Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von iTenozyten durch die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen mit kombinierter Überexpression von Sklerose unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und uniaxialer Streckung über einen 2D-Bioreaktor.
Abstract
Die heutigen Herausforderungen in der Sehnen- und Bänderreparatur erfordern die Identifizierung eines geeigneten und wirksamen Kandidaten für eine zellbasierte Therapie zur Förderung der Sehnenregeneration. Mesenchymale Stromazellen (MSCs) wurden als potenzielle Tissue-Engineering-Strategie für die Sehnenreparatur untersucht. Obwohl sie multipotent sind und in vivo ein regeneratives Potenzial haben, sind sie in ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit begrenzt und weisen eine phänotypische Heterogenität auf. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können diese Einschränkungen aufgrund ihrer hohen Selbsterneuerungsfähigkeit und ihrer beispiellosen Entwicklungsplastizität umgehen. In der Tenozytenentwicklung ist die Skleraxis (Scx) ein entscheidender direkter molekularer Regulator der Sehnendifferenzierung. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Mechanoregulation ein zentrales Element ist, das die embryonale Sehnenentwicklung und -heilung steuert. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll entwickelt, um den synergistischen Effekt biologischer und mechanischer Stimulation zu erfassen, der für die Bildung von Tenozyten unerlässlich sein kann. iPS-Zellen wurden zu mesenchymalen Stromazellen (iMSCs) induziert und mittels Durchflusszytometrie mit klassischen mesenchymalen Stromazellmarkern charakterisiert. Als nächstes wurden die iMSCs mit Hilfe eines lentiviralen Vektors transduziert, um SCX stabil zu überexprimieren (iMSCSCX+). Diese iMSCSCX+ Zellen können durch einachsige Zugbelastung mit einem 2D-Bioreaktor zu iTenozyten weiter gereift werden. Die resultierenden Zellen wurden durch die Beobachtung der Hochregulierung von frühen und späten Sehnenmarkern sowie der Kollagenablagerung charakterisiert. Diese Methode zur Generierung von iTenozyten kann verwendet werden, um Forscher bei der Entwicklung einer potenziell unbegrenzten allogenen Zellquelle von der Stange für Sehnenzelltherapieanwendungen zu unterstützen.
Introduction
Um die aktuellen Probleme bei der Reparatur von Sehnen und Bändern anzugehen, ist ein entsprechender Zellkandidat erforderlich, der für zellbasierte Therapien geeignet ist. Ein Forschungsansatz im Bereich des Tissue Engineering für die Sehnenreparatur ist die Erforschung von aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stromazellen (BM-MSCs) und aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen (ASCs) als mögliche Strategien. Diese Zellen verfügen über multipotente Fähigkeiten, eine große Häufigkeit und ein regeneratives Potenzial in vivo. Darüber hinaus haben sie eine verbesserte Heilungskapazität und verbesserte funktionelle Ergebnisse in Tiermodellen gezeigt1. Nichtsdestotrotz weisen diese Zellen eine eingeschränkte Selbsterneuerungsfähigkeit, eine phänotypische Diversität und vor allem eine begrenzte Fähigkeit zur Sehnenbildung auf. Die Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) bietet aufgrund ihrer bemerkenswerten Selbsterneuerungsfähigkeit und ihrer unübertroffenen Entwicklungsanpassungsfähigkeit eine Lösung für diese Einschränkungen. Unserem Forschungsteam und anderen ist es gelungen, iPS-Zellen erfolgreich in mesenchymale stromazellähnliche Einheiten (iMSCs) zu differenzieren2,3. Daher haben iMSCs das Potenzial, eine allogene Quelle für Sehnenzelltherapieanwendungen zu sein.
Die Skleraxis (SCX) ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Sehnenentwicklung essentiell ist und gilt als der früheste nachweisbare Marker für differenzierte Tenozyten. Darüber hinaus aktiviert SCX nachgeschaltete Sehnendifferenzierungsmarker, darunter Typ-1a1-Kettenkollagen 1 (COL1a1), Irokesenschnitt (MKX) und Tenomodulin (TNMD), unter anderem 4,5,6. Andere Gene, die während der Sehnenreifung exprimiert werden, sind das Tubulin-Polymerisations-fördernde Proteinfamilienmitglied 3 (TPPP3) und der Thrombozyten-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRa)7. Diese Gene sind zwar essentiell für die Entwicklung und Reifung von Sehnen, kommen aber leider nicht nur im Sehnengewebe vor, sondern werden auch in anderen Muskel-Skelett-Geweben wie Knochen oder Knorpel exprimiert 5,7.
Neben der Expression von Markern während der Sehnenentwicklung ist die Mechanostimulation ein wesentliches Element für die embryonale Sehnenentwicklung und -heilung 4,5,6. Sehnen sind mechanoresponsive und ihre Wachstumsmuster ändern sich als Reaktion auf ihre Umgebung. Auf molekularer Ebene beeinflussen biomechanische Signale die Entwicklung, Reifung, Erhaltung und Heilungsreaktionen von Tenozyten8. Verschiedene Bioreaktorsysteme wurden verwendet, um physiologische Belastungen und biomechanische Signale zu modellieren. Einige dieser Modellsysteme umfassen ex vivo Gewebebeladung, 2D-Zellladesysteme, die biaxiale oder uniaxiale Spannung anwenden, und 3D-Systeme mit Gerüsten und Hydrogelen 9,10. 2D-Systeme sind vorteilhaft, wenn es darum geht, die Auswirkungen der mechanischen Stimulation auf sehnenspezifische Gene oder die Morphologie der Zellen im Zusammenhang mit dem Zellschicksal zu untersuchen, während 3D-Systeme Zell-EZM-Interaktionen genauer replizieren können 9,10.
Bei 2D-Ladesystemen ist die Spannung zwischen den Zellen und dem Kultursubstrat homogen, was bedeutet, dass die Belastung des Zytoskeletts der Zellen vollständig kontrolliert werden kann. Im Vergleich zur biaxialen Belastung ist die einachsige Belastung physiologisch relevanter, da Tenozyten in vivo überwiegend einer einachsigen Belastung durch Kollagenbündel ausgesetzt sind 9. Es wurde festgestellt, dass Sehnen bei täglichen Aktivitäten einer einachsigen Zugbelastung von bis zu 6 % Dehnungausgesetzt sind 11. Insbesondere haben frühere Studien gezeigt, dass eine Belastung im physiologischen Bereich von 4 % bis 5 % die tenogene Differenzierung fördert, indem die sehnenbezogene Markerexpression wie SCX und TNMD erhalten bleibt und die Kollagenproduktion erhöhtwird 9,10. Stämme von mehr als 10 % können traumatisch, aber nicht physiologisch relevant sein12,13.
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das den synergistischen Effekt der mechanischen und biologischen Stimulation berücksichtigt, der für die Bildung von Tenozyten essentiell sein kann. Wir beschreiben zunächst eine reproduzierbare Methode zur Induktion von iPS-Zellen in iMSCs durch kurzzeitige Exposition von Embryoidkörpern gegenüber Wachstumsfaktoren, die durch MSC-Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird. Anschließend beschreiben wir eine lentivirale Transduktionsmethode, um iMSCs so zu manipulieren, dass sie eine stabile Überexpression von SCX (iMSCSCX+) aufweisen. Für die weitere Zellreifung werden die iMSCSCX+ in Fibronektin-beschichtete Silikonplatten eingeschleust und mit dem CellScale MCFX-Bioreaktor einem optimierten uniaxialen Spannungsprotokoll unterzogen. Das tenogene Potenzial wurde durch die Beobachtung der Hochregulierung von frühen und späten Sehnenmarkern sowie der Kollagenablagerung bestätigt14. Diese Methode zur Generierung von iTenozyten ist ein Proof-of-Concept, der eine unbegrenzte, allogene Standardquelle für Sehnenzelltherapieanwendungen bieten könnte.
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Protocol
Dieses Protokoll zur Herstellung von iTenozyten kann in drei Hauptschritten durchgeführt werden: iPSCs zu iMSCs (10 Tage), iMSC zu iMSCSCX+ (2 Wochen), iMSCSCX+ zu iTenozyten (mindestens 4 Tage). Jeder wichtige Schritt im Protokoll kann je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden. Für Methoden, die mit der Kultivierung von Zellen verbunden sind, sollten sterile Techniken angewendet werden. Alle Zellen in diesem Protokoll sollten bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit gezüchtet werden.
1. Humane iPSC-Induktion in induzierte mesenchymale Stromazellen (iMSCs)
- Vorbereitung von Experimenten
- Bereiten Sie Iscoves Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) Medium vor.
- Ergänzen Sie 50 ml IMDM-Basalmedien mit 8,5 ml Knock-out-Serumersatz, 500 μl nicht-essentiellen Aminosäuren des minimalen essentiellen Mediums (MEM), 0,385 μl (110 mM Stamm) Beta-Mercaptoethanol und 500 μl antibiotisch-antimykotischer Lösung (AAS) (Endkonzentrationen: 17 %, 1 %, 110 μM, jeweils 1 %) (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie mesenchymale Stromazellen (MSC) vor.
- Ergänzen Sie 440 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt mit 50 ml fötalem Kälberserum (FBS), 5 ml antibiotisch-antimykotischer Lösung (AAS) und 5 ml L-Glutamin (Endkonzentrationen: 10 %, 1 %, 2 mM).
- Bereiten Sie mit Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA) beschichtete Platten vor.
- Geben Sie 10 g des Poly-HEMA (siehe Materialtabelle) in eine sterile Flasche.
- Geben Sie einen Magnetrührer in die Flasche und fügen Sie unter Rühren langsam 500 ml 95% EtOH hinzu.
- Sobald das gesamte EtOH zugegeben wurde, schalten Sie den Rührmodus bei 1200 U/min mit zusätzlicher niedriger Hitze für mindestens 6 h ein. Die Poly-HEMA-Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu einem Jahr gelagert werden.
- Unter sterilen Bedingungen 2,5 μg/cm2 in 9 ml in einen T75-Kolben geben. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an.
- Um die Sterilität zu wahren, lassen Sie die Gefäße an der Luft trocknen, damit das EtOH vor der Verwendung vollständig verdunsten kann. Dies dauert in der Regel 24-72 h.
- Bereiten Sie mit Gelatine überzogene Kolben vor.
- Waschen Sie eine Glasflasche mit NaOH und widmen Sie sie der Gelatinezubereitung. Verwenden Sie kein Reinigungsmittel.
- Bereiten Sie 1%ige Gelatinelösung (5 g Gelatine und 500 ml endotoxinfreies Wasser) vor. Autoklavieren Sie die Glasflasche mit der Gelatinelösung für 30 Minuten.
- Lassen Sie die Gelatinelösung abkühlen und sie kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Einen T75-Kolben mit 5 ml Gelatinelösung pro Kolben bestreichen und vor der Aussaat der Zellen mindestens 1 Stunde lang inkubieren. Mit Gelatine überzogene Kolben können 1 Tag im Voraus zubereitet werden.
- Bereiten Sie den Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor.
- Mischen Sie PBS mit 2 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Natriumazid. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie Iscoves Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) Medium vor.
- Generierung von Embryoidkörpern (EBs)
HINWEIS: iPS-Zellen sollten in einer 6-Well-Platte kultiviert werden und vor der Verwendung eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.- Bringen Sie an Tag 0 eine 384 PCR-Platte mit klarem Boden in die Gewebekulturhaube und strahlen Sie sie 15 Minuten lang ohne Deckel ein.
- Entfernen Sie das Nährmedium aus den iPS-Zellen (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Vertiefungen mit PBS.
- In jede Vertiefung werden 0,5 ml vorgewärmtes, schonendes Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) gegeben und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Beobachten Sie die Zellen alle 5 Minuten, bis die iPS-Zellen zu Einzelzellen oder kleinen Aggregaten geworden sind, die in Suspension angehoben werden.
- Resuspendieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in IMDM-EB-Medien (Schritt 1.1.1) und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
- Berechnen Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension, das erforderlich ist, um 5.000-25.000 Zellen pro Well der 384-Well-Platte mit 25 μl Zellsuspension pro Well zu erreichen.
HINWEIS: Im Allgemeinen können 2-3 konfluente (70%-80%) Wells einer 6-Well-Platte EBs in einer 384-Well-Platte erzeugen. Die Größe der Zellen pro EB wird empirisch ermittelt. Für eine gesamte 384-Well-Platte müssen 9,6 ml Zellsuspension verwendet werden, 25 μl pro Well. - Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen IMDM-EB-Medien und 10 μM Y-27632-Dihydrochlorid (Stamm: 10 mM, 1000x, siehe Materialtabelle) in einem vorgekühlten konischen 15-ml-Röhrchen.
- Kalt gelöste Basalmembranmatrix (1 mg pro 384-Well-Platte EBs) in die konische Matrix geben (siehe Materialtabelle).
- Verteilen Sie 25 μl der Zellsuspension auf jede Vertiefung. Einen sterilen Deckel auf die Platte legen und bei 450 x g bei 4 °C 7 min lang schleudern. 48 h bei 37 °C inkubieren.
- An Tag 2 werden die Zellen auf eine 100-mm-Platte mit 3 ml vorgewärmtem IMDM-EB-Medium übertragen.
- Überführen Sie die EBs in die speziellen polyHEMA-beschichteten T75-Kolben mit 10 ml IMDM-EB. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an. Lassen Sie die EBs 3 Tage lang wachsen.
- Am 5. Tag werden die EBs in die vorbereiteten gelatinebeschichteten T75-Kolben mit 10 ml IMDM-EB-Medien überführt. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an. Züchte die EBs für weitere 3 Tage in Suspension.
- Stellen Sie am 8. Tag sicher, dass zwei Arten von EBs beobachtet werden: EBs, die an den Kolben gebunden sind, und nicht gebundene EBs. Waschen Sie die nicht anhaftenden EBs mit PBS aus dem Kolben.
- Fügen Sie den beigefügten EBs IMDM-EB-Medien hinzu, die mit TGFβ-1 (10 ng/ml) (siehe Materialtabelle) ergänzt sind, und lassen Sie sie 2 Tage lang wachsen.
- Wechseln Sie an Tag 10 das Medium auf MSC-Medium. Die Zellen sollten zweimal pro Woche gefüttert werden. Sobald 70 % konfluent sind, fahren Sie mit dem "Standard-Hebezellenprotokoll" fort, um die Zellen neu zu beschichten. Die Zellen werden auf gelatinebeschichteten Platten neu beschichtet.
- Standardprotokoll für Hebezellen
- Sobald die adhärenten Zellen eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium von den Platten ab und waschen Sie es mit PBS.
- Die Zellen werden angehoben, indem 5 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin auf jede 150-mm-Platte gegeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert werden. Passen Sie das Trypsinvolumen entsprechend der Größe des Kulturgefäßes an.
- Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die meisten Zellen von jeder Platte abgehoben wurden. Wenn noch Zellen anhaften, klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platten, um die Zellen zu entfernen.
- Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Röhrchen, indem Sie das doppelte Volumen des vorgewärmten Wachstumsmediums hinzufügen.
- Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 5 min bei 300 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie mit den nächsten Schritten fort.
- Durchflusszytometrische Beurteilung der MSC-Markerexpression
HINWEIS: Humane MSCs, wie Knochenmark-MSCs, sollten als Positivkontrolle verwendet werden.- Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
- Resuspendieren Sie den Überstand mit 3 ml FACS-Puffer und überführen Sie das gesamte Volumen in FACS-Röhrchen.
- Bei Raumtemperatur 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschschritt mit FACS-Puffer noch zwei weitere Male.
- Zu den gefärbten Röhrchen werden 2 μl Maus-Antihuman-CD90-FITC, Maus-Antihuman-CD44-APC und Antihuman-CD105-PE (siehe Materialtabelle) zugegeben und 45 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.
- Geben Sie 20 μl Maus-IgG2a-FITC, Maus-IgG1-PB und Maus-IgG1-PE in die Isotyp-Kontrollröhrchen (siehe Materialtabelle).
- Im Dunkeln bei 4 °C 15 min inkubieren. Waschen Sie alle Röhrchen, indem Sie 3 ml FACS-Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 μl FACS-Puffer für jedes Röhrchen.
- Analyse der Expression der MSC-Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie14. Anregungs- und Emissionswellenlängen sollten sein: CD90-FITC, Anregungsspitze bei 495 nm und Emissionsspitze bei 519 nm; CD44-APC, Anregungsmaximum bei 640 nm und Emissionsmaximum bei 660 nm; CD105-PE, Anregungsmaximum bei 561 nm und Emissionsmaximum bei 574 nm.
2. iMSC-Passage und -Erweiterung
- Vorbereiten von Reagenzien
- Bereiten Sie MSC-Freeze-Medien vor.
- Kombinieren Sie 30 ml DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, 5 ml DMSO und 15 ml FBS (Endkonzentrationen: 60 %, 10 %, 30 %).
- Die Lösung wird mit einem sterilen 0,45-μm-Filter filtriert. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie MSC-Freeze-Medien vor.
- Passage
HINWEIS: Nach der Induktion müssen iMSCs für weitere 2 Passagen auf gelatinebeschichteten Platten gezüchtet werden, bevor sie auf Kunststoffgewebekulturplatten entwöhnt werden. Darüber hinaus sollten die Zellen mit einem Teilungsverhältnis von 1:3 durchgelassen werden, wenn 70 % konfluent sind.- Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
- Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig auf drei neue 150-mm-Platten mit T175-Kolben mit 20 ml Medien pro Kolben. Bringen Sie die Zellen wieder auf 37 °C.
- Füttern Sie die Zellen zweimal pro Woche, indem Sie das Wachstumsmedium durch vorgewärmte MSC-Medien ersetzen.
- Gefrieren
- Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml MSC-Gefriermedium. Geben Sie 1 ml Zellsuspension in ein Kryoröhrchen und lagern Sie es 24 Stunden lang in einem Gefrierbehälter bei -80 °C, bevor Sie es zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen.
- Auftauen
- Bereiten Sie 10 ml vorgewärmtes MSC-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor.
- Nehmen Sie das Kryoröhrchen heraus, tauchen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad und schwenken Sie es, bis eine erbsengroße Eiskugel übrig bleibt (ca. 1-2 min).
- In der Zellkulturhaube langsam 1 ml des vorgewärmten Mediums in das Kryoröhrchen geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
- Die Zellsuspension wird aus dem Kryoröhrchen in das vorbereitete konische 15-ml-Röhrchen mit vorgewärmtem Medium überführt und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn mit frischem Medium. Geben Sie die Zellsuspension auf eine 150-mm-Platte mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturkolbens an.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sie sich teilen können.
3. Gentechnik von iMSCs zur Überexpression von SCX mittels lentiviraler Transduktion
HINWEIS: Das Ausfüllen dieses Abschnitts des Protokolls dauert zwei Wochen.
- Vorbereitung von Medien und Reagenzien
- Bereiten Sie HEK293T/17-Zellmedien vor.
- Ergänzen Sie 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit 50 ml FBS und 5 ml AAS (Endkonzentrationen: 10 %, 1 %).
- Bereiten Sie MSC-Lenti-Packmedien vor.
- Bereiten Sie das hitzeinaktivierte Serum vor, indem Sie 50 ml FBS bei Raumtemperatur in einem 60 °C warmen Wasserbad 30 Minuten lang erhitzen.
- Kombinieren Sie 445 ml DMEM mit niedrigem Glukosegehalt mit dem hitzeinaktivierten FBS und 5 ml L-Glutamin (Endkonzentrationen: 10 %, jeweils 2 mM).
- Bereiten Sie den Transfektionskomplex vor.
- Transfektionskomplexe Komponenten (siehe Materialtabelle) auf Eis auftauen lassen: Verpackungsplasmide VSV-G und Delta, SCX-Plasmid und BioT15,16.
- Wirbeln Sie die Plasmide sanft vor und drehen Sie sie herunter. Messen Sie die DNA-Konzentrationen.
- Berechnen Sie auf der Grundlage der DNA-Konzentrationen und der Anzahl der für die Transfektion vorgesehenen Kolben das Volumen jeder benötigten Komponente: Für einen T75-Kolben besteht der Transfektionskomplex aus 750 μl serumfreiem Medium (wie serumfreiem DMEM oder PBS), 7,5 μg SCX-Plasmid, 0,75 μg VSV-G-Plasmid, 6,75 μg Delta-Plasmid und 22,5 μl BioT. Berücksichtigen Sie einen zusätzlichen Pipettierfehler.
- Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Kurz in einer Zentrifuge schleudern. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und sofort verbrauchen.
- Bereiten Sie HEK293T/17-Zellmedien vor.
- Transfektion und lentivirale Produktion
VORSICHT: Ab Tag 3 beinhaltet das Protokoll die Arbeit mit dem Lentivirus, und daher muss die Arbeit unter Verwendung von Betriebsverfahren der Eindämmungsstufe 2+ durchgeführt werden. Die Arbeiter müssen persönliche Schutzausrüstung tragen, darunter zwei Schichten Handschuhe, Handgelenksbedeckungen, Schutzbrillen, eine Maske sowie lange Hosen und geschlossene Schuhe. Alle Abfälle und Materialien, einschließlich Pipettenspitzen, Kolben und flüssiges Medium, müssen mindestens 20 Minuten lang mit Bleichmittel (1 % Natriumhypochlorit) dekontaminiert werden. Verwenden Sie den Staubsauger nicht.- Aussaat HEK293T/17 Zellen.
- Etwa 18-24 Stunden vor der Transfektion (Tag 0) werden die 293T-Zellen in T75-Kolben gehoben und plattiert. In den folgenden Bänden wird T75 als Kulturgefäß angenommen. Passen Sie das Volumen entsprechend dem verwendeten Zellkulturgefäß an.
- Das Nährmedium aus den Kolben nehmen und mit 5 ml PBS waschen.
HINWEIS: Die Zellen heben sich sehr leicht von der Oberfläche des Kolbens ab. PBS an den Rand des Kolbens geben und die direkte Zugabe von Lösung zu den Zellen vermeiden. - In jeden Kolben werden 3 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin gegeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden in ein konisches Röhrchen gefüllt und bei Raumtemperatur 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in 293T-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
- Die Zellen werden mit 5,3 x 104 Zellen/cm2 plattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
- Am nächsten Tag (Tag 1) bereiten Sie den Transfektionskomplex vor. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen durch 5 ml vorgewärmtes MSC-Lenti-Verpackungsmedium (Schritt 3.1.2).
- Geben Sie den Transfektionskomplex tropfenweise in die Zellen. Kippen Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Exposition des Transfektionskomplexes gegenüber den Zellen zu gewährleisten. Legen Sie die Zellen für 48 Stunden zurück in den Inkubator.
HINWEIS: Die Toxizität sollte nach 24 Stunden (Tag 2) beobachtet werden. - Nach 48 h (Tag 3) wird das virushaltige Medium vorsichtig mit einer Pipette in ein separates konisches Röhrchen aufgefangen und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
- 5 ml vorgewärmtes MSC-Lenti-Verpackungsmedium in den T75-Kolben mit 293T-Zellen geben und über Nacht in den Inkubator zurückgeben.
- Nach der Zentrifugation filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45 μm Sterilfilter, indem Sie den Überstand direkt durch den Filter pipettieren. Lagern Sie das virenhaltige Medium über Nacht bei 4 °C.
- Nach weiteren 24 h (Tag 4) wird das virushaltige Medium erneut vorsichtig mit einer Pipette in ein separates konisches Röhrchen aufgefangen und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
- Kombinieren Sie das Virus mit dem Virus vom vorherigen Abholtag und mischen Sie es, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden. Das Lentivirus kann aliquotiert und bei -80 °C eingefroren werden, oder das Lentivirus kann auf Eis gelagert werden, während mit der "Transduktion von iMSCs mit SCX" (Schritt 3.3) fortgefahren wird.
HINWEIS: Sobald die Lentivirus-Aliquots eingefroren und aufgetaut sind, nicht wieder einfrieren.
- Aussaat HEK293T/17 Zellen.
- Transduktion von iMSCs mit SCX
- Titerplattentransduktion durchführen.
- Führen Sie an Tag 0 das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
- Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
- In eine 6-Well-Platte 4 x 103 Zellen/cm2 geben. Den Rest in eine zusätzliche 150-mm-Platte mit 20 ml MSC-Medium eintragen (dies wird die Kontrollplatte sein). Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 °C.
- Am nächsten Tag (Tag 1) sollten die Zellen ~40% konfluent sein. Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der Lenti-Verpackung vor und tauen Sie das Polybrene und ca. 3 ml Lentivirus auf Eis auf Eis auf (oder, wenn dies am selben Tag wie die Virusentnahme geschieht, lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis).
- Geben Sie das Wachstumsmedium der Lenti-Verpackung und das Lentivirus basierend auf den gewünschten Titern (d. h. 12,5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %) in die Vertiefungen. Fügen Sie 0,5 μl Polybrene hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erreichen (Stammkonzentration: 10 mg/ml, siehe Materialtabelle).
- Schwenken Sie die Platte, um eine gleichmäßige Exposition aller Zellen zu gewährleisten. Die Platte wird für 48 h bei 37 °C in den Inkubator zurückgelegt.
- Beurteilen Sie die Effizienz des SCX-Lentivirus-Titers mit Durchflusszytometrie.
- Führen Sie nach 48 Stunden das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
- Resuspendieren Sie die Zellen im PBS und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn zum Waschen in 3 ml FACS-Puffer. Die Zellsuspension wird in Durchflusszytometrieröhrchen überführt und 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
- Wiederholen Sie die FACS-Pufferwäsche noch zwei weitere Male und resuspendieren Sie die endgültigen Zellpellets in 300 μl FACS-Puffer. Beurteilen Sie die GFP-Expression für jeden Titer mit einem Durchflusszytometriegerät.
- Bestimmen Sie auf der Grundlage der Titer und der Anzahl der Zellviabilität den geeigneten Lentivirus-Titer, um mit der Transduktion fortzufahren. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden.
- Führen Sie eine groß angelegte SCX-Transduktion durch.
HINWEIS: Die angegebenen Volumina gelten pro 1x 150 mm Platte oder 1x T175 Kolben. Dies kann je nach gewünschter Gefäßgröße und Transduktionsmaßstab entsprechend angepasst werden.- Führen Sie an Tag 0 das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
- Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler. Säen Sie die Zellen mit 4 x 103 Zellen/cm2 aus. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 °C.
- Am nächsten Tag (Tag 1) sollten die Zellen ~40% konfluent sein. Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der Lenti-Verpackung vor und tauen Sie das Polybrene und die vorberechnete Menge des Lentivirus auf Eis auf.
- Basierend auf dem festgelegten Titer geben Sie die gewünschte Menge an Lenti-Verpackungsnährmedium und Lentivirus in die Vertiefungen. 5 μg/ml Polybrene (Stammkonzentration: 10 mg/ml) hinzufügen.
- An Tag 3 werden die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Der neu hergestellte iMSCSCX+ soll GFP fluoreszieren. Ersetzen Sie das virushaltige Medium durch vorgewärmte MSC-Medien. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden.
- Titerplattentransduktion durchführen.
4. iMSCSCX+ Passage und Erweiterung
- Führen Sie das Durchlassen, Expandieren, Einfrieren und Auftauen von iMSCSCX+ auf die gleiche Weise wie bei iMSCs durch, wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben.
5. Mechanische Belastung
HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert mindestens 4 Tage, kann aber länger sein, je nachdem, ob eine Zellkontraktion beobachtet wird.
- Vorbereitung von Experimenten
- Bereiten Sie die Silikonplatten vor.
- Autoklaven Sie 2 Silikonplatten (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie anschließend unter sterilen Bedingungen die Silikonplatten aus dem Autoklavenbeutel und legen Sie sie in 150-mm-Platten.
- Kombinieren Sie 130 μl Fibronektin (100x, siehe Materialtabelle) mit 13 ml sterilem PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen.
- Geben Sie 400 μl Fibronektinlösung in jede Vertiefung der Silikonplatten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für mindestens 2 h oder über Nacht.
- Saugen Sie die Fibronektinlösung vor Gebrauch an und lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang in der Zellkulturhaube an der Luft trocknen, damit die Fibronektinlösung vollständig verdunsten kann.
HINWEIS: Die Fibronektinlösung kann im Voraus aus den Vertiefungen entfernt werden, und die jetzt beschichteten Platten können bis zu ein paar Wochen bei 37 °C stehen, bis sie verwendet werden.
- Bereiten Sie die MSC-Stretchmedien vor.
- Bereiten Sie MSC-Stretchmedien vor, indem Sie 140 μl Ascorbinsäure (Stamm: 100x, Endkonzentration: 50 μg/ml) zu 14 ml vorgewärmtem MSC-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen hinzufügen.
HINWEIS: Die Ascorbinsäure muss vor jedem Medienwechsel frisch in das MSC-Medium gegeben werden.
- Bereiten Sie MSC-Stretchmedien vor, indem Sie 140 μl Ascorbinsäure (Stamm: 100x, Endkonzentration: 50 μg/ml) zu 14 ml vorgewärmtem MSC-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen hinzufügen.
- Bereiten Sie die Silikonplatten vor.
- Aussaat von iMSCSCX+ in den Silikonplatten
- Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
- Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
- Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das erforderlich ist, um 1,25 x 104 Zellen/cm2 zu erhalten.
- Entfernen Sie dieses Volumen des MSC-Stretchmediums aus dem konischen 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie die Zielzellen hinzu. Invertieren Sie die neue Zellsuspension, um sie homogen zu machen.
- Geben Sie 400 μl der neuen Zellsuspension in jede Vertiefung beider Silikonplatten.
- Setzen Sie den Deckel wieder auf die 150-mm-Platten und legen Sie sie für 24 h bei 37 °C in den Inkubator.
- Einachsige Spannung
- Am nächsten Tag wird der Streckapparat (siehe Materialtabelle) mit ddH2O gefolgt von 70% Ethanol gespült. Wischen Sie das Gerät ab, legen Sie es in die Zellkulturhaube und setzen Sie es 15 Minuten lang UV ein.
- Holen Sie die ausgesäten Platten heraus und überprüfen Sie die Vertiefungen auf gute Zellhaftung.
- Lassen Sie eine Platte im Inkubator (statische Kontrolle) und legen Sie die zweitgesäte Silikonplatte in den Streckapparat, indem Sie die Schrauben an den Löchern in der Silikonplatte ausrichten. Setzen Sie den Deckel des Geräts wieder auf, um die Sterilität zu gewährleisten.
- Befestigen Sie das Gerät mit der beatmeten Silikonplatte an der elektronischen Quelle (siehe Materialtabelle) und stellen Sie es bei 37 °C in den Inkubator.
- Stellen Sie im Programm das zyklische Dehnungsprotokoll auf 4 % sinusförmige Dehnung, 0,5 Hz, 2 Stunden pro Tag ein. Beginnen Sie die Dehnung, indem Sie den Startknopf einmal drücken. Das Dehnen sollte sofort beginnen.
- Dehnen Sie die Zellen für mindestens 3 Tage. Überwachen Sie die Zellen täglich und stoppen Sie das Dehnungsprotokoll, wenn eine Zellkontraktion beobachtet werden kann. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag zu neuen MSC-Stretchmedien.
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Representative Results
Humane iPS-Zellen Differenzierung zu iMSCs
Wie bereits beschrieben, beinhaltet das derzeitige Protokoll zur Differenzierung von iPS-Zellen in iMSCs die Bildung von Embryoidkörpern2. Dieser Prozess dauert etwa zehn Tage, um iMSCs aus iPS-Zellen zu induzieren (Abbildung 1A). Es wird jedoch dringend empfohlen, die neu generierten iMSCs mindestens zweimal zu passieren. Dies trägt nicht nur dazu bei, die Notwendigkeit von gelatinebeschichteten Platten zu eliminieren, sondern etabliert auch eine stabile MSC-Expression. Die Quantifizierung der Durchflusszytometrie, die nach sechs Passagen nach der Differenzierung durchgeführt wird, zeigt eine nahezu reine Zellpopulation mit hoher Expression klassischer MSC-Oberflächenmarker, einschließlich CD44 (83,1 %), CD90 (88,4 %) und CD105 (99,2 %)17,18 (Abbildung 1B). In Bezug auf die Morphologie sollten iMSCs den Knochenmark-MSCs sehr ähnlich sein und länglich und fibroblastenartig erscheinen (Abbildung 1C).
Gentechnik von iMSCs zur Überexpression von SCX mittels lentiviraler Transduktion
Lentiviren wurden durch Transfizierung von HEK293T/17-Zellen mit dem pLenti-C-mGFP-Vektor hergestellt, in den SCXB eingefügt wurde, um SCX-GFP+ zusammen mit zwei Verpackungsplasmiden zu exprimieren. Die Transfektionen wurden mit der BioT-Methode 15,16 mit einem Verhältnis von 1,5:1 von BioT (μl) zu DNA (μg) durchgeführt.
HEK293T/17 Zellen wurden 18-24 h vor der Transfektion mit einer Dichte von 5,3 x 104 Zellen/cm2 ausgesät. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollten die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 95 % erreichen, um Titer mit geringer Effizienz zu vermeiden (Abbildung 2B1, links). Innerhalb von 24 Stunden nach Zugabe des Plasmidcocktails wurde eine gewisse Toxizität beobachtet, die nach 48 Stunden ihren Höhepunkt erreichte (Abbildung 2B2). Da der lentivirale SCX-Vektor GFP-konjugiert ist, sollte die GFP-Expression nach 48 h beobachtbar sein (Abbildung 2B3). Das Vorhandensein einer hohen Toxizität in Kombination mit der GFP-Expression ist ein zuverlässiger Indikator für eine erfolgreiche Transfektion. Das Lentivirus wurde nach 48 h und 72 h gesammelt und die Transduktionseffizienz mittels Durchflusszytometrie und Genexpressionsanalyse untersucht. Die absolute Intensität der GFP-positiven Zellen wurde als Proxy für SCX-Integrationen verwendet und war in den höheren Titern signifikant höher (Abbildung 3A). Die Transduktionseffizienz, gemessen als Prozentsatz der SCX-GFP+ -Zellen, zeigte einen Dosis-Wirkungs-Effekt basierend auf der lentiviralen Last (Abbildung 3B). Die Durchflusszytometrie des iMSCSCX+ an verschiedenen Passagen zeigte ebenfalls eine hohe Stabilität, ohne Veränderungen der Transgenexpression oder des Anteils der transduzierten Zellen (Abbildung 3C). Darüber hinaus behielt der iMSCSCX+ nach 4 Wochen regulärer Kultur ohne Sortierung eine stabile Überexpression von SCX bei (Abbildung 3D). Die groß angelegte Transduktion wurde auf der Grundlage des Titers durchgeführt, wobei 75 % Lentivirus verwendet wurden (Abbildung 2C).
Mechanische Belastung des iMSCSCX+
Die iMSCSCX+-Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1,25 x 104 Zellen/cm2 auf verformbare Silikonplatten gesät (Abbildung 4A,B), um die Zellanhaftung vor Beginn des Dehnungsprotokolls zu ermöglichen. Die endgültige Aussaatdichte wurde optimiert, um eine Überwucherung der Monoschicht zu verhindern. Es ist erwähnenswert, dass eine zu hohe Aussaatdichte zu einer vorzeitigen Zellkontraktion und einem frühen Zelltod führte (Abbildung 4D). Für die statische Kontrollgruppe wurden die Zellen in identischen Platten plattiert, ohne jedoch gestreckt zu werden. Die iMSCSCX+-Zellen wurden in einem 2D-Bioreaktor für mindestens drei Tage, bis zu sieben Tage, bei 4 % uniaxialer Dehnung und 0,5 Hz für 2 h pro Tag gestreckt. Dieses Dehnungsprogramm steht im Einklang mit dem, was als physiologisch relevant beschrieben wurde9. Nach mehrtägiger Dehnung kann ein gewisser Grad an Zellorganisation im Vergleich zur statischen Gruppe beobachtet werden, die eine zufällige Zellorganisation aufwies (Abbildung 4C). Die Phalloidin-Färbung der Aktinfilamente zeigt außerdem, wie die Zellen senkrecht zur Dehnungsrichtung zu wachsen scheinen, im Gegensatz zu der zufälligen Zellorganisation, die in den statischen Platten beobachtet wurde (Abbildung 4E). Um die neu erzeugten iTenozyten zu charakterisieren, wurden die Zellen nach drei und sieben Tagen für die Genexpressionsanalyse gesammelt, wie bereits berichtet14. Die Genexpressionsanalyse zeigt, dass die iMSCSCX+-Zellen mechanoresponsive sind, da es eine signifikante Hochregulierung der tenogenen Gene (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX und TPPP3)5,7,19,20 sowohl nach drei als auch nach sieben Tagen gibt, verglichen mit nur den iMSCs an Tag 0 (Abbildung 5A). Darüber hinaus war die Kollagenablagerung im Medium nach 7 Tagen Dehnung in der gedehnten iMSCSCX+-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen signifikant höher (Abbildung 5B).
Abbildung 1: iMSC-Differenzierungsschema und durchflusszytometrische Charakterisierung. (A) Schematische Darstellung der iTenozyten-Generierung und Zeitplan für die iMSC-Induktion. Wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung von Papalamprou A. et al.14. (B) Die Quantifizierung der Durchflusszytometrie zeigt einen hohen Prozentsatz von Zellen, die nach 6 Passagen nach der Differenzierung klassische MSC-Oberflächenmarker für iPSC-abgeleitete MSCs exprimieren. Adaptiert mit freundlicher Genehmigung von Sheyn D. et al.2. (C) Phasenkontrastbilder von Zellen nach der Differenzierung zeigen eine fibroblastenähnliche Morphologie. Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der iMSCSCX+ -Produktion. (A) Gesamtschematische Darstellung der Transfektion unter Verwendung des SCX-Lentivirus-Vektors der 2. Generation und der Transduktion von iMSCs. Wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung von Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 Zellen vor der Zugabe des Plasmidcocktails. (B2) HEK293T/17 Zellen, nach 48 h, exprimieren GFP und zeigen Toxizität. (B3) Die Expression von GFP, die in HEK293T/17-Zellen beobachtet werden kann, deutet auf eine erfolgreiche Transfektion hin. (C) Erzeugte iMSCSCX+ Zellen (mit 75% Titer) exprimieren SCX-GFP+ in den Zellkernen. Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestimmung der Transduktionseffizienz mittels Durchflusszytometrie und Genexpression. Die absolute Intensität von GFP-positiven Zellen wurde als Proxy für SCX-Integrationen mittels Durchflusszytometrie verwendet. Die Vektortiter wurden durch Durchflusszytometrie für alle Zellen validiert, um die lentivirale MOI zu bestimmen. (A) Absolute Fluoreszenz pro Virustiter. (B) Transduktionseffizienz, bewertet als Prozentsatz der SCX-GFP+ -Zellen. Ein Dosis-Wirkungs-Effekt der lentiviralen Last auf die Transduktionseffizienz wurde beobachtet, wenn die Flussergebnisse als Prozentsatz der GFP+-Zellen dargestellt wurden. MOI, Multiplizität der Infektion, n = 3 unabhängige Transduktionen. Die Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Titer zu vergleichen; Daten sind Mittelwerte ± SD; *p < 0,05. (C) Die Durchflusszytometrie von iMSCSCX+ nach mehreren Durchgängen zeigt keine Veränderung des Niveaus der stabilen Transgenexpression und keine Veränderung des Anteils der transduzierten Zellen. Beachten Sie, dass iMSCs, die mit 100%igen Titern transduziert wurden, bei P3 aufhörten, sich zu teilen. (D) iMSCs, die mit dem SCX-GFP+ Lentivirus-Vektor (75%, MOI = 2,9 e5 TU/ml) transduziert wurden und die Genexpression von SCX nach 4 Wochen regulärer Kultur ohne Sortierung bestimmten. Die SCX-Expression war in iMSCSCX+ signifikant hochreguliert und zeigte nach 4 Wochen eine stabile Überexpression von SCX. TU, Transduktionseinheiten; Daten sind Mittelwert ± SD, **p > 0,01. Wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung von Papalamprou A. et al.14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: iMSCSCX+ wird in einen 2D-Bioreaktor eingeschleust und zyklisch gestreckt. (A) Schematische Darstellung des 2D-Bioreaktors. Wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung von Papalamprou A. et al.12. (B) Die Zellen werden zunächst in flexible Silikonplatten gesät und bei 37 °C inkubiert, um eine Anheftung vor dem zyklischen Strecken im 2D-Bioreaktor zu ermöglichen. (C) iMSCSCX+ wurden in einem 2D-Bioreaktor bis zu 7 Tage lang gestreckt. Für die statische Kontrolle wurden die Zellen in identischen Platten plattiert, jedoch ohne Dehnung. (C1) Die statische Kontrollplatte zeigt nach 7 Tagen eine stochastische Anordnung der Zellen. (C2) Die gestreckte Platte nach 7 Tagen zeigt relativ mehr Zellorganisation. (D) Drei Beispiele dafür, was nicht beachtet werden sollte. Wenn die Aussaatdichte der Zellen zu hoch ist oder die Zellen zu viele Tage lang gestreckt wurden, beginnen sich die Zellen abzulösen. (D1) Die Zellen sind nur leicht überwuchert. Gelbe Pfeile zeigen den Beginn einer vorzeitigen Zellkontraktion an. (D2) Mäßiger Überwuchs. Die Zellen beginnen, sich von der Platte zu lösen. (D3) Starke Überwucherung. Die Zellen wachsen nicht mehr in Monolayern, sondern haben 3D-Strukturen gebildet. Schwarze Maßstabsbalken = 400 μm. Weiße Maßstabsbalken = 1000 μm. (E) Nach 7 Tagen Dehnung (oder in Kultur für die statische Platte) wurden die Zellen mit Phalloidin für Aktinfilamente (rot) fixiert und mit DAPI für Zellkerne (blau) gegengefärbt. Weiße Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Stimulation der tenogenen Markergenexpression durch Scx-Überexpression und uniaxiale Dehnung in einem 2D-Bioreaktor. (A) iMSCSCX+ wurden in einem 2D-Bioreaktor für 7 Tage gestreckt. Für die statische Kontrolle wurden die Zellen in identischen Platten plattiert, jedoch ohne Dehnung. Genexpressionsanalysen zeigen, dass iMSCSCX+ mechanoresponsive ist. ND = keine Erkennung. Die Einweg-ANOVA wurde verwendet, um die Genexpression zu jedem Zeitpunkt mit der zu vergleichen. d0. N = 8/Gruppe. (B) Kollagenablagerung nach 7-tägiger Dehnung im 2D-Bioreaktor. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 8/Gruppe; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung von Papalamprou A. et al.12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Protokoll werden iTenozyten durch drei Hauptschritte erzeugt: (1) Induktion von iPS-Zellen zu iMSCs, (2) Überexpression von SCX unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und (3) Reifung von Zellen durch uniaxiale 2D-Spannung.
Das vorgestellte Protokoll zur Differenzierung von iPS-Zellen in iMSCs wurde bereits von unserer Gruppe2 beschrieben. Seit dieser Veröffentlichung wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, darunter ein etabliertes Protokoll für die Verwendung von iMSCs in klinischen Studien 21,22,23 sowie kommerziell erhältliche Differenzierungskits. Eine Überprüfung des Trilineage-Potenzials von iMSCs wurde ebenfalls bereits untersucht2. Obwohl sich die Methoden unterscheiden, betonen alle Protokolle die Notwendigkeit einer Expansion der iMSCs nach der Differenzierung für mehrere Passagen, um eine stabile Expression der MSC-Oberflächenmarker zu gewährleisten. In diesem Stadium führt die Verwendung eines Split-Verhältnisses von 1:3 bei ca. 70 % Konfluenz innerhalb von 4-6 Tagen nach dem Durchgang zu einer relativ konfluenten Platte.
Bei der Auswahl des optimalen Titers für die Transduktion ist es entscheidend, ein Gleichgewicht zwischen Zelllebensfähigkeit und Effizienz zu finden. Während die iMSCs, die mit dem 100%-Titer transduziert wurden, den höchsten Gehalt an SCX-GFP-positiven Zellen aufweisen können, ist es erwähnenswert, dass diese Zellen drei Passagen nach der Transduktion aufhörten, sich zu teilen (Abbildung 3C), was möglicherweise auf eine DNA-induzierte Toxizität zurückzuführen ist. Daher ist es ratsam, einen Titer von weniger als 100% zu verwenden. Vor dem Aussaat der Silikonplatten wird empfohlen, den SCX-GFP-Gehalt mittels Durchflusszytometrie neu zu bewerten. Wenn die Daten darauf hindeuten, dass der Wirkungsgrad unter dem gewünschten Schwellenwert liegt, ist eine Sortierung der iMSCSCX+ -Zellen vor der Aussaat ratsam, insbesondere bei In-vivo-Anwendungen .
Sobald die iMSCSCX+-Zellen in die Silikonplatten eingesät wurden, müssen sie über Nacht bei 37 °C inkubiert werden, um die Zellanhaftung vor dem Dehnen zu ermöglichen. Die beschriebene Zelldichte von 1,25 x 104 Zellen/cm2 in den Silikonplatten wurde optimiert, um ein Überwachsen der Monoschicht zu verhindern, das zu statischer Spannungbeitragen kann 24. Darüber hinaus deuten Studien darauf hin, dass der direkte Zell-zu-Zell-Kontakt in konfluenten Kulturen in Substraten unterschiedlicher Steifigkeit das Zellverhalten verändern kann 24,25,26. Während der Pilotexperimente wurde eine sichtbare Zellablösung von den Silikonplatten beobachtet, insbesondere zu späteren Zeitpunkten (Abbildung 4D). Dies könnte auf die Bildung von EZM-Zellblättern aufgrund von Überkonfluenzzurückgeführt werden 24. Zu den kritischen Parametern gehören daher die Zelldichte und die Anzahl der Dehnungsschübe. Bei den aktuellen Methoden wurden an den Tagen 3 und 7 Zellen zur Bestimmung des tenogenen Potenzials mittels Genexpressionsanalyse gesammelt. Es wird jedoch empfohlen, die Zellen mindestens drei Tage lang im 2D-Bioreaktor zu dehnen, wobei die gestreckten und statischen Platten anschließend überwacht werden, um ein übermäßiges Wachstum und eine Zellablösung zu verhindern.
Nach mehreren Dehnungsphasen kann ein gewisses Maß an Zellausrichtung und -organisation beobachtet werden (Abbildung 4C1,E). Dies deckt sich mit vielen Studien, in denen eine Zellausrichtung senkrecht zur Dehnungsachse als Reaktion auf eine einachsige Dehnung in vitro beobachtet wurde 24,27. Im Vergleich dazu zeigt die statische Platte eine stochastische Zellorganisation (Abbildung 4C2,E).
Unseres Wissens nach haben nur wenige Studien die synergistischen Effekte von SCX-Überexpression und mechanischer Stimulation für die Differenzierung von MSCs in Tenozyten oder Ligamentozyten untersucht 24,28,29. Gaspar et al. verwendeten ein ähnliches 2D-Bioreaktorsystem wie das hier beschriebene, wendeten jedoch höhere Gesamtbelastungen an (10 % bei 1 Hz für 12 h/Tag). Interessanterweise konnten sie keine Veränderungen in der Expression von SCX, TNMD und COL1a1 in BM-MSCs und humanen Tenozyten nachweisen. Dies kann jedoch auf die höher verwendeten Stämme zurückgeführt werden, die in ihrer Studie verwendet wurden24. Chen et al. verwendeten einen lentiviralen Vektor zur Überexpression von SCX in hESC-MSCs, die in mehrschichtigen Schichten zusammengesetzt waren. Sie übten eine einachsige zyklische Belastung aus (10 % Dehnung bei 1 Hz für 2 h/Tag für bis zu 21 Tage) und beobachteten eine Hochregulierung von COL1a1, COL1a2, COL14 und TNMD sowie eine erhöhte ECM-Abscheidung29. Nichols et al. transienten C3H10T1/2 Zellen mit muriner Scx-cDNA in voller Länge und kultivierten die Zellen in 3D-Kollagenhydrogelen unter uniaxialer zyklischer Belastung (1 %, 1 Hz, 30 min/Tag für bis zu 14 Tage). Ähnlich wie bei unseren Ergebnissen beobachtete ihre Gruppe eine erhöhte Expression von SCX und COL1A1 in den belasteten und überexprimierten Konstrukten, fand aber keine Veränderung der TNMD-Expression als Reaktion auf zyklisches Dehnen28.
Darüber hinaus könnte es interessant sein, die Überexpression anderer sehnenbezogener Marker wie MKX in Betracht zu ziehen. Tsutsumi et al. untersuchten den kombinierten Effekt der Überexpression von MKX in C3H10T1/2-Zellen und deren zyklischer mechanischer Dehnung in einem 3D-System. Sie zeigten eine signifikante Hochregulierung von SCX, COL1a1, DCN und COL3a1 sowie die Ausrichtung von Kollagenfibrillenbündeln und Aktinfilamenten30.
Es ist wichtig anzuerkennen, dass diese Methode zur Generierung von iTenozyten ihre Grenzen hat. Während der kommerziell erhältliche 2D-Bioreaktor für Proof-of-Concept-Arbeiten von Vorteil ist, schränkt seine Größe die Ausbeute ein. Wenn diese Zellen für Hochdurchsatz-Assays oder als potenzielle Standard-Zellquelle für Sehnenreparaturtherapien benötigt werden, sollten Systeme in Betracht gezogen werden, die in der Lage sind, uniaxiales Dehnen in größerem Maßstab zu implementieren. Darüber hinaus sollten weitere Untersuchungen die Expansion von iTenozyten umfassen, um eine stabile tenogene Expression zu bestätigen, und die Bewertung ihres Beitrags zur In-vivo-Regeneration ist entscheidend für die Bewertung ihres tenogenen Potenzials.
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Disclosures
Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise vom NIH/NIAMS-K01AR071512 und CIRM DISC0-14350 an Dmitriy Sheyn unterstützt. Die beiden Lentivirus-Verpackungsplasmide waren ein Geschenk des Simon-Knott-Labors (Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
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