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Bioengineering

संयुक्त स्क्लेरैक्सिस ओवरएक्सप्रेशन और 2 डी यूनिक्सियल तनाव के माध्यम से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न iTenocytes की पीढ़ी

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

यह लेख एक 2 डी बायोरिएक्टर के माध्यम से एक लेंटिवायरल वेक्टर और यूनिक्सियल स्ट्रेचिंग का उपयोग करके स्क्लेरैक्सिस के संयुक्त ओवरएक्सप्रेशन के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं को उत्पन्न करके iTenocytes का उत्पादन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

कण्डरा और लिगामेंट की मरम्मत में आज की चुनौतियों में कण्डरा पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए सेल-आधारित चिकित्सा के लिए एक उपयुक्त और प्रभावी उम्मीदवार की पहचान की आवश्यकता है। मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) को कण्डरा की मरम्मत के लिए एक संभावित ऊतक इंजीनियरिंग रणनीति के रूप में खोजा गया है। जबकि वे बहुक्रियाशील हैं और विवो में पुनर्योजी क्षमता रखते हैं, वे अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता में सीमित हैं और फेनोटाइपिक विषमता प्रदर्शित करते हैं। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) अपनी उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता और अद्वितीय विकासात्मक प्लास्टिसिटी के कारण इन सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं। टेनोसाइट विकास में, स्क्लेरैक्सिस (एससीएक्स) कण्डरा भेदभाव का एक महत्वपूर्ण प्रत्यक्ष आणविक नियामक है। इसके अतिरिक्त, मेकेनोरेग्यूलेशन को भ्रूण कण्डरा विकास और उपचार का मार्गदर्शन करने वाला एक केंद्रीय तत्व दिखाया गया है। जैसे, हमने जैविक और यांत्रिक उत्तेजना के सहक्रियात्मक प्रभाव को समाहित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो टेनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है। IPSC mesenchymal स्ट्रोमल कोशिकाओं बनने के लिए प्रेरित किया गया (iMSCs) और प्रवाह cytometry के माध्यम से क्लासिक mesenchymal स्ट्रोमल सेल मार्करों के साथ विशेषता थी. इसके बाद, एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करके, iMSCs को SCX (iMSCSCX+) को स्थिर रूप से ओवरएक्सप्रेस करने के लिए ट्रांसड्यू किया गया था।इन iMSCSCX+ कोशिकाओं को 2D बायोरिएक्टर का उपयोग करके uniaxial तन्यता लोडिंग के माध्यम से iTenocytes में और परिपक्व किया जा सकता है। परिणामी कोशिकाओं को प्रारंभिक और देर से कण्डरा मार्करों के अपग्रेडेशन के साथ-साथ कोलेजन जमाव को देखकर विशेषता थी। iTenocytes उत्पन्न करने की इस विधि कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक संभावित असीमित बंद the-shelf allogeneic सेल स्रोत विकसित करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

कण्डरा और लिगामेंट की मरम्मत में समकालीन मुद्दों से निपटने के लिए, सेल-आधारित उपचारों के लिए उपयुक्त एक प्रासंगिक सेल उम्मीदवार की आवश्यकता होती है। कण्डरा की मरम्मत के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में जांच के एक एवेन्यू में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (बीएम-एमएससी) और वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं (एएससी) की खोज संभावित रणनीतियों के रूप में शामिल है। इन कोशिकाओं में विवो में बहुक्रियाशील क्षमता, महान प्रचुरता और पुनर्योजी क्षमता होती है। इसके अतिरिक्त, उन्होंने पशु मॉडल1 में बढ़ी हुई उपचार क्षमता और बेहतर कार्यात्मक परिणाम दिखाए हैं। बहरहाल, ये कोशिकाएं प्रतिबंधित आत्म-नवीकरण क्षमताओं, फेनोटाइपिक विविधता, और विशेष रूप से, कण्डरा गठन के लिए सीमित क्षमता प्रदर्शित करती हैं। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी अपनी उल्लेखनीय आत्म-नवीकरण क्षमता और बेजोड़ विकासात्मक अनुकूलन क्षमता के कारण इन बाधाओं का समाधान प्रदान करती है। हमारे शोध टीम और दूसरों को मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल जैसी संस्थाओं में IPSC के सफल भेदभाव हासिल की है (iMSCs)2,3. जैसे, iMSCs में कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक एलोजेनिक स्रोत होने की क्षमता है।

स्क्लेरैक्सिस (एससीएक्स) कण्डरा विकास के लिए आवश्यक एक प्रतिलेखन कारक है और इसे विभेदित टेनोसाइट्स के लिए सबसे पहला पता लगाने योग्य मार्कर माना जाता है। इसके अतिरिक्त, SCX डाउनस्ट्रीम कण्डरा भेदभाव मार्करों को सक्रिय करता है, जिसमें टाइप 1a1 चेन कोलेजन 1 (COL1a1), मोहॉक (MKX), और टेनोमोडुलिन (TNMD) शामिल हैं, अन्य 4,5,6 शामिल हैं। कण्डरा परिपक्वता के दौरान व्यक्त अन्य जीनों में ट्यूबिलिन पोलीमराइजेशन-प्रमोटिंग प्रोटीन परिवार के सदस्य 3 (टीपीपीपी 3) और प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआरए)7शामिल हैं। जबकि ये जीन कण्डरा विकास और परिपक्वता के लिए आवश्यक हैं, वे दुर्भाग्य से कण्डरा ऊतक के लिए अद्वितीय नहीं हैं और हड्डी या उपास्थि 5,7 जैसे अन्य मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों में व्यक्त किए जाते हैं।

कण्डरा विकास के दौरान मार्करों की अभिव्यक्ति के अलावा, यंत्र भ्रूण कण्डरा विकास औरउपचार 4,5,6 के लिए एक आवश्यक तत्व है. टेंडन मेकेनोरेस्पॉन्सिव हैं, और उनके विकास पैटर्न उनके पर्यावरण के जवाब में बदलते हैं। आणविक स्तर पर, बायोमेकेनिकल संकेत टेनोसाइट्स8 के विकास, परिपक्वता, रखरखाव और उपचार प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। शारीरिक भार और बायोमैकेनिकल संकेतों को मॉडल करने के लिए विभिन्न बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग किया गया है। इनमें से कुछ मॉडल प्रणालियों में पूर्व विवो ऊतक लोडिंग, द्वि-अक्षीय या एकअक्षीय तनाव को लागू करने वाले 2 डी सेल लोडिंग सिस्टम, और मचान और हाइड्रोगेल 9,10 का उपयोग करके 3 डी सिस्टम शामिल हैं। 2 डी सिस्टम फायदेमंद होते हैं जब या तो कण्डरा-विशिष्ट जीन या सेल भाग्य के संदर्भ में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान पर यांत्रिक उत्तेजना के प्रभावों का अध्ययन करते हैं, जबकि 3 डी सिस्टम सेल-ईसीएम इंटरैक्शन 9,10 को अधिक सटीक रूप से दोहरा सकते हैं।

2 डी लोडिंग सिस्टम में, कोशिकाओं और संस्कृति सब्सट्रेट के बीच तनाव सजातीय है, जिसका अर्थ है कि कोशिकाओं के साइटोस्केलेटन पर लागू भार को पूरी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। द्वि-अक्षीय लोडिंग की तुलना में, यूनिक्सियल लोडिंग अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि टेनोसाइट्स मुख्य रूप से विवो9 में कोलेजन बंडलों से यूनिक्सियल लोडिंग के अधीन हैं। यह पाया जाता है कि दैनिक गतिविधियों के दौरान, tendons 6% तनाव11 अप करने के लिए uniaxial तन्यता लोड हो रहा है के अधीन कर रहे हैं. विशेष रूप से, पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि 4% -5% की शारीरिक सीमाओं के भीतर लोड हो रहा है एससीएक्स और टीएनएमडी जैसे कण्डरा से संबंधित मार्कर अभिव्यक्ति को संरक्षित करके टेनोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, साथ ही कोलेजन उत्पादन 9,10 में वृद्धि हुई है। 10% से अधिक के उपभेदों दर्दनाक प्रासंगिक लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक नहीं12,13 हो सकता है.

यहां, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो यांत्रिक और जैविक उत्तेजना के सहक्रियात्मक प्रभाव को ध्यान में रखता है जो टेनोसाइट्स की पीढ़ी के लिए आवश्यक हो सकता है। हम पहले विकास कारकों के लिए भ्रूण निकायों के अल्पकालिक जोखिम के माध्यम से iMSCs में IPSC प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन, प्रवाह cytometry का उपयोग MSC सतह मार्करों द्वारा की पुष्टि. फिर हम इंजीनियर iMSCs को SCX (iMSCSCX+) की स्थिर ओवरएक्सप्रेशन के लिए एक लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन विधि का विस्तार करते हैं। आगे सेल परिपक्वता के लिए, iMSCSCX + फाइब्रोनेक्टिन-लेपित सिलिकॉन प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और CellScale MCFX बायोरिएक्टर का उपयोग कर एक अनुकूलित uniaxial तनाव प्रोटोकॉल से गुजरना. टेनोजेनिक क्षमता जल्दी और देर से कण्डरा मार्करों, साथ ही कोलेजन बयान14 के upregulation अवलोकन द्वारा पुष्टि की गई थी. iTenocytes उत्पन्न करने की यह विधि एक प्रूफ-ऑफ-अवधारणा है जो कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए असीमित ऑफ-द-शेल्फ, एलोजेनिक स्रोत प्रदान कर सकती है।

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Protocol

iTenocytes का उत्पादन करने के लिए इस प्रोटोकॉल तीन प्रमुख चरणों में आयोजित किया जा सकता है: iPSCs iMSCs (10 दिन), iMSC iMSCSCX+ (2 सप्ताह), iMSCSCX + iTenocytes करने के लिए (न्यूनतम 4 दिन). प्रोटोकॉल में प्रत्येक प्रमुख कदम को रोका जा सकता है और प्रयोगात्मक समयरेखा के आधार पर बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है। कोशिकाओं के संवर्धन के साथ जुड़े तरीकों के लिए, बाँझ तकनीकों को नियोजित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर उगाया जाना चाहिए।

1. प्रेरित Mesenchymal स्ट्रोमल कोशिकाओं में मानव IPSC प्रेरण (iMSCs)

  1. प्रयोग की तैयारी
    1. Iscove के संशोधित Dulbecco के मध्यम - भ्रूण निकायों (IMDM-EB) मीडिया तैयार करें.
      1. नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन के 8.5 एमएल के साथ आईएमडीएम बेसल मीडिया के 50 एमएल, न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के 500 माइक्रोन, 0.385 माइक्रोन (110 एमएम स्टॉक) बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल, और 500 माइक्रोन एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक समाधान (एएएस) (अंतिम सांद्रता: 17%, 1%, 110 माइक्रोन, 1%, क्रमशः) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. Mesenchymal स्ट्रोमल सेल (MSC) मीडिया तैयार करें.
      1. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल के साथ कम ग्लूकोज डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 440 एमएल, एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक समाधान (एएएस) के 5 एमएल, और एल-ग्लूटामाइन के 5 एमएल (अंतिम सांद्रता: 10%, 1%, 2 मिमी, क्रमशः)।
    3. पॉली (2-हाइड्रॉक्सीथाइल मेथैक्रिलेट) (पॉली-हेमा) लेपित प्लेटें तैयार करें।
      1. एक बाँझ बोतल में 10 ग्राम पॉली-हेमा ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
      2. बोतल में एक चुंबकीय स्टिरर जोड़ें, और सरगर्मी करते समय, धीरे-धीरे 500 एमएल 95% ईटीओएच जोड़ें।
      3. एक बार सभी EtOH जोड़ दिए जाने के बाद, कम से कम 6 घंटे के लिए अतिरिक्त कम गर्मी के साथ 1200 आरपीएम पर सरगर्मी मोड चालू करें। पॉली-हेमा समाधान को कमरे के तापमान पर एक वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है।
      4. बाँझ परिस्थितियों में, एक T75 फ्लास्क में 9 एमएल में 2.5 माइक्रोग्राम/सेमी2 जोड़ें। संस्कृति पोत के आकार के अनुसार मात्रा समायोजित करें.
      5. बाँझपन बनाए रखना, उपयोग करने से पहले ईटीओएच को पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए जहाजों को हवा में सूखने दें। यह आमतौर पर 24-72 घंटे लेता है।
    4. जिलेटिन-लेपित फ्लास्क तैयार करें।
      1. NaOH के साथ एक कांच की बोतल धो लें और इसे जिलेटिन की तैयारी के लिए समर्पित करें। डिटर्जंट वापरू नका.
      2. 1% जिलेटिन समाधान (5 ग्राम जिलेटिन और एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी के 500 एमएल) तैयार करें। 30 मिनट के लिए जिलेटिन समाधान के साथ कांच की बोतल आटोक्लेव.
      3. जिलेटिन समाधान को ठंडा होने दें, और इसे कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      4. कोट एक T75 फ्लास्क प्रति फ्लास्क जिलेटिन समाधान के 5 एमएल के साथ और बोने कोशिकाओं से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं. जिलेटिन-लेपित फ्लास्क 1 दिन पहले तैयार किए जा सकते हैं।
    5. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस) बफर तैयार करें.
      1. पीबीएस को 2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन और 0.1% सोडियम एज़ाइड के साथ मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. भ्रूण निकायों का उत्पादन (ईबी)
    नोट: IPSC एक 6 अच्छी तरह से थाली में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए और तक पहुँचने चाहिए 70% -80% संगम उपयोग करने से पहले.
    1. 0 दिन पर, टिशू कल्चर हुड में एक 384 स्पष्ट तल पीसीआर प्लेट लाने और एक ढक्कन के बिना 15 मिनट के लिए यूवी.
    2. IPSC से विकास माध्यम निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) और पीबीएस के साथ कुओं धो लें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व गर्म कोमल सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.5 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। कोशिकाओं हर निरीक्षण 5 जब तक IPSC एकल कोशिकाओं या निलंबन में उठाया छोटे समुच्चय बन गए हैं.
    4. एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक 1 एमएल विंदुक के साथ सेल निलंबन resuspended है.
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें, आईएमडीएम-ईबी मीडिया (चरण 1.1.1) में फिर से निलंबित करें, और एक हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    7. सेल निलंबन प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 25 माइक्रोन के साथ 384 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 5,000-25,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की उचित मात्रा की गणना करें।
      नोट: आम तौर पर, 6-अच्छी तरह से प्लेट के 2-3 संगम (70% -80%) कुएं एक 384-अच्छी प्लेट में ईबीएस बना सकते हैं। ईबी प्रति कोशिकाओं का आकार अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाएगा। पूरे 384-वेल प्लेट के लिए, सेल निलंबन के 9.6 एमएल का उपयोग किया जाना चाहिए, 25 माइक्रोन प्रति कुआं।
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर फिर से कोशिकाओं नीचे अपकेंद्रित्र.
    9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आईएमडीएम-ईबी मीडिया की एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड (स्टॉक: 10 मिमी, 1000x, सामग्री की तालिकादेखें) के 10 माइक्रोन एक पूर्व-ठंडा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में।
    10. शंक्वाकार में ठंड घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (ईबी के लायक 384-अच्छी तरह से प्लेट के लायक 1 मिलीग्राम) जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    11. प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 25 माइक्रोन वितरित करें। प्लेट पर एक बाँझ ढक्कन रखें और 7 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x ग्राम पर स्पिन करें। 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    12. 2 दिन, कोशिकाओं को पूर्व-गर्म आईएमडीएम-ईबी मीडिया के 3 एमएल के साथ 100 मिमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    13. EBs को IMDM-EB के 75 एमएल के साथ समर्पित पॉली-हेमा-लेपित T10 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। संस्कृति पोत के आकार के अनुसार मात्रा समायोजित करें. ईबीएस को 3 दिनों तक बढ़ने दें।
    14. 5 दिन, ईबीएस को आईएमडीएम-ईबी मीडिया के 10 एमएल के साथ तैयार जिलेटिन-लेपित टी 75 बोतल में स्थानांतरित करें। संस्कृति पोत के आकार के अनुसार मात्रा समायोजित करें. निलंबन में 3 और दिनों के लिए ईबी बढ़ाएं।
    15. 8 दिन, सुनिश्चित करें कि दो प्रकार के ईबी देखे जाते हैं: ईबीएस जो फ्लास्क से जुड़े होते हैं, और गैर-संलग्न ईबी। पीबीएस के साथ फ्लास्क से गैर संलग्न ईबी बाहर धो.
    16. संलग्न EBs में, TGFβ-1 (10 ng/mL) ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक IMDM-EB मीडिया जोड़ें और उन्हें 2 दिनों तक बढ़ने दें।
    17. 10 दिन, माध्यम को MSC माध्यम में बदलें। कोशिकाओं को सप्ताह में दो बार खिलाया जाना चाहिए। एक बार 70% संगम, कोशिकाओं को फिर से भरना करने के लिए "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" के लिए आगे बढ़ें. जिलेटिन लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं replate.
  3. मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल
    1. एक बार पक्षपाती कोशिकाओं 70% संगम तक पहुँच गया है, प्लेटों से विकास माध्यम महाप्राण और पीबीएस के साथ धो लें.
    2. प्रत्येक 150 मिमी प्लेट में पूर्व-गर्म 0.25% ट्रिप्सिन के 5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को उठाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। संस्कृति पोत के आकार के अनुसार ट्रिप्सिन मात्रा समायोजित करें।
    3. एक खुर्दबीन के तहत, कोशिकाओं के सबसे प्रत्येक प्लेट से उठा लिया गया है कि जाँच करें. यदि अभी भी कोशिकाएं जुड़ी हुई हैं, तो कोशिकाओं को नापसंद करने के लिए प्लेटों के किनारों को धीरे से टैप करें।
    4. पूर्व गर्म विकास माध्यम की मात्रा दोगुनी जोड़कर एक शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    5. 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और अगले चरणों के लिए आगे बढ़ना.
  4. एमएससी मार्कर अभिव्यक्ति के लिए फ्लो साइटोमेट्री मूल्यांकन
    नोट: मानव एमएससी, अस्थि मज्जा एमएससी की तरह, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    1. "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" (1.3 कदम) प्रदर्शन करें.
    2. FACS बफर के 3 एमएल के साथ सतह पर तैरनेवाला को फिर से निलंबित करें और पूरी मात्रा को FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र। FACS बफर के साथ वॉश स्टेप को दो बार और दोहराएं।
    4. सना हुआ ट्यूबों के लिए, माउस एंटीहुमन सीडी 90-एफआईटीसी, माउस एंटीहुमन सीडी 44-एपीसी, और एंटीहुमन सीडी 105-पीई ( सामग्री की तालिकादेखें) के 2 माइक्रोन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. आइसोटाइप नियंत्रण ट्यूबों में, माउस IgG2a-FITC, माउस IgG1-PB, और माउस IgG1-PE के 20 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    6. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं. FACS बफर के 3 एमएल जोड़कर और 300 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 5 मिन के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके सभी ट्यूबों को धो लें। प्रत्येक ट्यूब के लिए FACS बफर के 250 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    7. प्रवाह साइटोमेट्री14 का उपयोग कर एमएससी सतह मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण. उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य होना चाहिए: CD90-FITC, 495 एनएम पर उत्तेजना शिखर और 519 एनएम पर उत्सर्जन शिखर; सीडी 44-एपीसी, 640 पर उत्तेजना शिखर और 660 एनएम पर उत्सर्जन शिखर; CD105-PE, 561 एनएम पर उत्तेजना शिखर और 574 एनएम पर उत्सर्जन शिखर।

2. iMSC पासिंग और विस्तार

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. MSC फ्रीज मीडिया तैयार करें।
      1. कम ग्लूकोज डीएमईएम के 30 एमएल, डीएमएसओ के 5 एमएल, और एफबीएस के 15 एमएल (अंतिम सांद्रता: क्रमशः 60%, 10%, 30%) को मिलाएं।
      2. एक बाँझ 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पासिंग
    नोट: प्रेरण के बाद, iMSCs प्लास्टिक टिशू कल्चर प्लेटों पर बढ़ने के लिए बंद weaned होने से पहले एक अतिरिक्त 2 मार्ग के लिए जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर उगाया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को 1: 3 विभाजन अनुपात के साथ पारित किया जाना चाहिए जब 70% संगम होता है।
    1. "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" (1.3 कदम) प्रदर्शन करें.
    2. एमएससी मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और समान रूप से प्रति फ्लास्क मीडिया के 20 एमएल के साथ टी 175 फ्लास्क के तीन नए 150 मिमी प्लेटों में कोशिकाओं को वितरित करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटें।
    3. पूर्व-गर्म एमएससी मीडिया के साथ विकास माध्यम की जगह सप्ताह में दो बार कोशिकाओं को खिलाएं।
  3. हिमांक
    1. "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" प्रदर्शन करें।
    2. MSC फ्रीज मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक क्रायोवियल में सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें और लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक ठंड कंटेनर में स्टोर करें।
  4. विगलन
    1. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म एमएससी मीडिया के 10 एमएल तैयार करें.
    2. क्रायोवियल को पुनः प्राप्त करें, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डुबोएं, और मटर के आकार की बर्फ की गेंद (लगभग 1-2 मिनट) रहने तक घुमाएं।
    3. सेल संस्कृति हुड में, धीरे-धीरे क्रायोवियल और विंदुक के लिए पूर्व गर्म मीडिया के 1 एमएल ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए जोड़ें.
    4. क्रायोवियल से सेल निलंबन को पूर्व-गर्म मीडिया के साथ तैयार 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 300 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ताजा मीडिया के साथ फिर से निलंबित करें. सेल निलंबन को 20 एमएल की कुल मात्रा के साथ 150 मिमी प्लेट में जोड़ें। संस्कृति फ्लास्क के आकार के अनुसार मात्रा समायोजित करें।
    6. विभाजित करने के लिए तैयार होने तक कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. iMSCs की जेनेटिक इंजीनियरिंग लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके SCX को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड को पूरा करने में दो सप्ताह लगते हैं।

  1. मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. HEK293T/17 सेल मीडिया तैयार करें।
      1. एफबीएस के 50 एमएल और एएएस के 5 एमएल (अंतिम सांद्रता: 10%, 1%, क्रमशः) के साथ ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (ईएमईएम) के 445 एमएल को पूरक करें।
    2. एमएससी लेंटी-पैकिंग मीडिया तैयार करें।
      1. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कमरे के तापमान एफबीएस के 50 एमएल हीटिंग द्वारा गर्मी निष्क्रिय सीरम तैयार करें।
      2. गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस और एल-ग्लूटामाइन के 5 एमएल (अंतिम सांद्रता: 10%, 2 मिमी, क्रमशः) के साथ कम ग्लूकोज डीएमईएम के 445 एमएल को मिलाएं।
    3. अभिकर्मक परिसर तैयार करें।
      1. अभिकर्मक जटिल घटकों की अनुमति दें (सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ पर पिघलना करने के लिए: पैकेजिंग प्लास्मिड वीएसवी-जी और डेल्टा, एससीएक्स प्लाज्मिड, और बायोटी15,16।
      2. धीरे भंवर और plasmids नीचे स्पिन. डीएनए सांद्रता को मापें।
      3. डीएनए सांद्रता और अभिकर्मक के लिए इरादा फ्लास्क की संख्या के आधार पर, प्रत्येक घटक की मात्रा की गणना: एक T75 फ्लास्क के लिए, अभिकर्मक परिसर 750 μL सीरम मुक्त माध्यम (सीरम मुक्त DMEM या पीबीएस की तरह), 7.5 माइक्रोन SCX प्लाज्मिड, 0.75 μg VSV-जी प्लाज्मिड, 6.75 μg डेल्टा प्लाज्मिड, और 22.5 μL BioT. पिपिटिंग त्रुटि के लिए अतिरिक्त विचार करें।
      4. धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। एक अपकेंद्रित्र में संक्षेप में स्पिन करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और तुरंत उपयोग करें.
  2. अभिकर्मक और लेंटिवायरल उत्पादन
    चेतावनी: दिन 3 से शुरू, प्रोटोकॉल लेंटवायरस के साथ काम करने पर जोर देता है, और इस प्रकार, काम को नियंत्रण स्तर 2+ परिचालन प्रक्रियाओं का उपयोग करके किया जाना चाहिए। श्रमिकों को व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना चाहिए, जिसमें दस्ताने की दो परतें, कलाई कवरिंग, सुरक्षा चश्मा, एक मुखौटा और लंबी पैंट और बंद जूते शामिल हैं। विंदुक युक्तियों, फ्लास्क और तरल माध्यम सहित सभी अपशिष्ट और सामग्रियों को कम से कम 20 मिनट के लिए ब्लीच (अंतिम 1% सोडियम हाइपोक्लोराइट) के साथ निर्जलित किया जाना चाहिए। वैक्यूम का उपयोग न करें।
    1. बीज HEK293T/17 कोशिकाएं।
      1. अभिकर्मक (दिन 0) से पहले लगभग 18-24 घंटे, T75 फ्लास्क में 293T कोशिकाओं को उठाएं और प्लेट करें। निम्नलिखित खंड T75 को संस्कृति पोत के रूप में मानते हैं। उपयोग किए गए सेल संस्कृति पोत के अनुसार मात्रा समायोजित करें।
      2. फ्लास्क से संस्कृति माध्यम निकालें और पीबीएस के 5 एमएल के साथ धो लें।
        नोट: कोशिकाएं फ्लास्क की सतह से बहुत आसानी से उठाती हैं। फ्लास्क के पक्ष में पीबीएस जोड़ें और कोशिकाओं के लिए समाधान के प्रत्यक्ष जोड़ से बचने.
      3. प्रत्येक फ्लास्क में पूर्व-गर्म 0.25% ट्रिप्सिन के 3 एमएल जोड़ें और 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को एक शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें और 300 x ग्राम पर 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र करें।
      4. सतह पर तैरनेवाला निकालें, 293T मीडिया में फिर से निलंबित करें, और एक हेमोसाइटोमीटर या एक सेल काउंटर का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती.
      5. कोशिकाओं को 5.3 x 10,4 कोशिकाओं/सेमी2 पर प्लेट करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      6. अगले दिन (दिन 1), अभिकर्मक परिसर तैयार करें। कोशिकाओं से विकास माध्यम को पूर्व-गर्म एमएससी लेंटी-पैकेजिंग माध्यम (चरण 3.1.2) के 5 एमएल के साथ बदलें।
      7. अभिकर्मक जटिल dropwise कोशिकाओं के लिए जोड़ें. धीरे कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक परिसर के भी जोखिम सुनिश्चित करने के लिए पकवान झुकाव. कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में लौटाएं।
        नोट: विषाक्तता 24 घंटे (दिन 2) के बाद देखी जानी चाहिए।
      8. 48 घंटे (3 दिन) के बाद, ध्यान से एक विंदुक का उपयोग कर एक अलग शंक्वाकार ट्यूब में वायरस युक्त माध्यम इकट्ठा, और 300 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
      9. 293T कोशिकाओं के T75 फ्लास्क में प्री-वार्म्ड MSC लेंटी-पैकेजिंग माध्यम के 5 एमएल जोड़ें और रात भर इनक्यूबेटर पर लौटें।
      10. centrifugation के बाद, सीधे फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला pipetting द्वारा एक 0.45 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के साथ सतह पर तैरनेवाला फिल्टर. वायरस युक्त माध्यम को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      11. एक और 24 घंटे (4 दिन) के बाद, एक बार फिर ध्यान से एक विंदुक का उपयोग कर एक अलग शंक्वाकार ट्यूब में वायरस युक्त माध्यम इकट्ठा, और 300 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
      12. पिछले संग्रह दिन वायरस के साथ वायरस को मिलाएं और एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए मिलाएं। इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है और प्रयोगात्मक समयरेखा के आधार पर बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है। लेंटवायरस को -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोटेड और जमे हुए किया जा सकता है, या लेंटवायरस को बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है, जबकि "एससीएक्स के साथ आईएमएससी का पारगमन" (चरण 3.3) के साथ आगे बढ़ रहा है।
        नोट: एक बार लेंटवायरस एलिकोट जमे हुए और पिघल जाते हैं, तो फिर से जमने न दें।
  3. SCX के साथ iMSCs का पारगमन
    1. टिटर प्लेट ट्रांसडक्शन करें।
      1. दिन 0 पर, "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" प्रदर्शन.
      2. एमएससी मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
      3. एक 6 अच्छी तरह से थाली में, 4 x 103 कोशिकाओं / एमएससी मीडिया के 20 एमएल के साथ एक अतिरिक्त 150 मिमी प्लेट में शेष को फिर से भरना (यह नियंत्रण प्लेट होगा)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      4. अगले दिन (दिन 1), कोशिकाओं ~ 40% मिलाव होना चाहिए. लेंटी-पैकेजिंग ग्रोथ मीडियम को पहले से गरम करें और पॉलीब्रेन और बर्फ पर लेंटवायरस के लगभग 3 एमएल को पिघलाएं (या यदि वायरस संग्रह के रूप में उसी दिन किया जाता है, तो उपयोग होने तक बर्फ पर स्टोर करें)।
      5. वांछित टाइटर्स (यानी, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%) के आधार पर कुओं में लेंटी-पैकेजिंग ग्रोथ मीडियम और लेंटवायरस जोड़ें। एमएल (स्टॉक एकाग्रता: 10 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पॉलीब्रेन के 0.5 माइक्रोन जोड़ें।
      6. सभी कोशिकाओं के लिए भी जोखिम सुनिश्चित करने के लिए चारों ओर थाली भंवर. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के लिए थाली लौटें.
    2. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ SCX लेंटिवायरस टिटर दक्षता का आकलन करें।
      1. 48 घंटे के बाद, "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" प्रदर्शन.
      2. पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
      3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और इसे धोने के लिए FACS बफर के 3 एमएल में फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन को 300 x ग्राम पर 5 मिन के लिए साइटोमेट्री ट्यूब और अपकेंद्रित्र प्रवाह में स्थानांतरित करें।
      4. FACS बफर वॉश को दो बार दोहराएं और FACS बफर के 300 μL में अंतिम सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। एक प्रवाह साइटोमेट्री मशीन का उपयोग कर प्रत्येक अनुमापांक के लिए GFP की अभिव्यक्ति का आकलन.
      5. टाइटर्स और सेल व्यवहार्यता गणना के आधार पर, पारगमन के साथ आगे बढ़ने के लिए उपयुक्त लेंटवायरस टिटर निर्धारित करें। इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है और प्रयोगात्मक समयरेखा के आधार पर बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है।
    3. बड़े पैमाने पर SCX पारगमन करें।
      नोट: सूचीबद्ध वॉल्यूम प्रति 1x 150 मिमी प्लेट या 1x T175 फ्लास्क हैं। इसे वांछित पोत आकार और पारगमन के पैमाने के आधार पर तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
      1. दिन 0 पर, "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" प्रदर्शन.
      2. एमएससी मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को 4 x 103 कोशिकाओं/सेमी2 पर बीज दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      3. अगले दिन (दिन 1), कोशिकाओं ~ 40% मिलाव होना चाहिए. लेंटी-पैकेजिंग ग्रोथ मीडियम को प्रीवार्म करें और पॉलीब्रेन को पिघलाएं और बर्फ पर लेंटवायरस की पूर्व-गणना की गई मात्रा।
      4. निर्धारित अनुमापांक के आधार पर, कुओं में लेंटी-पैकेजिंग विकास माध्यम और लेंटवायरस की वांछित मात्रा जोड़ें। पॉलीब्रेन के 5 माइक्रोग्राम / एमएल (स्टॉक एकाग्रता: 10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
      5. 3 दिन, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण. नव उत्पादित iMSCSCX+ GFP प्रतिदीप्त करना चाहिए. वायरस युक्त माध्यम को पूर्व-गर्म एमएससी मीडिया से बदलें। इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है और प्रयोगात्मक समयरेखा के आधार पर बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है।

4. iMSCSCX+ पासिंग और विस्तार

  1. iMSCSCX+ को पासिंग, विस्तार, ठंड और विगलन करें, जैसा कि iMSCs के लिए है, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित है।

5. यांत्रिक लोडिंग

नोट: इस खंड में कम से कम 4 दिन लगते हैं लेकिन सेल संकुचन देखा जाता है या नहीं, इसके आधार पर यह लंबा हो सकता है।

  1. प्रयोग की तैयारी
    1. सिलिकॉन प्लेट तैयार करें।
      1. आटोक्लेव 2 सिलिकॉन प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें)। के बाद, बाँझ परिस्थितियों में, आटोक्लेव बैग से सिलिकॉन प्लेटों को हटा दें और उन्हें 150 मिमी प्लेटों में रखें।
      2. फाइब्रोनेक्टिन के 130 माइक्रोन (100x, सामग्री की तालिकादेखें) को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ पीबीएस के 13 एमएल के साथ मिलाएं। मिश्रण करने के लिए ट्यूब को कई बार पलटें।
      3. सिलिकॉन प्लेटों के प्रत्येक कुएं में फाइब्रोनेक्टिन समाधान के 400 माइक्रोन जोड़ें। प्लेटों को कम से कम 2 घंटे या रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      4. उपयोग करने से पहले, फाइब्रोनेक्टिन समाधान महाप्राण और प्लेटों को कम से कम 30 मिनट के लिए सेल कल्चर हुड में हवा सूखने दें ताकि फाइब्रोनेक्टिन समाधान पूरी तरह से वाष्पित हो जाए।
        नोट: फाइब्रोनेक्टिन समाधान को समय से पहले कुओं से हटाया जा सकता है, और अब-लेपित प्लेटें उपयोग तक कुछ हफ़्ते तक 37 डिग्री सेल्सियस पर बैठ सकती हैं।
    2. MSC खिंचाव मीडिया तैयार करें।
      1. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म एमएससी मीडिया के 14 एमएल के लिए एस्कॉर्बिक एसिड (स्टॉक: 100x, अंतिम एकाग्रता: 50 माइक्रोग्राम / एमएल) के 140 माइक्रोन जोड़कर एमएससी खिंचाव मीडिया तैयार करें।
        नोट: एस्कॉर्बिक एसिड को हर मीडिया परिवर्तन से पहले एमएससी मीडिया में ताजा जोड़ा जाना चाहिए।
  2. सिलिकॉन प्लेटों में iMSCSCX+ का सीडिंग
    1. "मानक उठाने कोशिकाओं प्रोटोकॉल" (1.3 कदम) प्रदर्शन करें.
    2. एमएससी मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    3. 1.25 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें।
    4. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से एमएससी खिंचाव मीडिया की इस मात्रा निकालें. लक्ष्य कोशिकाओं में जोड़ें। समरूप नए सेल निलंबन के लिए पलटें।
    5. दोनों सिलिकॉन प्लेटों के हर कुएं में नए सेल निलंबन के 400 माइक्रोन जोड़ें।
    6. ढक्कन वापस 150 मिमी प्लेटों पर रखो और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के लिए उन्हें वापस.
  3. एकअक्षीय तनाव
    1. अगले दिन, 70% इथेनॉल के बाद डीडीएच2ओ के साथ स्ट्रेचिंग उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) कुल्ला। तंत्र को पोंछ लें, इसे सेल कल्चर हुड में रखें, और यूवी को 15 मिनट के लिए रखें।
    2. बीज वाली प्लेटों को पुनः प्राप्त करें और अच्छे सेल अटैचमेंट के लिए कुओं की जांच करें।
    3. इनक्यूबेटर (स्थिर नियंत्रण) में एक प्लेट छोड़ दें और सिलिकॉन प्लेट में छेद के साथ शिकंजा संरेखित करके खींचने तंत्र में दूसरी वरीयता प्राप्त सिलिकॉन प्लेट रखें। बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए उपकरण पर ढक्कन बदलें।
    4. इलेक्ट्रॉनिक स्रोत ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए वरीयता प्राप्त सिलिकॉन प्लेट के साथ उपकरण संलग्न करें और इसे इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. कार्यक्रम पर, चक्रीय स्ट्रेचिंग प्रोटोकॉल को 4% साइनसोइडल तनाव, 0.5 हर्ट्ज, 2 घंटे प्रति दिन पर सेट करें। एक बार स्टार्ट बटन दबाकर स्ट्रेच शुरू करें। स्ट्रेचिंग तुरंत शुरू होनी चाहिए।
    6. 3 दिनों की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं खिंचाव. दैनिक कोशिकाओं की निगरानी करें और स्ट्रेचिंग प्रोटोकॉल को रोकें यदि सेल संकुचन देखा जा सकता है। मीडिया को हर दूसरे दिन ताजा एमएससी स्ट्रेच मीडिया में बदलें।

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Representative Results

iMSCs के लिए मानव IPSC भेदभाव
जैसा कि पहले वर्णित है, iMSCs में IPSC अंतर के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल भ्रूण निकायों के गठन शामिल2. इस प्रक्रिया में IPSC (चित्रा 1 ए) से iMSCs को प्रेरित करने में लगभग दस दिन लगते हैं। हालांकि, नव उत्पन्न iMSCs को कम से कम दो बार पारित करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह न केवल जिलेटिन-लेपित प्लेटों की आवश्यकता को खत्म करने में मदद करता है बल्कि स्थिर एमएससी अभिव्यक्ति भी स्थापित करता है। भेदभाव के बाद छह मार्ग के बाद आयोजित प्रवाह साइटोमेट्री परिमाणीकरण, सीडी 44 (83.1%), सीडी 90 (88.4%), और सीडी 105 (99.2%) 17,18 (चित्रा 1बी) सहित क्लासिक एमएससी सतह मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति के साथ लगभग शुद्ध सेल आबादी को दर्शाता है। आकृति विज्ञान के संदर्भ में, iMSCs को अस्थि मज्जा MSCs के समान होना चाहिए, जो लम्बी और फाइब्रोब्लास्ट की तरह दिखाई देता है (चित्र 1C)।

iMSCs की जेनेटिक इंजीनियरिंग लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके SCX को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए
लेंटीवायरस को प्लेंटी-सी-एमजीएफपी वेक्टर के साथ HEK293T/17 कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करके उत्पादित किया गया था, जिसमें एससीएक्सबी को एससीएक्स-जीएफपी + को व्यक्त करने के लिए डाला गया है, साथ ही दो पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ। अभिकर्मक BioT विधि15,16 का उपयोग करके 1.5: 1 BioT (μl) से डीएनए (μg) के अनुपात के साथ किया गया था।

HEK293T/17 कोशिकाओं को अभिकर्मक से पहले 5.3 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 18-24 घंटे के घनत्व पर वरीयता दी गई थी। अभिकर्मक के समय, कोशिकाओं को कम दक्षता टाइटर्स(चित्रा 2बी1, बाएं)से बचने के लिए 80% -95% संगम तक पहुंचना चाहिए। प्लाज्मिड कॉकटेल जोड़ने के 24 घंटे के भीतर, कुछ विषाक्तता देखी गई, जो 48 घंटे(चित्रा 2बी2)पर पहुंच गई। चूंकि एससीएक्स लेंटिवायरल वेक्टर जीएफपी-संयुग्मित है, इसलिए जीएफपी अभिव्यक्ति 48 घंटे (चित्रा 2बी3) के बाद देखने योग्य होनी चाहिए। GFP अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त उच्च विषाक्तता की उपस्थिति सफल अभिकर्मक का एक विश्वसनीय संकेतक है. लेंटवायरस को 48 घंटे और 72 घंटे में एकत्र किया गया था, और प्रवाह साइटोमेट्री और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग करके पारगमन दक्षता का मूल्यांकन किया गया था। जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं की पूर्ण तीव्रता एससीएक्स एकीकरण के लिए प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और यह उच्च टाइटर्स(चित्रा 3ए)में काफी अधिक था। एससीएक्स-जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में मापा गया पारगमन दक्षता, लेंटिवायरल लोड(चित्रा 3बी)के आधार पर खुराक-प्रतिक्रिया प्रभाव का प्रदर्शन करती है। विभिन्न मार्ग पर iMSCSCX + के प्रवाह cytometry भी ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के स्तर या transduced कोशिकाओं (चित्रा 3C) के अनुपात में कोई परिवर्तन के साथ, उच्च स्थिरता से पता चला. इसके अतिरिक्त, छँटाई के बिना नियमित संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद, iMSCSCX + SCX (चित्रा 3D) के स्थिर overexpression बनाए रखा. बड़े पैमाने पर पारगमन 75% लेंटवायरस (चित्रा 2सी)का उपयोग करके टिटर के आधार पर आयोजित किया गया था।

iMSCSCX+ की मैकेनिकल लोडिंग
iMSCSCX+ कोशिकाओं खींच प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले सेल लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 1.25 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 (चित्रा 4A, बी) की एक सेल घनत्व पर विकृत सिलिकॉन प्लेटों पर वरीयता प्राप्त थे. अंतिम बोने घनत्व मोनोलेयर अतिवृद्धि को रोकने के लिए अनुकूलित किया गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि अत्यधिक उच्च बोने घनत्व समय से पहले सेल संकुचन और प्रारंभिक कोशिका मृत्यु(चित्रा 4डी)में हुई। स्थैतिक नियंत्रण समूह के लिए, कोशिकाओं को समान प्लेटों में चढ़ाया गया था, लेकिन बिना किसी खिंचाव के। iMSCSCX+ कोशिकाओं को कम से कम तीन दिनों के लिए 2D बायोरिएक्टर में खींचने के अधीन किया गया था, सात दिनों तक, 4% एकअक्षीय तनाव और 0.5 हर्ट्ज प्रति दिन 2 घंटे के लिए। यह स्ट्रेचिंग आहार शारीरिक रूप से प्रासंगिक9 के रूप में वर्णित किया गया है। कई दिनों के खिंचाव के बाद, सेल संगठन की कुछ डिग्री स्थिर समूह, जो यादृच्छिक सेल संगठन(चित्रा 4सी)का प्रदर्शन की तुलना में मनाया जा सकता है. एक्टिन फिलामेंट्स के फालोलाइडिन धुंधला हो जाना आगे इस बात पर प्रकाश डालता है कि कैसे कोशिकाएं स्थिर प्लेटों(चित्रा 4ई)में देखे गए यादृच्छिक सेल संगठन के विपरीत, खिंचाव की दिशा में लंबवत बढ़ने लगती हैं। नव उत्पन्न iTenocytes लक्षण वर्णन करने के लिए, कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए तीन और सात दिनों में एकत्र किए गए, के रूप में पहले14 की सूचना दी. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है कि iMSCSCX + कोशिकाओं mechanoresponsive हैं, के रूप में टेनोजेनिक जीन (एससीएक्स, THBS4, COL1a1, BGN, MKX, और TPPP3) 5,7,19,20 दोनों तीन और सात दिनों में एक महत्वपूर्ण upregulation है, दिन 0 (चित्रा 5A) पर सिर्फ iMSCs की तुलना में. इसके अतिरिक्त, खींचने के 7 दिनों के बाद मीडिया में कोलेजन जमाव अन्य सभी समूहों(चित्रा 5बी)की तुलना में iMSCSCX+ फैला हुआ समूह में काफी अधिक था।

Figure 1
चित्रा 1: iMSC भेदभाव योजनाबद्ध और प्रवाह साइटोमेट्री लक्षण वर्णन। (ए) iTenocyte पीढ़ी और iMSC प्रेरण के लिए समयरेखा के समग्र योजनाबद्ध। पापलमप्राउ ए एट अल.14 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। (बी) फ्लो साइटोमेट्री परिमाणीकरण भेदभाव के बाद 6 मार्ग के बाद आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी के लिए क्लासिक एमएससी सतह मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत दिखाता है। Sheyn D. et al.2 से अनुमति के साथ अनुकूलित। (सी) भेदभाव के बाद कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियों फाइब्रोब्लास्ट की तरह आकृति विज्ञान का प्रदर्शन. स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: iMSCSCX + उत्पादन योजनाबद्ध। (ए) 2एन डी पीढ़ी एससीएक्स लेंटिवायरस वेक्टर और iMSCs के पारगमन का उपयोग कर अभिकर्मक के समग्र योजनाबद्ध। पापलमप्राउ ए एट अल.14 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। (बी 1) प्लास्मिड कॉकटेल के अलावा से पहले HEK293T/17 कोशिकाएं। (बी 2) HEK293T/17 कोशिकाएं, 48 घंटे के बाद, जीएफपी व्यक्त करती हैं और विषाक्तता प्रदर्शित करती हैं। (बी 3) जीएफपी की अभिव्यक्ति जिसे HEK293T/17 कोशिकाओं में देखा जा सकता है, सफल अभिकर्मक को इंगित करता है। (सी) उत्पन्न iMSCSCX + कोशिकाओं (75% अनुमापांक के साथ) नाभिक में SCX-GFP + एक्सप्रेस. स्केल सलाखों = 400 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री और जीन अभिव्यक्ति के साथ पारगमन दक्षता का निर्धारण। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की पूर्ण तीव्रता का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एससीएक्स एकीकरण के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया गया था। वेक्टर टाइटर्स को लेंटिवायरल एमओआई का आकलन करने के लिए सभी कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था। (ए) वायरस टिटर प्रति पूर्ण प्रतिदीप्ति। (बी)पारगमन दक्षता SCX-GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन. पारगमन दक्षता में लेंटिवायरल लोड का एक खुराक-प्रतिक्रिया प्रभाव तब देखा गया जब प्रवाह परिणाम जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किए गए थे। MOI, संक्रमण की बहुलता, n = 3 स्वतंत्र संक्रमण। टाइटर्स की तुलना करने के लिए वन-वे एनोवा का उपयोग किया गया था; डेटा एसडी ± मतलब है; *p < 0.05. (सी)पासिंग के कई दौर के बाद iMSCSCX+ का फ्लो साइटोमेट्री स्थिर ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के स्तर में कोई बदलाव नहीं दर्शाता है और ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के अनुपात में कोई बदलाव नहीं करता है। ध्यान दें कि 100% टाइटर्स के साथ ट्रांसड्यूड किए गए iMSCs ने P3 पर विभाजित होना बंद कर दिया। (डी) iMSCs SCX-GFP + लेंटवायरस वेक्टर (75%, MOI = 2.9 e5 TU/mL) के साथ ट्रांसड्यू किया गया और सॉर्टिंग के बिना नियमित संस्कृति के 4 सप्ताह में SCX की जीन अभिव्यक्ति का आकलन किया। SCX अभिव्यक्ति iMSCSCX में काफी upregulated था + SCX के स्थिर overexpression दिखा 4 सप्ताह के बाद. टीयू, पारगमन इकाइयों; डेटा एसडी ± मतलब है, ** पी > 0.01। पापलमप्राउ ए एट अल.14 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: iMSCSCX + एक 2D बायोरिएक्टर में वरीयता प्राप्त है और चक्रीय खिंचाव से गुजरता है। (ए) 2 डी बायोरिएक्टर योजनाबद्ध। पापलमप्राउ ए एट अल.12 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। (बी)कोशिकाओं को पहले लचीली सिलिकॉन प्लेटों में वरीयता दी जाती है और 2 डी बायोरिएक्टर में चक्रीय खिंचाव से पहले लगाव की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। (सी) iMSCSCX+ को 2D बायोरिएक्टर में 7 दिनों तक बढ़ाया गया था। स्थैतिक नियंत्रण के लिए, कोशिकाओं को समान प्लेटों में चढ़ाया गया था, लेकिन कोई खिंचाव के साथ। (सी1) 7 दिनों के बाद स्थैतिक नियंत्रण प्लेट कोशिकाओं की स्टोकेस्टिक व्यवस्था प्रदर्शित करती है। (सी2) 7 दिनों के बाद फैला हुआ प्लेट अपेक्षाकृत अधिक सेल संगठन दिखाता है। (डी) क्या नहीं देखा जाना चाहिए के तीन उदाहरण। जब सेल सीडिंग घनत्व बहुत अधिक होता है या कोशिकाओं को बहुत अधिक दिनों तक बढ़ाया जाता है, तो कोशिकाएं अलग होने लगती हैं। (डी 1) कोशिकाएं केवल थोड़ी अधिक हो जाती हैं। पीले तीर समय से पहले कोशिका संकुचन की शुरुआत का संकेत देते हैं। (डी 2) अतिवृद्धि का मध्यम स्तर। कोशिकाएं प्लेट से अलग होने लगती हैं। (डी 3) अतिवृद्धि का गंभीर स्तर। कोशिकाएं अब मोनोलेयर में नहीं बढ़ रही हैं और 3 डी संरचनाएं बनाई हैं। काले पैमाने की सलाखों = 400 माइक्रोन. सफेद पैमाने की सलाखों = 1000 माइक्रोन। (ई) खींचने के 7 दिनों के बाद (या स्थिर प्लेट के लिए संस्कृति में), कोशिकाओं को एक्टिन फिलामेंट्स (लाल) के लिए फालोलाइडिन के साथ तय किया गया था और नाभिक (नीला) के लिए डीएपीआई के साथ काउंटरस्टेन किया गया था। सफेद पैमाने पर सलाखों = 200 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक 2 डी बायोरिएक्टर में एससीएक्स ओवरएक्सप्रेशन और यूनिक्सियल खिंचाव द्वारा टेनोजेनिक मार्कर जीन अभिव्यक्ति की उत्तेजना। (ए) iMSCSCX + 7 दिनों के लिए एक 2 डी बायोरिएक्टर में बढ़ाया गया. स्थैतिक नियंत्रण के लिए, कोशिकाओं को समान प्लेटों में चढ़ाया गया था, लेकिन कोई खिंचाव के साथ। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है कि iMSCSCX + mechanoresponsive है. एनडी = कोई पता नहीं लगा। एक तरह से एनोवा प्रत्येक timepoint बनाम पर जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. डी0. एन = 8/समूह। (बी) 2 डी बायोरिएक्टर में खिंचाव के 7 दिनों के बाद कोलेजन जमाव। डेटा एसडी ± मतलब है; एन = 8/समूह; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, **** p < 0.0001. पापलमप्राउ ए एट अल.12 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, iTenocytes तीन मुख्य चरणों के माध्यम से उत्पन्न होते हैं: (1) iMSCs के लिए IPSC की प्रेरण, (2) एक lentiviral वेक्टर का उपयोग SCX की overexpression, और (3) 2D uniaxial तनाव के माध्यम से कोशिकाओं की परिपक्वता.

iMSCs में IPSC अलग करने के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले हमारे समूह द्वारा वर्णित किया गयाहै 2. उस प्रकाशन के बाद से, कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं, जिनमें नैदानिक परीक्षणों21,22,23 में iMSCs का उपयोग करने के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल शामिल है, साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भेदभाव किट भी शामिल हैं। iMSCs की ट्राइलिनेज क्षमता की समीक्षा की भी पहले जांच की गई है2. जबकि कार्यप्रणाली अलग-अलग होती है, सभी प्रोटोकॉल एमएससी सतह मार्करों की स्थिर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए कई मार्ग के लिए iMSCs के बाद के भेदभाव विस्तार की आवश्यकता पर जोर देते हैं। इस स्तर पर, लगभग 70% संगम पर 1:3 विभाजन अनुपात का उपयोग करने से गुजरने के बाद 4-6 दिनों के भीतर अपेक्षाकृत संगम प्लेट बन जाएगी।

पारगमन के लिए इष्टतम अनुमापांक का चयन करते समय, सेल व्यवहार्यता और दक्षता के बीच संतुलन बनाना महत्वपूर्ण है। जबकि 100% अनुमापांक के साथ ट्रांसड्यूड किए गए iMSCs SCX-GFP सकारात्मक कोशिकाओं के उच्चतम स्तर को दिखा सकते हैं, यह ध्यान देने योग्य है कि इन कोशिकाओं ने ट्रांसडक्शन(चित्रा 3C)के बाद तीन मार्गों को विभाजित करना बंद कर दिया, संभवतः डीएनए प्रेरित विषाक्तता के कारण। इसलिए, 100% से कम टिटर का उपयोग करना उचित है। सिलिकॉन प्लेटों बोने से पहले, यह प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग SCX-GFP स्तर reassessment करने के लिए सिफारिश की है. यदि डेटा इंगित करता है कि दक्षता वांछित सीमा से कम है, तो सीडिंग से पहले iMSCSCX+ कोशिकाओं को छांटना उचित है, विशेष रूप से विवो अनुप्रयोगों के लिए।

एक बार जब iMSCSCX+ कोशिकाओं को सिलिकॉन प्लेटों में वरीयता दी जाती है, तो उन्हें खींचने से पहले सेल अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। सिलिकॉन प्लेटों में 1.25 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 के वर्णित सेल घनत्व को मोनोलेयर अतिवृद्धि को रोकने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो स्थैतिक तनाव24में योगदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चलता है कि अलग-अलग कठोरता के सब्सट्रेट में संगम संस्कृतियों में प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क सेल व्यवहार24,25,26को बदल सकता है। पायलट प्रयोगों के दौरान, सिलिकॉन प्लेटों से कुछ दृश्यमान सेल टुकड़ी देखी गई, विशेष रूप से बाद के टाइमपॉइंट्स(चित्रा 4डी)पर। यह अतिसंगम24 के कारण ईसीएम सेल शीट के गठन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इसलिए, महत्वपूर्ण मापदंडों में सेल घनत्व और खिंचाव मुकाबलों की संख्या शामिल है। वर्तमान तरीकों में, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के माध्यम से टेनोजेनिक क्षमता के आकलन के लिए कोशिकाओं को 3 और 7 दिनों में एकत्र किया गया था। हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि कोशिकाओं को कम से कम तीन दिनों के लिए 2 डी बायोरिएक्टर में बढ़ाया जाए, अतिवृद्धि और सेल टुकड़ी को रोकने के लिए खिंचाव और स्थिर प्लेटों की बाद की निगरानी के साथ।

कई खिंचाव मुकाबलों के बाद, सेल संरेखण और संगठन की एक डिग्री (चित्रा 4सी1, ई) देखी जा सकती है। यह कई अध्ययनों के साथ संरेखित करता है जहां तनाव की धुरी के लंबवत सेल संरेखण इन विट्रो24,27 में एकअक्षीय तनाव के जवाब में मनाया जाता है। इसकी तुलना में, स्थिर प्लेट स्टोकेस्टिक सेल संगठन (चित्रा 4सी2, ई) प्रदर्शित करती है।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, केवल कुछ अध्ययनों टेनोसाइट्स या ligamentocytes 24,28,29 में एमएससी के भेदभाव के लिए SCX overexpression और यांत्रिक उत्तेजना के synergistic प्रभाव का पता लगाया है. गैस्पर एट अल ने एक समान 2 डी बायोरिएक्टर प्रणाली को नियोजित किया जैसा कि यहां वर्णित है, लेकिन कुल तनाव के उच्च स्तर (12 घंटे / दिन के लिए 1 हर्ट्ज पर 10%) लागू किया। दिलचस्प बात यह है कि वे बीएम-एमएससी और मानव टेनोसाइट्स में एससीएक्स, टीएनएमडी और सीओएल 1 ए 1 की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने में असमर्थ थे। हालांकि, यह उनके अध्ययन24 में इस्तेमाल उच्च लागू उपभेदों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. चेन एट अल बहुस्तरीय चादरों में इकट्ठे hESC-MSCs में SCX overexpress करने के लिए एक lentiviral वेक्टर का इस्तेमाल किया. उन्होंने एकअक्षीय चक्रीय भार (21 दिनों तक 2 एच/दिन के लिए 1 हर्ट्ज पर 10% तनाव) लागू किया और COL1a1, COL1a2, COL14, और TNMD के अपरेगुलेशन के साथ-साथ ईसीएम जमाव29में वृद्धि की। निकोलस एट अल क्षणिक रूप से पूर्ण लंबाई murine Scx सीडीएनए के साथ C3H10T1/2 कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया और 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को एकअक्षीय चक्रीय तनाव (1%, 1 हर्ट्ज, 30 मिनट / दिन 14 दिनों तक) के तहत सुसंस्कृत किया। हमारे निष्कर्षों के समान, उनके समूह ने तनावपूर्ण और अतिव्यक्त निर्माणों में SCX और COL1A1 की उन्नत अभिव्यक्ति देखी, लेकिन चक्रीय स्ट्रेचिंग28 के जवाब में TNMD अभिव्यक्ति में कोई बदलाव नहीं पाया।

इसके अतिरिक्त, एमकेएक्स जैसे अन्य कण्डरा-संबंधित मार्करों की अतिअभिव्यक्ति पर विचार करना पेचीदा हो सकता है। Tsutsumi एट अल ने C3H10T1/2 कोशिकाओं में MKX को ओवरएक्सप्रेस करने और उन्हें 3D सिस्टम में चक्रीय यांत्रिक स्ट्रेचिंग के अधीन करने के संयुक्त प्रभाव का पता लगाया। उन्होंने कोलेजन फाइब्रिल बंडलों और एक्टिन फिलामेंट्स30 के संरेखण के साथ-साथ SCX, COL1a1, DCN और COL3a1 के एक महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का प्रदर्शन किया।

यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि iTenocytes उत्पन्न करने के लिए इस विधि की अपनी सीमाएँ हैं। जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2D बायोरिएक्टर प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट कार्य के लिए फायदेमंद है, इसका आकार उपज को प्रतिबंधित करता है। यदि इन कोशिकाओं को उच्च-थ्रूपुट परख के लिए या कण्डरा मरम्मत चिकित्सा के लिए संभावित ऑफ-द-शेल्फ सेल स्रोत के रूप में आवश्यक है, तो बड़े पैमाने पर एकअक्षीय स्ट्रेचिंग को लागू करने में सक्षम प्रणालियों की खोज पर विचार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, आगे की जांच में स्थिर टेनोजेनिक अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए iTenocytes के विस्तार को शामिल करना चाहिए, और विवो पुनर्जनन में उनके योगदान का आकलन करना उनकी टेनोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को आंशिक रूप से NIH/NIAMS K01AR071512 और CIRM DISC0-14350 द्वारा दिमित्री शीन को समर्थित किया गया था। दो लेंटवायरस पैकेजिंग प्लास्मिड साइमन नॉट प्रयोगशाला (बायोमेडिकल साइंसेज विभाग, देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर) से एक उपहार थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 205
संयुक्त स्क्लेरैक्सिस ओवरएक्सप्रेशन और 2 डी यूनिक्सियल तनाव के <em>माध्यम से</em> प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न iTenocytes की पीढ़ी
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Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

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