Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, с помощью комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.

Abstract

Сегодняшние проблемы в восстановлении сухожилий и связок требуют определения подходящего и эффективного кандидата для клеточной терапии для стимуляции регенерации сухожилий. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были изучены как потенциальная стратегия тканевой инженерии для восстановления сухожилий. Несмотря на то, что они мультипотентны и обладают регенеративным потенциалом in vivo, они ограничены в своей способности к самообновлению и демонстрируют фенотипическую гетерогенность. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обойти эти ограничения благодаря своей высокой способности к самообновлению и беспрецедентной пластичности развития. В развитии теноцитов склераксис (Scx) является важнейшим прямым молекулярным регулятором дифференцировки сухожилий. Кроме того, было показано, что механорегуляция является центральным элементом, управляющим развитием и заживлением эмбриональных сухожилий. Таким образом, мы разработали протокол для инкапсуляции синергетического эффекта биологической и механической стимуляции, который может быть важен для генерации теноцитов. ИПСК индуцировали превращение в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и характеризовали классическими мезенхимальными стромальными клеточными маркерами с помощью проточной цитометрии. Затем с помощью лентивирусного вектора iMSK трансдуцировали для стабильной сверхэкспрессии SCX (iMSCSCX+). Эти клеткиiMSC SCX+ могут быть дополнительно преобразованы в iTenoциты путем одноосного растягивающего нагружения с помощью 2D-биореактора. Полученные клетки характеризовались наблюдением за повышением регуляции ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена. Этот метод генерации iTenoцитов может быть использован для помощи исследователям в разработке потенциально неограниченного готового аллогенного источника клеток для применения в терапии сухожильными клетками.

Introduction

Чтобы решить современные проблемы восстановления сухожилий и связок, существует потребность в соответствующем клеточном кандидате, подходящем для клеточной терапии. Одним из направлений исследований в тканевой инженерии для восстановления сухожилий является изучение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BM-MSCs) и стромальных клеток жировой ткани (ASC) в качестве потенциальных стратегий. Эти клетки обладают мультипотентной способностью, большой численностью и регенеративным потенциалом in vivo. Кроме того, они показали повышенную способность к заживлению и улучшенные функциональные результаты на животных моделях1. Тем не менее, эти клетки демонстрируют ограниченные возможности самообновления, фенотипическое разнообразие и, что примечательно, ограниченную способность к образованию сухожилий. Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предлагает решение этих ограничений благодаря своей замечательной способности к самообновлению и непревзойденной адаптивности к развитию. Наша исследовательская группа и другие исследователи добились успешной дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальноклеточные образования (МСК)2,3. Таким образом, МСК могут стать аллогенным источником для клеточной терапии сухожилий.

Склераксис (SCX) является транскрипционным фактором, необходимым для развития сухожилий, и считается самым ранним обнаруживаемым маркером дифференцированных теноцитов. Кроме того, SCX активирует маркеры дифференцировки сухожилий, в том числе коллаген 1-го типа (COL1a1), ирокез (MKX) и теномулина (TNMD), среди прочих 4,5,6. Другие гены, экспрессируемые во время созревания сухожилий, включают белка, способствующего полимеризации тубулина, члена семейства 3 (TPPP3) и рецептор тромбоцитарного фактора роста альфа (PDGFRa)7. Хотя эти гены необходимы для развития и созревания сухожилий, они, к сожалению, не уникальны для сухожильной ткани и экспрессируются в других костно-мышечных тканях, таких как кости или хрящи 5,7.

В дополнение к экспрессии маркеров во время развития сухожилий, механостимуляция является важным элементом для эмбрионального развития и заживления сухожилий 4,5,6. Сухожилия механочувствительны, и их модели роста изменяются в ответ на окружающую среду. На молекулярном уровне биомеханические сигналы влияют на развитие, созревание, поддержание и реакции заживления теноцитов8. Для моделирования физиологических нагрузок и биомеханических сигналов используются различные системы биореакторов. Некоторые из этих модельных систем включают в себя нагрузку тканей ex vivo, 2D-системы загрузки клеток, использующие двухосное или одноосное растяжение, и 3D-системы, использующие скаффолды и гидрогели 9,10. 2D-системы полезны при изучении влияния механической стимуляции либо на сухожильные специфические гены, либо на морфологию клеток в контексте клеточной судьбы, в то время как 3D-системы могут более точно воспроизводить взаимодействия между клеткой и ECM 9,10.

В системах 2D-загрузки деформация между клетками и культуральным субстратом однородна, что означает, что приложенная нагрузка на цитоскелет клеток может быть полностью контролируемой. По сравнению с двухосной нагрузкой, одноосная нагрузка более физиологически значима, так как теноциты преимущественно подвергаются одноосной нагрузке из коллагеновых пучков in vivo9. Установлено, что при повседневной деятельности сухожилия подвергаются одноосной растягивающей нагрузке до 6% деформации11. В частности, предыдущие исследования показали, что нагрузка в физиологических пределах 4%-5% способствует дифференцировке теногенов, сохраняя экспрессию маркеров, связанных с сухожилиями, таких как SCX и TNMD, а также увеличивает выработку коллагена 9,10. Штаммы более 10% могут быть травматичными, но не физиологически значимыми12,13.

Здесь представлен протокол, учитывающий синергетический эффект механической и биологической стимуляции, который может иметь существенное значение для генерации теноцитов. Впервые описан воспроизводимый метод индуцирования ИПСК в МСК путем кратковременного воздействия факторов роста на эмбриоидные тельца, подтвержденный поверхностными маркерами МСК с помощью проточной цитометрии. Затем мы подробно описали метод лентивирусной трансдукции, позволяющий сконструировать iMSC со стабильной гиперэкспрессией SCX (iMSCSCX+). Для дальнейшего созревания клеток iMSCSCX+ помещаются в силиконовые пластины с фибронектиновым покрытием и проходят оптимизированный протокол одноосного натяжения с использованием биореактора CellScale MCFX. Теногенный потенциал был подтвержден наблюдением за апрегуляцией ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена14. Этот метод генерации iTenoцитs является доказательством концепции, которая может предложить неограниченный готовый аллогенный источник для применения в терапии сухожильными клетками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол производства iTenoцитов может быть выполнен в три основных этапа: от ИПСК до iМСК (10 дней), от iMSC до iMSCSCX+ (2 недели), от iMSCSCX+ до iTenocytes (минимум 4 дня). Каждый важный шаг в протоколе может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Для методов, связанных с культивированием клеток, следует использовать стерильные методы. Все клетки в этом протоколе должны выращиваться при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.

1. Индукция ИПСК человека в индуцированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

  1. Подготовка к эксперименту
    1. Подготовьте среду Iscove Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB).
      1. Добавьте 50 мл базальной среды IMDM с 8,5 мл нокаут-заменителя сыворотки, 500 мкл заменимых аминокислот с минимальной незаменимой средой (МЭМ), 0,385 мкл (110 мМ стока) бета-меркаптоэтанола и 500 мкл антибиотико-антимикотического раствора (ААС) (конечные концентрации: 17%, 1%, 110 мкМ, 1% соответственно) (см. таблицу материалов).
    2. Подготовьте среду для мезенхимальных стромальных клеток (МСК).
      1. Добавьте 440 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) с низким содержанием глюкозы Dulbecco с 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл раствора антибиотика-антимикотика (AAS) и 5 мл L-глютамина (конечные концентрации: 10%, 1%, 2 мМ соответственно).
    3. Подготовьте пластины с поли(2-гидроксиэтилметакрилатом) (поли-ГЕМА) покрытием.
      1. Добавьте 10 г poly-HEMA (см. Таблицу материалов) в стерильный флакон.
      2. Добавьте в бутылку магнитную мешалку и, помешивая, медленно добавьте 500 мл 95% EtOH.
      3. После того, как все EtOH будет добавлено, включите режим перемешивания при 1200 об/мин при дополнительном слабом огне не менее 6 часов. Раствор poly-HEMA можно хранить при комнатной температуре до года.
      4. В стерильных условиях добавить 2,5 мкг/см2 в 9 мл в колбу Т75. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования.
      5. Сохраняя стерильность, дайте сосудам высохнуть на воздухе, чтобы EtOH полностью испарился перед использованием. Обычно это занимает 24-72 часа.
    4. Подготовьте покрытые желатином колбы.
      1. Вымойте стеклянную бутылку с NaOH и посвятите ее приготовлению желатина. Не используйте моющее средство.
      2. Приготовьте 1% раствор желатина (5 г желатина и 500 мл воды, не содержащей эндотоксинов). Автоклавируйте стеклянную бутылку с раствором желатина в течение 30 минут.
      3. Дайте желатиновому раствору остыть, и его можно хранить при комнатной температуре.
      4. Покройте одну колбу T75 5 мл раствора желатина на колбу и инкубируйте не менее 1 ч перед посевом клеток. Колбы с желатиновой глазурью можно приготовить за 1 день.
    5. Подготовьте буфер для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).
      1. Смешайте PBS с 2% бычьим сывороточным альбумином и 0,1% азидом натрия. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Генерация эмбриоидных телец (БЭ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК следует культивировать в 6-луночном планшете и достигать 70%-80% слияния перед использованием.
    1. На 0-й день принесите ПЦР-планшет 384 с прозрачным дном в колпаке для культивирования тканей и ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут без крышки.
    2. Удалить питательную среду из ИПСК (см. Таблицу материалов) и промыть лунки ПБС.
    3. Добавьте в каждую лунку по 0,5 мл предварительно подогретого щадящего реагента для диссоциации клеток (см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Наблюдайте за клетками каждые 5 мин до тех пор, пока ИПСК не превратятся в единичные клетки или небольшие агрегаты, поднятые во взвешенном состоянии.
    4. Ресуспендированную клеточную суспензию с помощью пипетки объемом 1 мл для получения одноклеточной суспензии.
    5. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте в среде IMDM-EB (шаг 1.1.1) и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
    7. Рассчитайте соответствующий объем клеточной суспензии, необходимый для достижения 5 000-25 000 клеток на лунку 384-луночного планшета с 25 мкл клеточной суспензии на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 2-3 скважины с притоком (70%-80%) из 6-луночного планшета могут создавать ЭП в одной 384-луночной пластине. Размер ячеек на ЭБ будет определен опытным путем. Для всей 384-луночной планшета необходимо использовать 9,6 мл клеточной суспензии, 25 мкл на лунку.
    8. Снова центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    9. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме среды IMDM-EB и 10 мкМ дигидрохлорида Y-27632 (запас: 10 мМ, 1000x, см. таблицу материалов) в предварительно охлажденной конической пробирке объемом 15 мл.
    10. Добавьте к конусу холодную растворимую матрицу базальной мембраны (1 мг на 384-луночную пластину EBs) (см. таблицу материалов).
    11. Распределите по 25 мкл клеточной суспензии в каждую лунку. Накройте тарелку стерильной крышкой и вращайте при температуре 450 x g при 4 °C в течение 7 минут. Инкубируют при 37 °C в течение 48 ч.
    12. На 2-й день переложите клетки на 100-миллиметровую пластину с 3 мл предварительно нагретой среды IMDM-EB.
    13. Переложите ЭБ в специальные колбы T75 с полигема-покрытием с 10 мл ИМДМ-ЭБ. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования. Дайте ЭБ расти в течение 3 дней.
    14. На 5-й день переложите ЭП в подготовленные колбы Т75, покрытые желатином, с 10 мл среды ИМДМ-ЭБ. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования. Выращивайте ЭБ еще 3 дня во взвешенном состоянии.
    15. На 8-й день убедитесь, что наблюдаются два типа ЭБ: ЭБ, прикрепленные к колбе, и неприкрепленные ЭБ. Вымойте неприкрепленные ЭБ из колбы с помощью ПБС.
    16. К прилагаемым ЭБ добавляют среду IMDM-EB с добавлением TGFβ-1 (10 нг/мл) (см. таблицу материалов) и дают им расти в течение 2 дней.
    17. На 10-й день смените среду на среду МСК. Клетки следует подкармливать два раза в неделю. После слияния на 70% перейдите к «Стандартному протоколу лифтинговых ячеек» для замены пластин клеток. Переложите ячейки на пластины, покрытые желатином.
  3. Стандартный протокол подъемных ячеек
    1. После того, как адгезивные клетки достигнут 70% слияния, аспирируют питательную среду из планшетов и промывают PBS.
    2. Поднимите клетки, добавив 5 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина на каждую 150-миллиметровую пластину, и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C. Отрегулируйте объем трипсина в соответствии с размером сосуда для культивирования.
    3. Под микроскопом убедитесь, что большая часть клеток была извлечена из каждой пластины. Если ячейки все еще прикреплены, осторожно постучите по стенкам пластин, чтобы сместить ячейки.
    4. Соберите клетки в коническую трубку, добавив двойной объем предварительно подогретой питательной среды.
    5. Центрифугируют клетки при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость и приступайте к следующим действиям.
  4. Оценка экспрессии маркеров МСК методом проточной цитометрии
    ПРИМЕЧАНИЕ: МСК человека, как и МСК костного мозга, следует использовать в качестве положительного контроля.
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте надосадочную жидкость с помощью 3 мл буфера FACS и перенесите весь объем в пробирки FACS.
    3. Центрифуга при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 х г. Повторите этап промывки буфером FACS еще два раза.
    4. В окрашенные пробирки добавляют 2 мкл мышиного античеловеческого CD90-FITC, мышиного античеловеческого CD44-APC и античеловеческого CD105-PE (см. таблицу материалов) и инкубируют в течение 45 мин при 4 °C.
    5. К контрольным трубкам изотипа добавьте 20 мкл мышиного IgG2a-FITC, мышиного IgG1-PB и мышиного IgG1-PE (см. таблицу материалов).
    6. Инкубируют в темноте при 4 °С в течение 15 мин. Вымойте все пробирки, добавив 3 мл буфера FACS и центрифугируя в течение 5 минут при 300 x g (при комнатной температуре). Ресуспендируйте ячейки в 250 мкл буфера FACS для каждой пробирки.
    7. Проанализируйте экспрессию поверхностных маркеров МСК с помощью проточной цитометрии14. Длины волн возбуждения и излучения должны быть: CD90-FITC, пик возбуждения на длине волны 495 нм и пик излучения на длине волны 519 нм; CD44-APC, пик возбуждения при 640 нм и пик эмиссии при 660 нм; CD105-PE, пик возбуждения на длине волны 561 нм и пик излучения на длине волны 574 нм.

2. Передача и расширение iMSC

  1. Приготовление реагентов
    1. Подготовьте среду для замораживания МСК.
      1. Смешайте 30 мл ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мл ДМСО и 15 мл ФБС (конечные концентрации: 60%, 10%, 30% соответственно).
      2. Отфильтруйте раствор с помощью стерильного фильтра 0,45 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Пассаж
    ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции МСК необходимо выращивать на планшетах с желатиновым покрытием в течение дополнительных 2 проходов, прежде чем отучить от выращивания на пластиковых планшетах для культуры тканей. Кроме того, клетки должны пассировать с соотношением 1:3 при слиянии 70%.
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте ячейки в среде МСК и равномерно распределите ячейки по трем новым 150-миллиметровым пластинам из колб T175 по 20 мл среды на колбу. Верните ячейки при температуре 37 °C.
    3. Подкармливайте клетки два раза в неделю, заменяя питательную среду предварительно нагретой средой МСК.
  3. Замораживание
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек».
    2. Ресуспендируйте ячейки в 1 мл среды для замораживания МСК. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в криовиальную камеру и храните в морозильном контейнере в течение 24 ч при -80 °C, прежде чем перенести в жидкий азот для длительного хранения.
  4. Таяние
    1. Приготовьте 10 мл предварительно подогретой среды МСК в конической пробирке объемом 15 мл.
    2. Извлеките криовиал, опустите его в водяную баню с температурой 37 °C и взбалтывайте до тех пор, пока не останется ледяной шарик размером с горошину (примерно 1-2 минуты).
    3. В колпаке для клеточных культур медленно добавьте 1 мл предварительно нагретой среды в криовиальную камеру и пипетку вверх и вниз для перемешивания.
    4. Переложите клеточную суспензию из криовиальной камеры в подготовленную коническую пробирку объемом 15 мл с предварительно нагретой средой и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
    5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте свежей средой. Добавьте клеточную суспензию в планшет диаметром 150 мм общим объемом 20 мл. Отрегулируйте объем в соответствии с размером колбы для культуры.
    6. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к разделению.

3. Генная инженерия МСК для сверхэкспрессии SCX с использованием лентивирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола занимает две недели.

  1. Приготовление сред и реагентов
    1. Подготовьте HEK293T/17 клеточные среды.
      1. Добавьте 445 мл минимальной эссенциальной среды (EMEM) Eagle с 50 мл FBS и 5 мл AAS (конечные концентрации: 10%, 1% соответственно).
    2. Подготовьте лентиупаковочную среду MSC.
      1. Приготовьте термоинактивированную сыворотку, нагревая 50 мл FBS комнатной температуры на водяной бане 60 °C в течение 30 минут.
      2. Смешайте 445 мл DMEM с низким содержанием глюкозы с инактивированным при нагревании FBS и 5 мл L-глютамина (конечные концентрации: 10%, 2 мМ соответственно).
    3. Приготовьте трансфекционный комплекс.
      1. Позволяют компонентам трансфекционного комплекса (см. Таблицу материалов) оттаять на льду: упаковка плазмид VSV-G и Delta, плазмиды SCX и BioT15,16.
      2. Плавно вихряйте и раскручивайте плазмиды. Измерьте концентрацию ДНК.
      3. Исходя из концентраций ДНК и количества колб, предназначенных для трансфекции, рассчитайте объем каждого необходимого компонента: для одной колбы Т75 трансфекционный комплекс будет состоять из 750 мкл безсывороточной среды (например, безсывороточного DMEM или PBS), 7,5 мкг плазмиды SCX, 0,75 мкг плазмиды VSV-G, 6,75 мкг дельта-плазмиды и 22,5 мкл BioT. Учитывайте дополнительно ошибку пипетирования.
      4. Перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз. Коротко отжмите в центрифуге. Выдержать при комнатной температуре 15 мин и сразу использовать.
  2. Трансфекция и лентивирусная продукция
    ВНИМАНИЕ: Начиная с 3-го дня, протокол предполагает работу с лентивирусом, и, таким образом, работа должна проводиться с использованием операционных процедур уровня сдерживания 2+. Работники должны носить средства индивидуальной защиты, в том числе два слоя перчаток, накладки на запястья, защитные очки, маску, длинные штаны и закрытую обувь. Все отходы и материалы, включая наконечники пипеток, колбы и жидкую среду, должны быть обеззаражены отбеливателем (окончательный 1% гипохлорит натрия) в течение не менее 20 минут. Не используйте пылесос.
    1. Посев HEK293T/17 клеток.
      1. Примерно за 18-24 ч до трансфекции (день 0) поднимите и поместите клетки 293Т в колбы Т75. В следующих томах предполагается, что Т75 является культуральным сосудом. Отрегулируйте объем в соответствии с используемым сосудом для клеточной культуры.
      2. Выньте питательную среду из колб и промойте 5 мл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки очень легко отрываются от поверхности колбы. Добавьте PBS на стенку колбы и избегайте прямого добавления раствора в ячейки.
      3. Добавьте в каждую колбу 3 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. Соберите клетки в коническую пробирку и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g.
      4. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте в среде 293T и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
      5. Поместите ячейки на пластины при соотношении 5,3 x 104 клетки/см2 и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
      6. На следующий день (1 день) приготовьте трансфекционный комплекс. Замените питательную среду из клеток 5 мл предварительно подогретой лентиупаковочной среды МСК (шаг 3.1.2).
      7. Добавьте трансфекционный комплекс по каплям к клеткам. Аккуратно наклоните чашку, чтобы обеспечить равномерное воздействие трансфекционного комплекса на клетки. Верните клетки в инкубатор на 48 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Токсичность должна наблюдаться через 24 ч (2-й день).
      8. Через 48 ч (3-й день) осторожно соберите вируссодержащую среду в отдельную коническую пробирку с помощью пипетки и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
      9. Добавьте 5 мл предварительно подогретой лентиупаковочной среды МСК в колбу Т75 с клетками 293Т и верните в инкубатор на ночь.
      10. После центрифугирования отфильтруйте надосадочную жидкость стерильным фильтром 0,45 мкм, напрямую пипетируя надосадочную жидкость через фильтр. Хранить вируссодержащую среду при температуре 4 °C в течение ночи.
      11. Еще через 24 ч (4-й день) еще раз осторожно собирают вируссодержащую среду в отдельную коническую пробирку с помощью пипетки и центрифугируют в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
      12. Соедините вирус с вирусом предыдущего дня сбора и перемешайте, чтобы получить однородный раствор. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Лентивирус можно аликвотировать и замораживать при -80 °C, или лентивирус можно хранить на льду во время «Трансдукции МСК с помощью SCX» (шаг 3.3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания и размораживания аликвот лентивируса не замораживайте повторно.
  3. Трансдукция iMSC с помощью SCX
    1. Выполните трансдукцию титровой пластины.
      1. На 0-й день выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
      3. В 6-луночную тарелку добавьте 4 x 103 ячейки/см2. Переложите оставшуюся часть в дополнительную 150-миллиметровую пластину с 20 мл среды MSC (это будет контрольная пластина). Инкубируют клетки в течение 24 ч при температуре 37 °C.
      4. На следующий день (день 1) ячейки должны сливаться на ~40%. Разогрейте питательную среду в ленти-упаковке и разморозьте полибрен и примерно 3 мл лентивируса на льду (или, если это делается в тот же день, что и сбор вируса, храните на льду до использования).
      5. Добавляют ленти-упаковывающую питательную среду и лентивирус в лунки в зависимости от желаемых титров (т.е. 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Добавьте 0,5 мкл полибрена для достижения конечной концентрации 5 мкг/мл (концентрация сырья: 10 мг/мл, см. таблицу материалов).
      6. Вращайте пластину, чтобы обеспечить равномерное воздействие на все клетки. Верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 48 ч.
    2. Эффективность титра лентивируса SCX оценивают с помощью проточной цитометрии.
      1. Через 48 ч выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в PBS и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток. Центрифугируют клетки при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g.
      3. Удалите надосадочную жидкость и повторно поместите ее в 3 мл буфера FACS для промывки. Переложите клеточную суспензию в проточные цитометрические пробирки и центрифугу на 5 мин при 300 х г.
      4. Повторите промывку буфером FACS еще два раза и повторно суспендируйте конечные гранулы клеток в 300 мкл буфера FACS. Оценивают экспрессию GFP для каждого титра с помощью аппарата для проточной цитометрии.
      5. Основываясь на титрах и количестве жизнеспособности клеток, определите подходящий титр лентивируса для продолжения трансдукции. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента.
    3. Выполнение крупномасштабной трансдукции SCX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы указаны для 1x 150 мм пластины или 1x колбы T175. Это может быть скорректировано соответствующим образом в зависимости от желаемого размера сосуда и масштаба трансдукции.
      1. На 0-й день выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток. Высевают клетки из расчета 4 x 103 клетки/см2. Инкубируют клетки в течение 24 ч при температуре 37 °C.
      3. На следующий день (день 1) ячейки должны сливаться на ~40%. Предварительно разогрейте ленти-упаковочную питательную среду и разморозьте полибрен и заранее рассчитанное количество лентивируса на льду.
      4. Исходя из выбранного титра, добавляют в лунки нужное количество лентиупаковочной питательной среды и лентивируса. Добавьте 5 мкг/мл полибрена (концентрация запаса: 10 мг/мл).
      5. На 3-й день наблюдают за клетками под флуоресцентным микроскопом. Недавно произведенный iMSCSCX+ должен флуоресцировать GFP. Замените вируссодержащую среду предварительно нагретой средой для МСК. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента.

4. Передача и расширение iMSCSCX+

  1. Выполняйте передачу, расширение, замораживание и размораживание iMSCSCX+ так же, как и для iMSC, как описано в шаге 2 протокола.

5. Механическое нагружение

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап занимает минимум 4 дня, но может быть дольше в зависимости от того, наблюдается ли сокращение клеток.

  1. Подготовка к эксперименту
    1. Подготовьте силиконовые пластины.
      1. Автоклав 2 силиконовые пластины (см. Таблицу материалов). После, в стерильных условиях, извлеките силиконовые пластины из автоклавного пакета и поместите их в пластины диаметром 150 мм.
      2. Смешайте 130 мкл фибронектина (100x, см. таблицу материалов) с 13 мл стерильного PBS в конической пробирке объемом 15 мл. Переверните пробирку несколько раз, чтобы перемешать.
      3. Добавьте 400 мкл раствора фибронектина в каждую лунку силиконовых пластин. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 2 часов или в течение ночи.
      4. Перед использованием аспирируйте раствор фибронектина и дайте планшетам высохнуть на воздухе в колпаке для клеточных культур в течение не менее 30 минут, чтобы раствор фибронектина полностью испарился.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фибронектина можно удалить из лунок заранее, и пластины с покрытием могут находиться при температуре 37 °C до нескольких недель до использования.
    2. Подготовьте стретч-носитель MSC.
      1. Приготовьте МСК для стретч-среды, добавив 140 мкл аскорбиновой кислоты (запас: 100x, конечная концентрация: 50 мкг/мл) к 14 мл предварительно нагретой среды MSC в конической пробирке объемом 15 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбиновую кислоту необходимо добавлять свежей в среду MSC перед каждой сменой среды.
  2. Засеивание iMSCSCX+ в силиконовые пластины
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
    3. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения 1,25 х 104 клеток/см2.
    4. Извлеките этот объем эластичного материала MSC из конической пробирки объемом 15 мл. Добавьте целевые ячейки. Инвертируют в однородную новую клеточную суспензию.
    5. Добавьте 400 мкл новой клеточной суспензии в каждую лунку обеих силиконовых пластин.
    6. Накройте крышкой пластины диаметром 150 мм и верните их в инкубатор при температуре 37 °C на 24 часа.
  3. Одноосное растяжение
    1. На следующий день промойте растяжной аппарат (см. Таблицу материалов) ddH2O с последующим добавлением 70% этилового спирта. Протрите аппарат, поместите его в колпак для клеточных культур и ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут.
    2. Извлеките засеянные пластины и проверьте лунки на хорошее прикрепление клеток.
    3. Оставьте одну пластину в инкубаторе (статический контроль) и поместите вторую засеянную силиконовую пластину в растяжной аппарат, совместив винты с отверстиями в силиконовой пластине. Закройте крышку на аппарате, чтобы обеспечить стерильность.
    4. Прикрепите аппарат с засеянной силиконовой пластиной к электронному источнику (см. Таблицу материалов) и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C.
    5. В программе установите протокол циклического растяжения на 4% синусоидальную нагрузку, 0,5 Гц, 2 ч в сутки. Начните растяжку, нажав кнопку запуска один раз. Растяжка должна начинаться незамедлительно.
    6. Растягивают клетки минимум на 3 дня. Ежедневно наблюдайте за клетками и прекращайте протокол растяжения, если наблюдается сокращение клеток. Меняйте носитель на новый стретч-носитель MSC через день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дифференциация ИПСК человека в ИМСК
Как было описано ранее, современный протокол дифференцировки ИПСК в МСК предполагает формирование эмбриоидных тел2. Этот процесс занимает около десяти дней, чтобы индуцировать МСК из ИПСК (рис. 1А). Тем не менее, настоятельно рекомендуется сдавать вновь сгенерированные iMSC не менее двух раз. Это не только устраняет необходимость в пластинах с желатиновым покрытием, но и обеспечивает стабильную экспрессию МСК. Количественная оценка методом проточной цитометрии, проведенная после шести пассажей после дифференцировки, демонстрирует почти чистую клеточную популяцию с высокой экспрессией классических поверхностных маркеров МСК, включая CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) и CD105 (99,2%)17,18 (рис. 1B). С точки зрения морфологии, МСК должны быть очень похожи на МСК костного мозга, вытянутые и похожие на фибробласты (рис. 1C).

Генная инженерия iMSC для сверхэкспрессии SCX с использованием лентивирусной трансдукции
Лентивирусы получали путем трансфекции клеток HEK293T/17 вектором pLenti-C-mGFP, в который был вставлен SCXB для экспрессии SCX-GFP+ вместе с двумя упаковочными плазмидами. Трансфекцию проводили по методу BioT15,16 с соотношением BioT (мкл) к ДНК (мкг) 1,5:1.

HEK293T/17 клеток высевали с плотностью 5,3 х 104 клетки/см2 за 18-24 ч до трансфекции. Во время трансфекции клетки должны достигать 80%-95% слияния, чтобы избежать титров низкой эффективности (рис. 2B1, слева). В течение 24 ч после добавления плазмидного коктейля наблюдалась некоторая токсичность, которая достигла пика через 48 ч (рис. 2B2). Поскольку лентивирусный вектор SCX конъюгирован с GFP, экспрессия GFP должна наблюдаться через 48 ч (рис. 2B3). Наличие высокой токсичности в сочетании с экспрессией GFP является надежным показателем успешной трансфекции. Лентивирус собирали через 48 ч и 72 ч, эффективность трансдукции оценивали с помощью проточной цитометрии и анализа экспрессии генов. Абсолютная интенсивность GFP-положительных клеток использовалась в качестве прокси для интеграций SCX, и она была значительно выше в более высоких титрах (рис. 3A). Эффективность трансдукции, измеряемая в процентном соотношении клеток SCX-GFP+ , продемонстрировала эффект «доза-ответ» в зависимости от лентивирусной нагрузки (рис. 3B). Проточная цитометрия iMSCSCX+ в различных пассажах также показала высокую стабильность, без изменений в уровнях экспрессии трансгенов или доле трансдуцированных клеток (рис. 3C). Кроме того, после 4 недель регулярного культивирования без сортировки iMSCSCX+ поддерживал стабильную гиперэкспрессию SCX (рис. 3D). Широкомасштабная трансдукция проводилась на основе титра с использованием 75% лентивируса (рис. 2С).

Механическая нагрузка iMSCSCX+
ЯчейкиiMSC SCX+ были засеяны на деформируемые силиконовые пластины с плотностью клеток 1,25 x 104 клетки/см2 (рис. 4A, B), чтобы обеспечить прикрепление клеток перед запуском протокола растяжения. Окончательная плотность посева была оптимизирована для предотвращения разрастания однослойных слоев. Стоит отметить, что чрезмерно высокая плотность посева приводила к преждевременному сокращению клеток и ранней их гибели (рис. 4D). В статической контрольной группе клетки были помещены в идентичные пластины, но без какого-либо растяжения. КлеткиiMSC SCX+ подвергали растяжению в 2D-биореакторе в течение минимум трех дней, до семи дней, при одноосной деформации 4% и частоте 0,5 Гц в течение 2 ч в день. Этот режим растяжки согласуется с тем, что было описано как физиологически значимое9. После нескольких дней растяжения можно наблюдать некоторую степень организации клеток по сравнению со статической группой, которая демонстрировала случайную организацию клеток (рис. 4C). Фаллоидиновое окрашивание актиновых филаментов еще раз подчеркивает, что клетки, по-видимому, растут перпендикулярно направлению растяжения, в отличие от случайной организации клеток, наблюдаемой в статических пластинах (рис. 4E). Чтобы охарактеризовать вновь сгенерированные iTenoциты, клетки собирали через три и семь дней для анализа экспрессии генов,как сообщалось ранее. Анализ экспрессии генов показывает, что клеткиiMSC SCX+ механочувствительны, так как наблюдается значительная апрегуляция теногенных генов (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX и TPPP3)5,7,19,20 как через три, так и через семь дней, по сравнению только с iMSC на 0-й день (рис. 5A). Кроме того, отложение коллагена в среде после 7 дней растяжения было значительно выше в растянутой группе iMSCSCX+ по сравнению со всеми остальными группами (рис. 5B).

Figure 1
Рисунок 1: Схема дифференцировки iMSC и характеристика проточной цитометрии. (A) Общая схема генерации iTenocyte и график индукции iMSC. Воспроизведено с разрешения Papalamprou A. et al.14. (B) Количественная оценка методом проточной цитометрии показывает высокий процент клеток, экспрессирующих классические поверхностные маркеры МСК для МСК, полученных из ИПСК, после 6 пассажей после дифференцировки. Адаптировано с разрешения Sheyn D. et al.2. (C) Фазово-контрастные изображения клеток после дифференцировки демонстрируют фибробластоподобную морфологию. Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Производственная схема iMSCSCX+ . (A) Общая схема трансфекции с использованием лентивирусного вектора SCX2-го поколения и трансдукции iMSC. Воспроизведено с разрешения Papalamprou A. et al.14. (В1) HEK293T/17 клеток до добавления плазмидного коктейля. (В2) Клетки HEK293T/17 через 48 ч экспрессируют GFP и проявляют токсичность. (В3) Экспрессия GFP, которая может наблюдаться в клетках HEK293T/17, указывает на успешную трансфекцию. (C) Сгенерированныеклетки iMSC SCX+ (с титром 75%) экспрессируют SCX-GFP+ в ядрах. Масштабные линейки = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Определение эффективности трансдукции с помощью проточной цитометрии и экспрессии генов. Абсолютная интенсивность GFP-положительных клеток использовалась в качестве прокси для интеграций SCX с помощью проточной цитометрии. Титры векторов валидировали методом проточной цитометрии для всех клеток для оценки лентивирусных MOI. (А) Абсолютная флуоресценция на титр вируса. (B) Эффективность трансдукции, оцененная в процентном соотношении клеток SCX-GFP+ . Влияние лентивирусной нагрузки на эффективность трансдукции наблюдалось при представлении результатов потока в процентах от GFP+ клеток. MOI, множественность инфекции, n = 3 независимые трансдукции. Для сравнения титров использовали односторонний ANOVA; данные являются средними ± SD; *p < 0,05. (C) Проточная цитометрия iMSCSCX+ после нескольких циклов пассажа не указывает на изменение уровня экспрессии стабильного трансгена и на изменение доли трансдуцированных клеток. Обратите внимание, что iМСК, трансдуцированные со 100% титрами, перестали делиться на P3. (D) iMSK трансдуцировали лентивирусным вектором SCX-GFP+ (75%, MOI = 2,9 e5 TU/мл) и оценивали экспрессию генов SCX через 4 недели регулярного культивирования без сортировки. Экспрессия SCX была значительно повышена при iMSCSCX+ , демонстрируя стабильную гиперэкспрессию SCX через 4 недели. ТУ, трансдукционные установки; данные являются средними ± SD, **p > 0,01. Воспроизведено с разрешения Papalamprou A. et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: iMSCSCX+ помещается в 2D-биореактор и подвергается циклическому растяжению. (A) Схема 2D-биореактора. Воспроизведено с разрешения Papalamprou A. et al.12. (B) Клетки сначала помещаются в гибкие силиконовые пластины и инкубируются при температуре 37 °C, чтобы обеспечить возможность присоединения перед циклическим растяжением в 2D-биореакторе. (C) iMSCSCX+ растягивали в 2D-биореакторе до 7 дней. Для статического контроля клетки были покрыты идентичными пластинами, но без растяжения. (С1) Статическая контрольная пластина через 7 суток проявляет стохастическое расположение клеток. (С2) Растянутая пластина через 7 дней показывает относительно большую организацию клеток. (D) Три примера того, что не следует соблюдать. Когда плотность засева клеток слишком высока или клетки растягиваются в течение слишком много дней, клетки начинают отделяться. (Д1) Клетки лишь слегка зарастают. Желтые стрелки указывают на начало преждевременного сокращения клеток. (Д2) Умеренный уровень разрастания. Клетки начинают отделяться от пластины. (Д3) Выраженный уровень разрастания. Клетки больше не растут в монослое и образуют 3D-структуры. Черная шкала = 400 мкм. Белая шкала = 1000 мкм. (E) После 7 дней растяжения (или в культуре для статической пластины) клетки фиксировали фаллоидином для актиновых филаментов (красный) и окрашивали DAPI для ядер (синий). Шкала белого = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Стимуляция экспрессии гена теногенного маркера путем гиперэкспрессии Scx и одноосного растяжения в 2D-биореакторе. (A) iMSCSCX+ растягивали в 2D-биореакторе в течение 7 дней. Для статического контроля клетки были покрыты идентичными пластинами, но без растяжения. Анализ экспрессии генов показывает, что iMSCSCX+ является механочувствительным. ND = нет обнаружения. Односторонняя ANOVA использовалась для сравнения экспрессии генов в каждый момент времени с экспрессией генов. d0. N = 8/группа. (B) Осаждение коллагена после 7 дней растяжения в 2D-биореакторе. Данные являются средними ± SD; n = 8/группа; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Воспроизведено с разрешения Papalamprou A. et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе iTenoциты генерируются через три основных этапа: (1) индукция ИПСК в МСК, (2) гиперэкспрессия SCX с использованием лентивирусного вектора и (3) созревание клеток посредством 2D одноосного натяжения.

Представленный протокол дифференциации ИПСК в МСК был ранее описан нашей группой2. С момента публикации было разработано множество протоколов, в том числе установленный протокол использования МСК в клинических исследованиях 21,22,23, а также коммерчески доступные наборы для дифференциации. Ранее также был проведен обзор трилинейного потенциала иМСК2. Несмотря на различия в методологиях, все протоколы подчеркивают необходимость постдифференцировочного расширения МСК в течение нескольких пассажей, чтобы обеспечить стабильную экспрессию поверхностных маркеров МСК. На этом этапе использование коэффициента разделения 1:3 при слиянии примерно 70% приведет к относительно сливающейся пластине в течение 4-6 дней после пассажа.

При выборе оптимального титра для трансдукции крайне важно соблюдать баланс между жизнеспособностью и эффективностью клеток. В то время как iМСК, трансдуцированные со 100% титром, могут показывать самый высокий уровень SCX-GFP-положительных клеток, стоит отметить, что эти клетки перестали делиться три пассажа после трансдукции (рис. 3C), возможно, из-за ДНК-индуцированной токсичности. Поэтому желательно использовать титр менее 100%. Перед засеиванием силиконовых пластин рекомендуется повторно оценить уровни SCX-GFP с помощью проточной цитометрии. Если данные указывают на то, что эффективность ниже желаемого порога, рекомендуется провести сортировку клетокiMSC SCX+ перед посевом, особенно для применения in vivo .

После того, как клетки iMSCSCX+ были посеяны в силиконовые пластины, их необходимо инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы обеспечить прикрепление клеток перед растяжением. Описанная плотность клеток 1,25 x 104 кл/см2 в силиконовых пластинах была оптимизирована для предотвращения разрастания монослоя, который может способствовать статическому растяжению24. Кроме того, исследования показывают, что прямой контакт между клетками в конфлюидных культурах в субстратах различной жесткости может изменить поведение клеток 24,25,26. Во время пилотных экспериментов наблюдалось некоторое видимое отделение клеток от силиконовых пластин, особенно в более поздние моменты времени (рис. 4D). Это может быть связано с образованием клеточных листов ECM из-за чрезмерного слияния24. Поэтому к критическим параметрам относятся плотность клеток и количество приступов растяжения. В современных методах клетки собирали на 3-е и 7-е сутки для оценки теногенного потенциала с помощью анализа экспрессии генов. Тем не менее, рекомендуется растягивать клетки в 2D-биореакторе не менее трех дней с последующим мониторингом растянутых и статических пластин для предотвращения чрезмерного роста и отслоения клеток.

После нескольких приступов растяжения можно наблюдать определенную степень выравнивания и организации клеток (рис. 4C1, E). Это согласуется со многими исследованиями, в которых наблюдается выравнивание клеток перпендикулярно оси деформации в ответ на одноосную деформацию in vitro24,27. Для сравнения, статическая пластина демонстрирует стохастическую организацию ячеек (рис. 4C2, E).

Насколько нам известно, лишь в нескольких исследованиях изучались синергетические эффекты гиперэкспрессии SCX и механической стимуляции дифференцировки МСК в теноциты или лигаментоциты 24,28,29. Gaspar et al. использовали аналогичную систему 2D-биореактора, но применяли более высокие уровни общей деформации (10% при 1 Гц в течение 12 ч/день). Интересно, что они не смогли обнаружить изменения в экспрессии SCX, TNMD и COL1a1 в BM-MSC и теноцитах человека. Тем не менее, это может быть связано с более высокими применяемыми штаммами, использованными в их исследовании24. Chen et al. использовали лентивирусный вектор для сверхэкспрессии SCX в hESC-MSCs, собранных в многослойные листы. Они применяли одноосную циклическую нагрузку (10% деформация при 1 Гц в течение 2 ч/сут в течение 21 дня) и наблюдали повышение регуляции COL1a1, COL1a2, COL14 и TNMD, а также увеличение осаждения ECM29. Nichols et al. трансфицировали C3H10T1/2 клетки полноразмерной мышиной кДНК Scx и культивировали клетки в 3D-гидрогели коллагена при одноосной циклической деформации (1%, 1 Гц, 30 мин/день в течение 14 дней). Как и в случае с нашими результатами, их группа наблюдала повышенную экспрессию SCX и COL1A1 в напряженных и сверхэкспрессируемых конструкциях, но не обнаружила никаких изменений в экспрессии TNMD в ответ на циклическое растяжение28.

Кроме того, может быть интересно рассмотреть чрезмерную экспрессию других маркеров, связанных с сухожилиями, таких как MKX. Tsutsumi et al. исследовали комбинированный эффект чрезмерной экспрессии MKX в клетках C3H10T1/2 и воздействия на них циклического механического растяжения в 3D-системе. Они продемонстрировали значительное повышение регуляции SCX, COL1a1, DCN и COL3a1, а также выравнивание пучков коллагеновых фибрилл и актиновых филаментов30.

Важно понимать, что этот метод генерации iTenoцитов имеет свои ограничения. Несмотря на то, что коммерчески доступный 2D-биореактор выгоден для экспериментальных работ, его размер ограничивает выход. Если эти клетки необходимы для высокопроизводительных анализов или в качестве потенциального готового источника клеток для терапии восстановления сухожилий, следует рассмотреть возможность изучения систем, способных реализовать одноосное растяжение в более крупном масштабе. Кроме того, дальнейшие исследования должны охватывать экспансию итеноцитов для подтверждения стабильной теногенной экспрессии, а оценка их вклада в регенерацию in vivo имеет решающее значение для оценки их теногенного потенциала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У всех авторов нет конфликта интересов, подлежащего раскрытию.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано NIH/NIAMS K01AR071512 и CIRM DISC0-14350 Дмитрию Шейну. Две лентивирусные упаковочные плазмиды были подарком лаборатории Саймона Нотта (Департамент биомедицинских наук, Медицинский центр Седарс-Синай).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).

Tags

Биоинженерия выпуск 205
Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, <em>с помощью</em> комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter