشكل عام إلى نقطة التقاء (الشكل 4 ب). خلال اليومين المقبلين ، تستمر الطبقات الأحادية في النمو وتشكل حاجزا مستمرا يمكن قياسه كميا بواسطة TEER (الشكل 4C ، D). ومن المثير للاهتمام أن قياسات TEER تتقلب خلال اليوم 3 إلى اليوم 5. تحتوي الطبقات الأحادية على قيم أعلى في وقت سابق مع نطاق واسع (200-800 Ω سم 2) ، لكن هذه القيم تتقارب ببطء على رقم أقل بحلول اليوم 5 (115-150 Ω سم2 ، الشكل 5 أ). عندما تصل الطبقات الأحادية إلى حالة مستقرة ، يمكن استخدامها للتجربة النهائية.

لتوصيف الاستجابة الظهارية للطبقات الأحادية المشتقة من القولون للالتهاب ، تم وضع وسطاء التهابيين على الجانب القاعدي (خارج الإدراج) للخلايا لمدة 48 ساعة. تم استخراج الحمض النووي الريبي ، وتم تحليل مستويات mRNA لمختلف علامات تمايز الخلايا الجذعية والخلوية ، وكذلك البروتينات الموصلية ، عبر qPCR. لم يتم الكشف عن Lgr5 في أي من الحالتين ، ولكن تم تقليل علامة أخرى للخلايا الجذعية ، mTERT ، بنسبة 60٪ تقريبا في الطبقات الأحادية الملتهبة مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة (الشكل التكميلي 4A). بعد ذلك ، قمنا بتحليل التعبير عن علامتين لأنواع الخلايا المتمايزة ، Muc2 والفوسفاتيز القلوي (Alpi). كانت كل من نسخ mRNA أقل في الطبقات الأحادية الملتهبة مقارنة بالخلايا الضابطة (الشكل التكميلي 4A). عادة ما يتم تقليل كل من الخلايا الجذعية وما بعد الانقسام أثناء التهاب القولون23،24،25 ، وقد لوحظت استجابة مماثلة في نموذج الطبقة الأحادية الذي تم الحصول عليه في هذه الدراسة.

تتمثل إحدى مزايا النظام أحادي الطبقة في القدرة على تقييم استجابة الحاجز. لتحديد ما إذا كان الحاجز قد تعرض للخطر في حالة التحفيز المناعي ، قمنا بقياس قيم TEER بعد 48 ساعة. بلغ متوسط قيم TEER للطبقات الأحادية الضابطة (n = 2) 129.16 Ω سم 2 ولكنها انخفضت بشكل ملحوظ (p = 0.0087) إلى متوسط 98.54 Ω سم2 في الطبقات الأحادية الملتهبة (الشكل 5B). لمزيد من التأكيد على أن الحاجز قد تعرض للخطر في الحالة الالتهابية ، قمنا بتقييم مستويات mRNA لثلاث علامات تقاطع ضيقة مختلفة ، Zo-1 و Occludin و Claudin. وقد انخفضت مستويات جميع العلامات الثلاثة في الحالة الملتهبة مقارنة بنظيراتها غير الملتهبة (الشكل التكميلي 4 ب). بشكل جماعي ، تظهر هذه البيانات أن خلل الحاجز موجود في الطبقات الأحادية الملتهبة ويحاكي خلل الحاجز الذي لوحظ أثناء التسبب في مرض التهاب الأمعاء.

Figure 1
الشكل 1: العزل الأولي لأقبية الفئران لإنشاء ثقافة القولون طويلة الأجل. (أ) في اليوم 0 ، تم طلاء 300-500 سرداب في مصفوفة غشاء القاعدية (تم الحصول على الصورة بعد 5 ساعات من الطلاء) ، وتم التقاط نمو القولون في (ب) اليوم 1 و (ج) اليوم 3 و (د) اليوم 5. في اليوم 5 ، كانت القولون جاهزة للمرور. التكبير = 10x ؛ شريط المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إنشاء كولونويدات متمايزة نهائيا من ثقافة القولون التقليدية. تم وضع وسط التمايز على القولون 48 ساعة بعد مرور القولون الفأر. بعد (أ) 24 ساعة و(ب) 48 ساعة، تخصب القولونويدات بخلايا متمايزة نهائيا. التكبير = 10x ؛ شريط المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تعبير بروتين PGC1α و TFAM في القولون المتمايز للفئران المعالج بوسطاء التهابيين. تم وضع الوسط المكمل بوسطاء التهابيين على القولون المتمايز ، وتم جمع البروتين بعد 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من التعرض. (أ) أظهر التعبير البروتيني ل PGC1α انخفاضا معنويا بشكل عام (p = 0.0442) خلال 72 ساعة. تم تخفيض تنظيم TFAM بشكل كبير (p = 0.004) بعد التعرض للوسطاء الالتهابيين عند 72 ساعة ، و (B) كان هناك اتجاه هبوطي في تعبير البروتين عند 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة عند تحليلها بواسطة ANOVA. البيانات المعروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري. * p < 0.05 ، ** p < 0.005. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تكوين ونمو الطبقات الأحادية من القولونيات الموجودة مسبقا. تم طلاء القولون الذي تم تعطيله إنزيميا وميكانيكيا على إدخالات زراعة الخلايا المغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي. عند الطلاء الأولي ، ظهرت القولونات المجزأة في (أ) مجموعات خلوية ، وبحلول (ب) اليوم 3 ، بدأت في التسطيح وتغطي ببطء إدخال مزرعة الخلية. (ج) في اليوم 5 و (د) اليوم 7 ، استمرت الطبقة الأحادية في النمو لتشكيل حاجز مستمر يمكن قياسه كميا بواسطة TEER. التكبير = 10x ؛ شريط المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قيم TEER لإنشاء أحاديات الطبقات المشتقة من القولون والطبقات الأحادية الملتهبة. (أ) تم قياس قيم TEER باستخدام مقياس الفولتومتر من اليوم 3 إلى اليوم 5. كان للطبقات الأحادية قيم أعلى في وقت سابق مع نطاق واسع ولكنها تقاربت ببطء على رقم أقل بحلول اليوم 5. بمجرد أن تصل الطبقات الأحادية إلى حالة مستقرة ، يمكن استخدامها للتجارب النهائية. (ب) كانت قيم TEER أقل في الطبقات الأحادية الملتهبة (n = 2) مقارنة بالضوابط غير الملتهبة (n = 2). كان متوسط TEER للطبقات الضابطة 129.16 أوم · سم 2 ، وكان TEER للطبقات الأحادية الملتهبة أقل بكثير (p = 0.0087) ، بمتوسط 98.54 Ω · سم2 ، عند تحليلها باستخدام اختبار t. ** ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: جدول تكوين الحل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي 1: تعبير بروتين PGC1α في قولون الفئران المزروع في وسط القولون التقليدي المعزول من عناصر التحكم في WT والفئران المعالجة ب 2٪ DSS. تم اشتقاق القولون من كل من الفئران الضابطة WT البالغة من العمر 8 أسابيع والفئران المعالجة ب 2٪ DSS بعد 7 أيام. تم عزل البروتين من القولون الذي تم تمريره مرتين وفي اليوم 4 بعد الطلاء. لم يكن هناك فرق في تعبير بروتين PGC1α (p = 0.9996) في القولون المشتق من الفئران الضابطة مقارنة بالفئران المعرضة ل 2٪ DSS لمدة 7 أيام عند تحليلها بواسطة اختبار t غير مزاوج. البيانات المعروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: انخفاض تعبير Lgr5 و Ki67 mRNA في القولون المتمايز. تعرضت قولون الفئران التي مرت قبل 48 ساعة لوسط التمايز لمدة 48 ساعة قبل عزل تخليق الحمض النووي الريبي والحمض النووي الكيميائي. تم تحديد مستويات mRNA عبر qPCR وتحليلها بطريقة التصوير المقطعي المقارن. (A) انخفض Lgr5 و (B) Ki67 بشكل ملحوظ في القولون المتمايز عند تحليله إحصائيا باستخدام اختبار t (p = 0.0023 ، p = 0.0007). البيانات المقدمة كمتوسط ± الانحراف المعياري.** p < 0.005. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: زيادة الخلايا الكأسية المفرزة للميوسين في قولون الفئران المتمايزة. تعرضت قولون الفئران التي مرت قبل 48 ساعة لوسط التمايز لمدة 48 ساعة. تم تحليل الخلايا في مخزن RIPA المؤقت ، وتم تصور البروتين عن طريق تحليل اللطخة الغربية. (أ) زاد تعبير MUC2 في كل مجموعة من القولونويدات المتمايزة مقارنة بالقولون غير المتمايز. (ب) لوحظ تغير مزدوج تقريبا في بروتين MUC2 في ظروف التمايز ، والذي كان مهما عند تحليله باستخدام اختبار t (p = 0.0433). البيانات المعروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري. * ص < 0.05. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: انخفاض التعبير عن علامات الساق والتمايز ، وكذلك علامات الوصلات الضيقة ، في أحاديات الطبقات المعالجة بوسطاء التهابيين. تعرضت الطبقات الأحادية المشتقة من القولون (اليوم 5) لوسطاء التهابيين لمدة 48 ساعة ، وتم جمع الحمض النووي الريبي لاحقا ، وتم تصنيع cDNA (n = 2). تم تحديد مستويات mRNA للساق والتمايز وعلامات الوصلات عبر qPCR وتحليلها بطريقة التصوير المقطعي المقارن. (أ) لم يتم الكشف عن علامة الخلايا الجذعية ، Lgr5 ، في أي من الحالتين ، ولكن تم تقليل mTERT بشكل كبير في الحالات الالتهابية. تم تقليل كل من علامة الخلية الكأسية ، Muc2 ، وعلامة القولون ، Alpi ، في الطبقات الأحادية الملتهبة مقارنة بالطبقات الأحادية غير المعالجة. (ب) كانت علامات الوصلة الضيقة ، Zo-1 و Occludin و Claudin ، أقل في الطبقات الأحادية المعالجة للالتهابات مقارنة بالسيطرة. البيانات المعروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: قائمة الاشعال. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحدث تطور المواد العضوية ثورة في الطريقة التي يدرس بها المجتمع العلمي أنظمة الأعضاء في المختبر مع القدرة على تلخيص البنية الخلوية والوظيفة جزئيا من أو إنسان في طبق. علاوة على ذلك ، توفر الأنظمة العضوية المشتقة من البشر المصابين بأمراض أداة واعدة للطب الشخصي الذي يمكن أن يوجه عملية صنع القرار العلاجي. هنا ، نصف بروتوكول عزل القبو الذي يعمل بشكل جيد ويقدم خطوات رئيسية تسمح بتنظيف الحطام الزائد في العزل قبل الطلاء. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح التفاصيل الرئيسية التي غالبا ما يتم تجاهلها في العملية - القدرة على حساب الخبايا بدقة للطلاء. بمجرد إنشاء القولون ، نحدد التلاعبات الرئيسية التي تسمح بالتمايز الخلوي أو تكوين طبقة واحدة ، والتي يمكن أن تعزز القدرة على دراسة التغيرات في ظهارة الأمعاء أثناء مرض التهاب الأمعاء.

محور الزغابات في ظهارة القولون في الثدييات هو بنية معقدة تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا ذات وظائف مختلفة. يتوقف الحفاظ على هذا المحور على كل من العوامل الخلوية الداخلية والخارجية ، والتي تساعد معا في الحفاظ على التوازن الظهاري18. لقد لاحظنا أن قولون الفئران المزروع في الوسط التقليدي يعكس في المقام الأول الخلايا الجذعية بدلا من تكتل كل من الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة نهائيا التي تظهر في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن قولون الفئران الذي ينمو ويتم الحفاظ عليه بهذه الطريقة عبارة عن هياكل دائرية بدلا من الطبقات الأحادية المسطحة. هذه الاختلافات لها آثار محتملة على محاولاتنا لدراسة الأمراض المعوية في المختبر. على وجه التحديد ، نحن محدودون في قدرتنا على استخدام المواد العضوية لدراسة التغيرات في وظيفة الحاجز ، وكذلك آثار الالتهاب على الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة نهائيا.

هنا ، نصف بروتوكولات ليس فقط لعزل خبايا الفئران لزراعة القولون ولكن أيضا لمعالجة هذه القولونات لدراسة فسيولوجيا الظهارة المعوية والاستجابة الظهارية للالتهاب. من بين العديد من العوامل الخارجية التي تعزز تدرج الخلايا الجذعية متعددة القدرات والخلايا المتمايزة نهائيا هو مسار Wnt الكنسي ، وهو غني بالخبايا ويعزز صحة الخلايا الجذعية. تتضاءل إشارات Wnt عند طرف محور القبو ، بالتزامن مع تطور الخلايا الجذعية إلى خلايا متمايزة نهائيا26. لقد وصفنا بروتوكولا يسمح بالتمايز النهائي لخلايا القولون. مثل الآخرين ، نفرق عن طريق إزالة Wnt من وسط النمو ، لكننا نستخدم تركيزا أقل من R-spondin (500 نانوغرام / مل مقابل 1 ميكروغرام / مل R-spondin) 17. والمثير للدهشة أن انخفاض 50٪ في R-spondin لا يؤثر على التمايز الناجح للعضويات. تساعد القدرة على التمايز بتركيز أقل في إنشاء نظام أقل اصطناعية قد يشبه إلى حد كبير البيئة الفسيولوجية في الجسم الحي. على الرغم من أن هذا البروتوكول يؤدي إلى تمايز طرفي محدود (الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3) وعدم القدرة على الحفاظ على الخلود الخلوي ، إلا أنه طريقة مفيدة لفهم أفضل للمساهمة الفسيولوجية للظهارة المتمايزة نهائيا ، بما في ذلك خلايا القولون وخلايا الغدد الصماء المعوية والخلايا الكأسية في مرض التهاب الأمعاء وحالات مرضية أخرى. علاوة على ذلك ، نظهر أن تكملة سيتوكينات معينة في هذا الوسط ، والتي ترتفع تقليديا في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء ، يوجه الجهاز العضوي المتمايز نحو حالة التهابية. على مدار 72 ساعة ، تعكس القولونات المتمايزة المعالجة بالسيتوكينات الالتهابية بشكل أوثق بعض النتائج الأيضية الموضحة في النماذج الأخرى الراسخة لالتهاب القولون و IBD البشري (الشكل 3). علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تكون القولونات المتمايزة المعالجة بهذه الطريقة أكثر انعكاسا لتأثيرات الالتهاب على التوازن الخلوي على الظهارة المتمايزة. لقد حددنا أيضا بروتوكولا لتطوير طبقة أحادية ، والتي تمكن من تكوين كل من الجانب القمي والقاعدي للظهارة ، مما يسمح بتحليل وظيفة الحاجز في الجسم الحي. هذا النظام مفيد في دراسة آليات خلل الحاجز دون الحاجة إلى التمايز وزراعة أهداف علاجية جديدة للعلاج.

يجب ملاحظة العديد من القيود والمزالق المحتملة فيما يتعلق بالبروتوكولات الموضحة أعلاه. يمكن أن يكون العزل الناجح للخبايا وتطوير القولون محدودا بعائد القبو من كل ، ودقة عد الخبايا ، ونظافة الإعدادية. تساهم سرعة حساب الخبايا المعزولة بعد التعليق ، والاختلافات في التفكك الميكانيكي للخبايا عن العضلات الأساسية ، وعدد الغسلات ودورات الطرد المركزي في نجاح ثقافة القولون. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان عدم فصل المواد العضوية بالكامل إلى خلايا مفردة أثناء المرور أو الطلاء لثقافة أحادية الطبقة 2D. تعتبر المجموعات المكونة من 30 إلى 50 خلية مثالية للسماح للثقافة بالانتشار للثقافة طويلة الأجل. تشير البروتوكولات المذكورة أعلاه إلى مجالات المزالق المحتملة والخطوات الإضافية الاختيارية لاستكشاف هذه المشكلات وإصلاحها. في النهاية ، قد يتطلب البروتوكول التحسين من قبل الفرد الذي يؤدي العزلة بسبب التباين المتأصل في مجموعة المهارات والمناورات (أي الاهتزاز) ، بالإضافة إلى الاختلاف في كل. قد يطلب المستخدم النهائي تحسينا إضافيا لالتقاط التنوع الجيني والجزيئي الموجود في مرض التهاب الأمعاء.

في نهاية المطاف ، في حين أن نظام القولون هو أداة مفيدة للغاية لتلخيص الجوانب الرئيسية لعلم وظائف الأعضاء البشرية والمرض في الجسم الحي ، فإن هذا النظام محدود في نهاية المطاف في قدرته على دراسة جميع جوانب الأمراض البشرية. أوضحت الطرق التقليدية لتطوير القولون الجوانب الرئيسية لديناميات الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، فإن هذه النتائج غالبا لا تعكس بشكل كاف النتائج في الخلايا المتمايزة نهائيا داخل ظهارة المضيف. توفر الاستراتيجيات الموضحة في هذه الدراسة للمحققين نموذجا سريعا نسبيا وغير مكلف للتلاعب العضوي الذي ، عند استخدامه بشكل صحيح ، يمكن أن يلقي الضوء على الجوانب الرئيسية للبنية الظهارية المعوية ووظيفتها أثناء الالتهاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفون المساهمون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01DK120986 (إلى K.P.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Tags

علم الأحياء، العدد 196،
دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب <em>المعوي في المختبر</em> على القولون الفئران الراسخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, … More

Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter