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Bioengineering

強膜過剰発現と2D一軸張力 の組み合わせによる 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/65837
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

本稿では、レンチウイルスベクターを用いた強膜の過剰発現と2Dバイオリアクター による 一軸延伸を組み合わせたiPS細胞由来間葉系間質細胞を作製し、iTenocytesを作製する手順について述べる。

Abstract

腱と靭帯の修復における今日の課題は、腱の再生を促進するための細胞ベースの治療の適切で効果的な候補を特定する必要があります。間葉系間質細胞(MSC)は、腱修復のための潜在的な組織工学戦略として研究されています。それらは多能性であり、 in vivoで再生する可能性がありますが、自己複製能力には限界があり、表現型の不均一性を示します。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、その高い自己複製能力と比類のない発生可塑性により、これらの制限を回避することができます。テノサイトの発生において、強膜(Scx)は腱分化の重要な直接的な分子調節因子です。さらに、機械調節は、胚性腱の発達と治癒を導く中心的な要素であることが示されています。そのため、私たちは、テノサイトの生成に不可欠である可能性のある生物学的および機械的刺激の相乗効果をカプセル化するプロトコルを開発しました。iPS細胞は間葉系間質細胞(iMSC)となるように誘導され、フローサイトメトリーにより古典的な間葉系間質細胞マーカーで特徴付けられました。次に、レンチウイルスベクターを用いて、iMSCを形質導入し、安定的に過剰発現するSCX(iMSCSCX+) を発現させた。これらのiMSCSCX+ 細胞は、2Dバイオリアクターを用いた一軸引張荷重により、さらにiTenocytesに成熟させることができます。得られた細胞は、初期および後期の腱マーカーのアップレギュレーション、ならびにコラーゲン沈着を観察することによって特徴付けられました。iTenocytesを生成するこの方法は、腱細胞治療アプリケーション用の潜在的に無制限の既製の同種細胞源を開発する研究者を支援するために使用できます。

Introduction

腱と靭帯の修復における現代の問題に取り組むには、細胞ベースの治療に適した適切な細胞候補が必要です。腱修復のための組織工学における研究の1つの手段には、潜在的な戦略として、骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)および脂肪組織由来間質細胞(ASC)の探索が含まれます。これらの細胞は、多能性能力、豊富な量、およびin vivoでの再生能力を持っています。さらに、動物モデル1では、治癒能力の向上と機能的転帰の改善が示されています。それにもかかわらず、これらの細胞は、限られた自己複製能力、表現型の多様性、そして特に腱形成のための限られた能力を示します。人工多能性幹細胞(iPS細胞)技術は、その優れた自己複製能力と比類のない発生適応性により、これらの制約に対する解決策を提供します。私たちの研究チームなどは、iPS細胞を間葉系間質細胞様体(iMSC)に分化させることに成功しました2,3。そのため、iMSCは腱細胞治療用途の同種ソースとなる可能性を秘めています。

強膜(SCX)は、腱の発達に不可欠な転写因子であり、分化した腱細胞の最も早く検出可能なマーカーと考えられています。さらに、SCXは、1a1型鎖コラーゲン1(COL1a1)、モホーク(MKX)、テノモジュリン(TNMD)などの下流の腱分化マーカーを活性化します4,5,6。腱の成熟中に発現する他の遺伝子には、チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー3(TPPP3)および血小板由来成長因子受容体アルファ(PDGFRa)7が含まれます。これらの遺伝子は腱の発達と成熟に不可欠ですが、残念ながら腱組織に特有のものではなく、骨や軟骨などの他の筋骨格組織に発現しています5,7。

腱の発達中のマーカーの発現に加えて、機械刺激は胚の腱の発達と治癒に不可欠な要素です4,5,6。腱は機械応答性があり、環境に応じて成長パターンが変化します。分子レベルでは、生体力学的手がかりは、テノサイトの発達、成熟、維持、および治癒応答に影響を与えます8。さまざまなバイオリアクターシステムが、生理学的負荷と生体力学的手がかりをモデル化するために利用されています。これらのモデルシステムには、ex vivo組織ローディング、二軸または一軸張力を適用する2D細胞ローディングシステム、および足場およびハイドロゲルを使用する3Dシステムが含まれる9,10。2Dシステムは、腱特異的遺伝子または細胞運命の文脈における細胞の形態のいずれかに対する機械的刺激の影響を研究する場合に有利であり、3Dシステムは細胞とECMの相互作用をより正確に再現することができます9,10。

2Dローディングシステムでは、細胞と培養基質の間のひずみが均一であるため、細胞の細胞骨格に加えられる負荷を完全に制御できます。二軸負荷と比較して、テノサイトは主にin vivoでコラーゲン束からの一軸負荷を受けるため、一軸負荷はより生理学的に関連しています9。日常の活動中、腱は最大6%ひずみ11の一軸引張荷重を受けることがわかっています。具体的には、以前の研究では、4%〜5%の生理学的範囲内の負荷が、SCXやTNMDなどの腱関連マーカー発現を維持することにより、腱生成分化を促進し、コラーゲン産生を増加させることが示されていることがわかっています9,10。10%を超える菌株は、外傷的には関連している可能性がありますが、生理学的には関連していません12,13。

ここでは、テノサイトの生成に不可欠である可能性のある機械的および生物学的刺激の相乗効果を考慮に入れたプロトコルが提示されます。まず、フローサイトメトリーを用いたMSC表面マーカーによって確認された、胚様体を成長因子に短期間曝露 することにより 、iPS細胞をiMSCに誘導する再現性のある方法について説明します。次に、iMSCがSCXの安定した過剰発現(iMSCSCX+)を持つように設計するためのレンチウイルス形質導入法について詳しく説明します。細胞をさらに成熟させるために、iMSCSCX+ をフィブロネクチンでコーティングしたシリコーンプレートに播種し、CellScale MCFXバイオリアクターを使用して最適化された一軸張力プロトコルを受けます。腱形成能は、初期および後期の腱マーカーのアップレギュレーション、ならびにコラーゲン沈着を観察することによって確認された14。iTenocytesを生成するこの方法は、腱細胞治療アプリケーションのための無制限の既製の同種ソースを提供する可能性のある概念実証です。

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Protocol

iTenocytesを作製するこのプロトコルは、iPS細胞からiMSC(10日)、iMSCからiMSCSCX+ (2週間)、iMSCSCX+ からiTenocytes(最低4日)の3つの主要なステップで実施できます。プロトコルの各主要なステップは、実験のタイムラインに応じて、後で一時停止および再開できます。細胞の培養に関与する方法では、滅菌技術を採用する必要があります。このプロトコルのすべてのセルは37 °C、5% CO2および95%の湿気で育つべきです。

1. 人工間葉系間質細胞(iMSC)へのヒトiPS細胞の誘導

  1. 実験準備
    1. Iscove's Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies(IMDM-EB)培地を調製します。
      1. 50 mL の IMDM 基礎培地に 8.5 mL のノックアウト血清置換、500 μL の最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸、0.385 μL(110 mM ストック)のベータメルカプトエタノール、および500 μLの抗生物質抗真菌性溶液(AAS)(最終濃度:それぞれ17%、1%、110 μM、1%)を添加します( 材料表を参照)。
    2. 間葉系間質細胞(MSC)培地を調製します。
      1. 低グルコースダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)440 mLに、50 mLのウシ胎児血清(FBS)、5 mLの抗生物質抗真菌剤溶液(AAS)、および5 mLのL-グルタミン(最終濃度:それぞれ10%、1%、2 mM)を補給します。
    3. ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(ポリHEMA)コーティングプレートを準備します。
      1. 10 gのポリHEMA( 材料表を参照)を滅菌ボトルに加えます。
      2. マグネチックスターラーをボトルに加え、攪拌しながら、500 mLの95%EtOHをゆっくりと加えます。
      3. すべてのEtOHを添加したら、1200rpmで攪拌モードをオンにし、さらに6時間以上弱火で加熱します。poly-HEMA溶液は、室温で最長1年間保存できます。
      4. 無菌条件下で、2.5 μg/cm2 in 9 mL を T75 フラスコに加えます。培養容器の大きさに合わせて容量を調整してください。
      5. 無菌性を維持し、使用前に容器を風乾させてEtOHを完全に蒸発させます。これには通常24〜72時間かかります。
    4. ゼラチンでコーティングされたフラスコを準備します。
      1. ガラス瓶をNaOHで洗浄し、ゼラチン製剤専用にします。洗剤は使用しないでください。
      2. 1%ゼラチン溶液(ゼラチン5gとエンドトキシンフリー水500mL)を調製します。ガラス瓶をゼラチン溶液で30分間オートクレーブします。
      3. ゼラチン溶液を冷まし、室温で保存できます。
      4. 1つのT75フラスコに1つのフラスコに5 mLのゼラチン溶液をコーティングし、細胞を播種する前に少なくとも1時間インキュベートします。ゼラチンコーティングされたフラスコは、1日前に準備できます。
    5. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファーを調製します。
      1. PBSを2%ウシ血清アルブミンおよび0.1%アジ化ナトリウムと混合します。4°Cで保存してください。
  2. 胚様体(EB)の生成
    注:iPS細胞は6ウェルプレートで培養し、使用前に70%〜80%のコンフルエンスに達する必要があります。
    1. 0日目に、384透明底のPCRプレートを組織培養フードに入れ、蓋をせずに15分間UVします。
    2. iPS細胞から増殖培地を取り出し( 材料表を参照)、ウェルをPBSで洗浄します。
    3. 予め温めた穏やかな細胞解離試薬( 材料表を参照)0.5 mLを各ウェルに加え、37°Cで5分間インキュベートします。 iPS細胞が単細胞または懸濁液中に浮遊した小さな凝集体になるまで、5分ごとに細胞を観察します。
    4. 細胞懸濁液を1 mLピペットで再懸濁し、単一細胞懸濁液を確保しました。
    5. 細胞を室温で300 x g で5分間遠心分離します。
    6. 上清を除去し、IMDM-EB培地に再懸濁し(ステップ1.1.1)、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。
    7. 384ウェルプレートのウェルあたり5,000〜25,000細胞を達成するために必要な細胞懸濁液の適切な量を、ウェルあたり25 μLの細胞懸濁液で計算します。
      注:一般的に、6ウェルプレートの2〜3コンフルエント(70%〜80%)ウェルは、1つの384ウェルプレートでEBを作ることができます。EBあたりのセルのサイズは、経験的に決定されます。384ウェルプレート全体に対して、9.6 mLの細胞懸濁液(ウェルあたり25 μL)を使用する必要があります。
    8. 細胞を室温で5分間、300 x g で再び遠心分離します。
    9. 上清を除去し、細胞を適切な量のIMDM-EB培地および10 μMのY-27632二塩酸塩(ストック:10 mM、1000倍、 材料表を参照)に、事前に冷却した15 mLコニカルチューブに再懸濁します。
    10. 低温可溶化した基底膜マトリックス(EB 384 ウェルプレートあたり 1 mg)を円錐形に添加します( 材料表を参照)。
    11. 25 μLの細胞懸濁液を各ウェルに分配します。プレートに滅菌蓋を置き、450 x g 、4°C、7分間回転させます。37°Cで48時間インキュベートします。
    12. 2日目に、3 mLの予熱したIMDM-EB培地を含む100 mmプレートに細胞を移します。
    13. EBを10 mLのIMDM-EBが入った専用のポリHEMAコーティングT75フラスコに移します。培養容器の大きさに合わせて容量を調整してください。EB が 3 日間成長するのを待ちます。
    14. 5日目に、EBを10 mLのIMDM-EB培地とともに調製したゼラチンコーティングT75フラスコに移します。培養容器の大きさに合わせて容量を調整してください。懸濁液でさらに3日間EBを成長させます。
    15. 8日目に、フラスコに付着しているEBと付着していないEBの2種類のEBが観察されていることを確認します。付着していないEBをフラスコからPBSで洗い流します。
    16. 添付のEBに、TGFβ-1(10 ng/mL)を添加したIMDM-EB培地( 材料表参照)を添加し、2日間増殖させます。
    17. 10日目に、培地をMSC培地に変更します。細胞は週に2回給餌されるべきです。70%コンフルエントになったら、「標準リフティングセルプロトコル」に進み、細胞を再プレーティングします。ゼラチンでコーティングされたプレートに細胞を再プレーティングします。
  3. 標準リフティングセルプロトコル
    1. 接着細胞が70%コンフルエントに達したら、プレートから増殖培地を吸引し、PBSで洗浄します。
    2. 予熱した0.25%トリプシン5 mLを各150 mmプレートに添加して細胞を持ち上げ、37°Cで5分間インキュベートします。 培養容器のサイズに応じてトリプシンの量を調整してください。
    3. 顕微鏡で、ほとんどの細胞が各プレートから持ち上げられていることを確認します。まだ細胞が付着している場合は、プレートの側面を軽くたたいて細胞を取り除きます。
    4. あらかじめ温めた増殖培地の2倍の容量を加えて、細胞を円錐形のチューブに集めます。
    5. 細胞を室温で300 x gで5分間遠心分離します。上澄み液を取り除き、次の手順に進みます。
  4. MSCマーカー発現のフローサイトメトリー評価
    注:ヒトMSCは、骨髄MSCと同様に、ポジティブコントロールとして使用する必要があります。
    1. 「標準リフティングセルプロトコル」を実行します(ステップ1.3)。
    2. 上清を3 mLのFACS緩衝液で再懸濁し、全容量をFACSチューブに移します。
    3. 室温で300 x gで5分間遠心分離します。FACSバッファーで洗浄ステップをさらに2回繰り返します。
    4. 染色したチューブに、2 μLのマウス抗ヒトCD90-FITC、マウス抗ヒトCD44-APC、および抗ヒトCD105-PE( 材料表を参照)を加え、4°Cで45分間インキュベートします。
    5. アイソタイプコントロールチューブに、20 μLのマウスIgG2a-FITC、マウスIgG1-PB、およびマウスIgG1-PEを加えます( 材料表を参照)。
    6. 暗所で4°Cで15分間インキュベートします。3 mL の FACS バッファーを添加し、300 x g (室温) で 5 分間遠心分離して、すべてのチューブを洗浄します。各チューブについて、250 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁します。
    7. フローサイトメトリー14を用いてMSC表面マーカーの発現を解析します。励起波長と発光波長は、CD90-FITCで、励起ピークは495 nm、発光ピークは519 nmである必要があります。CD44-APC、励起ピークは640、発光ピークは660 nm。CD105-PE、励起ピークは561 nm、発光ピークは574 nm。

2. iMSC継代と伸長

  1. 試薬の調製
    1. MSC凍結培地を準備します。
      1. 30 mL の低グルコース DMEM、5 mL の DMSO、15 mL の FBS を混ぜ合わせます(最終濃度:それぞれ 60%、10%、30%)。
      2. 滅菌0.45μmフィルターを使用して溶液をろ過します。4°Cで保存してください。
  2. 継代
    注:誘導後、iMSCはゼラチンでコーティングされたプレート上でさらに2継代培養してから、プラスチック組織培養プレート上での増殖に引き離す必要があります。さらに、細胞は、70%コンフルエントの場合、1:3の分割比で継代する必要があります。
    1. 「標準リフティングセルプロトコル」を実行します(ステップ1.3)。
    2. 細胞をMSC培地に再懸濁し、フラスコあたり20 mLの培地を含むT175フラスコの150 mmプレート3枚に細胞を均等に分配します。細胞を37°Cに戻します。
    3. 週に2回、増殖培地を予熱したMSC培地と交換して、細胞に給餌します。
  3. 凍結
    1. 「標準リフティングセルプロトコル」を実行します。
    2. 細胞を1 mLのMSC凍結培地に再懸濁します。1 mLの細胞懸濁液をクライオバイアルに添加し、凍結容器に-80°Cで24時間保存した後、液体窒素に移して長期保存します。
  4. 解凍
    1. 予熱したMSC培地10 mLを15 mLのコニカルチューブに調製します。
    2. クライオバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスに浸し、エンドウ豆大の氷のボールが残るまで(約1〜2分)渦巻きさせます。
    3. 細胞培養フードで、予熱した培地1 mLをクライオバイアルにゆっくりと加え、ピペットで上下させて混合します。
    4. 細胞懸濁液をクライオバイアルから予熱した培地で調製した15 mLコニカルチューブに移し、300 x g (室温)で5分間遠心分離します。
    5. 上清を取り除き、新しい培地で再懸濁します。細胞懸濁液を総容量20 mLの150 mmプレートに加えます。培養フラスコのサイズに合わせて容量を調整してください。
    6. 細胞を37°Cでインキュベートし、分割する準備が整います。

3. レンチウイルス形質導入によるSCXの過剰発現に向けたiMSCの遺伝子改変

注: プロトコルのこのセクションは、完了するまでに 2 週間かかります。

  1. 培地および試薬の調製
    1. HEK293T/17細胞培地を準備します。
      1. 445 mL の Eagle Minimum Essential Medium(EMEM)に 50 mL の FBS と 5 mL の AAS を添加します(最終濃度:それぞれ 10%、1%)。
    2. MSCレンチ包装培地を準備します。
      1. 50 mLの室温FBSを60°Cのウォーターバスで30分間加熱して、熱不活化血清を調製します。
      2. 445 mL の低グルコース DMEM を熱不活化 FBS および 5 mL の L-グルタミンと組み合わせます(最終濃度:それぞれ 10%、2 mM)。
    3. トランスフェクション複合体を調製します。
      1. トランスフェクション複合体コンポーネント(材料表を参照)を氷上で融解する:プラスミドVSV-GおよびDelta、SCXプラスミド、BioT15,16をパッケージングします。
      2. プラスミドを静かにボルテックスしてスピンダウンします。DNA濃度を測定します。
      3. トランスフェクション用のDNA濃度とフラスコの数に基づいて、必要な各成分の量を計算します:1つのT75フラスコに対して、トランスフェクション複合体は、750 μLの無血清培地(無血清DMEMやPBSなど)、7.5 μgのSCXプラスミド、0.75 μgのVSV-Gプラスミド、6.75 μgのデルタプラスミド、および22.5 μLのBioTで構成されます。ピペッティングエラーについては、余分に考慮してください。
      4. ピペッティングで静かに上下させて混合します。遠心分離機で短時間回転させます。室温で15分間インキュベートし、すぐに使用してください。
  2. トランスフェクションとレンチウイルス産生
    注意: 3日目以降、プロトコルはレンチウイルスを扱うことを伴うため、作業は封じ込めレベル2+の運用手順を使用して実行する必要があります。労働者は、2重の手袋、手首のカバー、安全メガネ、マスク、長ズボン、閉じた靴などの個人用保護具を着用する必要があります。ピペットチップ、フラスコ、液体培地を含むすべての廃棄物と材料は、漂白剤(最終1%次亜塩素酸ナトリウム)で少なくとも20分間除染する必要があります。掃除機は使用しないでください。
    1. HEK293T/17 個のセルを播種します。
      1. トランスフェクションの約18〜24時間前(0日目)に、293T細胞を持ち上げてT75フラスコに播種します。以下のボリュームは、培養容器としてT75を仮定しています。使用する細胞培養容器に合わせて容量を調整してください。
      2. フラスコから培地を取り出し、5 mLのPBSで洗浄します。
        注:細胞はフラスコの表面から非常に簡単に浮き上がります。フラスコの側面にPBSを添加し、細胞への溶液の直接添加は避けてください。
      3. 予熱した0.25%トリプシン3 mLを各フラスコに加え、37°Cで5分間インキュベートします。細胞をコニカルチューブに集め、室温で300 x gで5分間遠心分離します。
      4. 上清を除去し、293T培地に再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。
      5. 細胞を5.3 x 104 cells/cm2 で播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
      6. 翌日(1日目)に、トランスフェクション複合体を調製します。細胞からの増殖培地を、予熱したMSCレンチ包装培地5 mLと交換します(ステップ3.1.2)。
      7. トランスフェクション複合体を細胞に滴下します。ディッシュを静かに傾けて、トランスフェクション複合体が細胞に均一に曝露されるようにします。細胞をインキュベーターに48時間戻します。
        注:毒性は24時間後(2日目)に観察する必要があります。.
      8. 48時間後(3日目)、ピペットを使用してウイルス含有培地を別のコニカルチューブに慎重に集め、300 x g (室温)で5分間遠心分離します。
      9. 予め温めたMSCレンチ包装培地5 mLを293T細胞のT75フラスコに加え、一晩インキュベーターに戻します。
      10. 遠心分離後、上清を0.45μmの滅菌フィルターでフィルターに直接ピペッティングし、上清をろ過します。ウイルス含有培地を4°Cで一晩保存します。
      11. さらに24時間後(4日目)、ピペットを使用してウイルス含有培地を別のコニカルチューブに再度慎重に収集し、300 x g (室温)で5分間遠心分離します。
      12. ウイルスを前収集日のウイルスと組み合わせて混合し、均質な溶液を確保します。この時点で、実験のタイムラインに応じて、プロトコルを一時停止し、後で再開することができます。レンチウイルスを分注して-80°Cで凍結するか、レンチウイルスを氷上に保存しながら「SCXによるiMSCの形質導入」(ステップ3.3)を進めることができます。
        注:レンチウイルスアリコートを凍結して解凍した後は、再凍結しないでください。
  3. SCXによるiMSCの形質導入
    1. 力価プレート導入を行います。
      1. 0日目に、「標準リフティングセルプロトコル」を実行します。
      2. 細胞をMSC培地に再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。
      3. 6ウェルプレートに、4 x 103 cells/cm2を加えます。残りを20 mLのMSC培地(これがコントロールプレート)を含む追加の150 mmプレートに再播種します。細胞を37°Cで24時間インキュベートします。
      4. 翌日(1日目)には、細胞のコンフルエント度は~40%になります。レンチ包装増殖培地を予熱し、ポリブレンと約3 mLのレンチウイルスを氷上で解凍します(または、ウイルス採取と同じ日に行う場合は、使用するまで氷上に保管してください)。
      5. レンチ包装増殖培地およびレンチウイルスを、所望の力価(すなわち、12.5%、25%、50%、75%、100%)に基づいてウェルに添加する。0.5 μL のポリブレンを添加し、最終濃度を 5 μg/mL にします(ストック濃度:10 mg/mL、 材料表を参照)。
      6. プレートを回転させて、すべての細胞に均一に曝露されるようにします。プレートを37°Cで48時間インキュベーターに戻します。
    2. SCXレンチウイルス力価の効率をフローサイトメトリーで評価します。
      1. 48時間後、「標準リフティングセルプロトコル」を実行します。
      2. 細胞をPBSに再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。細胞を室温で300 x gで5分間遠心分離します。
      3. 上清を除去し、3 mLのFACSバッファーに再懸濁して洗浄します。細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。
      4. FACSバッファー洗浄をさらに2回繰り返し、最終細胞ペレットを300 μLのFACSバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリーマシンを使用して、各力価のGFPの発現を評価します。
      5. 力価と細胞生存率に基づいて、形質導入を進めるための適切なレンチウイルス力価を決定します。この時点で、実験のタイムラインに応じて、プロトコルを一時停止し、後で再開することができます。
    3. 大規模なSCX形質導入を行います。
      注:記載されている容量は、150 mm プレート 1 枚または T175 フラスコ 1 枚あたりのものです。これは、所望の血管サイズおよび形質導入の規模に応じて適宜調整され得る。
      1. 0日目に、「標準リフティングセルプロトコル」を実行します。
      2. 細胞をMSC培地に再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。4 x 103 cells/cm2で細胞を播種します。細胞を37°Cで24時間インキュベートします。
      3. 翌日(1日目)には、細胞のコンフルエント度は~40%になります。レンチ包装増殖培地を予熱し、ポリブレンと事前に計算された量のレンチウイルスを氷上で解凍します。
      4. 決定した力価に基づいて、必要な量のレンチ包装増殖培地とレンチウイルスをウェルに加えます。5 μg/mL のポリブレン (ストック濃度: 10 mg/mL) を添加します。
      5. 3日目に、蛍光顕微鏡で細胞を観察します。新しく製造されたiMSCSCX+ はGFPを蛍光するはずです。ウイルスを含む培地を、あらかじめ温めたMSC培地と交換します。この時点で、実験のタイムラインに応じて、プロトコルを一時停止し、後で再開することができます。

4. iMSCSCX+ の継代と伸長

  1. iMSCSCX+ の継代、増殖、凍結、融解は、プロトコルのステップ 2 で説明したように、iMSC の場合と同じ方法で行います。

5.機械的負荷

注:このセクションには最低4日かかりますが、細胞の収縮が観察されるかどうかによっては、それ以上になる場合があります。

  1. 実験準備
    1. シリコンプレートを準備します。
      1. オートクレーブ2枚のシリコンプレート( 材料表を参照)。その後、滅菌条件下で、オートクレーブバッグからシリコンプレートを取り出し、150mmプレートに入れます。
      2. 130 μL のフィブロネクチン(100倍、 材料表を参照)と 13 mL の滅菌 PBS を 15 mL のコニカルチューブに入れます。チューブを数回ひっくり返して混ぜます。
      3. 400μLのフィブロネクチン溶液をシリコーンプレートの各ウェルに加えます。プレートを37°Cで最低2時間または一晩インキュベートします。
      4. 使用前に、フィブロネクチン溶液を吸引し、プレートを細胞培養フード内で少なくとも30分間風乾させて、フィブロネクチン溶液を完全に蒸発させます。
        注:フィブロネクチン溶液は事前にウェルから取り除くことができ、コーティングされたプレートは、使用するまで最大2週間、37°Cで放置することができます。
    2. MSC ストレッチ メディアを準備します。
      1. 140 μLのアスコルビン酸(ストック:100倍、最終濃度:50 μg/mL)を、15 mLのコニカルチューブに入れた予熱したMSC培地14 mLに添加して、MSCストレッチ培地を調製します。
        注:アスコルビン酸は、培地を交換する前に、MSC培地に新たに添加する必要があります。
  2. シリコーンプレートへのiMSCSCX+ の播種
    1. 「標準リフティングセルプロトコル」を実行します(ステップ1.3)。
    2. 細胞をMSC培地に再懸濁し、血球計算盤またはセルカウンターを使用して生細胞をカウントします。
    3. 1.25 x 104 cells/cm2を得るのに必要な細胞懸濁液の量を計算します。
    4. この量のMSCストレッチメディアを15 mLコニカルチューブから取り出します。ターゲットセルを追加します。新しい細胞懸濁液を均質に反転させます。
    5. 400 μLの新しい細胞懸濁液を両方のシリコンプレートのすべてのウェルに加えます。
    6. 蓋を150mmプレートに戻し、37°Cで24時間インキュベーターに戻します。
  3. 一軸張力
    1. 翌日、延伸装置( 材料表を参照)をddH2Oで洗い流し、続いて70%エタノールで洗い流します。装置を拭き取り、細胞培養フードに入れ、15分間UVします。
    2. 播種したプレートを取り出し、ウェルに細胞の接着が良好であるかどうかを確認します。
    3. 1枚のプレートをインキュベーターに入れたままにし(静電気制御)、ネジをシリコンプレートの穴に合わせ、2番目のシードしたシリコンプレートをストレッチ装置に入れます。無菌性を確保するために、装置の蓋を元に戻します。
    4. 播種したシリコンプレートを電子ソース( 材料表を参照)に装置を取り付け、37°Cのインキュベーターに入れます。
    5. プログラムで、サイクリックストレッチングプロトコルを 4%正弦波ひずみ、0.5Hz、2時間 /日に設定します。 スタート ボタンを1回押してストレッチを開始します。ストレッチはすぐに始める必要があります。
    6. セルを最低3日間伸ばします。細胞を毎日監視し、細胞の収縮が観察できる場合は伸張プロトコルを停止します。一日おきに新しいMSCストレッチメディアに交換してください。

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Representative Results

ヒトiPS細胞からiMSCへの分化
前述したように、iPS細胞をiMSCに分化させるための現在のプロトコルには、胚様体の形成が含まれます2。このプロセスは、iPS細胞からiMSCを誘導するのに約10日かかります(図1A)。ただし、新しく生成された iMSC を少なくとも 2 回継代することを強くお勧めします。これにより、ゼラチンでコーティングされたプレートが不要になるだけでなく、安定したMSC発現が確立されます。分化後6継代の後に実施したフローサイトメトリー定量では、CD44(83.1%)、CD90(88.4%)、CD105(99.2%)などの古典的なMSC表面マーカーの発現が高止まりする、ほぼ純粋な細胞集団が実証されました17,18(図1B)。形態的には、iMSCは骨髄MSCによく似ており、細長く線維芽細胞のように見えます(図1C)。

レンチウイルス形質導入を用いたSCXを過剰発現させるiMSCの遺伝子工学
レンチウイルスは、SCXBを挿入してSCX-GFP+を発現させたpLenti-C-mGFPベクターをHEK293T/17細胞と2つのパッケージングプラスミドとともにトランスフェクションすることによって産生されました。トランスフェクションは、BioT(μl)とDNA(μg)の比率が1.5:1のBioTメソッド15、16 を用いて行いました。

HEK293T/17細胞を、トランスフェクションの18〜24時間前に5.3×10、4 細胞/cm2 の密度で播種した。トランスフェクション時には、低効率の力価を避けるために、細胞のコンフルエント度が80%〜95%に達する必要があります(図2B1、左)。プラスミドカクテルを添加してから 24 時間以内に、ある程度の毒性が観察され、48 時間でピークに達しました(図 2B2)。SCXレンチウイルスベクターはGFP標識であるため、GFP発現は48時間後に観察できるはずです(図2B3)。GFP発現と組み合わされた高い毒性の存在は、トランスフェクションの成功の信頼できる指標です。レンチウイルスを48時間および72時間で収集し、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現解析を用いて形質導入効率を評価しました。GFP陽性細胞の絶対強度は、SCX積分の代理として使用され、力価が高いほど有意に高かった(図3A)。形質導入効率は、SCX-GFP+ 細胞の割合として測定され、レンチウイルス量に基づく用量反応効果を示しました(図3B)。異なる継代でのiMSCSCX+ のフローサイトメトリーでも、導入遺伝子の発現レベルや形質導入細胞の割合に変化はなく、高い安定性が示されました(図3C)。さらに、選別せずに4週間の定期培養を行った後、iMSCSCX+ はSCXの安定した過剰発現を維持しました(図3D)。75%レンチウイルスを用いて、力価に基づいて大規模な形質導入を行いました(図2C)。

iMSCSCX+の機械的負荷
iMSCSCX+細胞を、細胞密度1.25 x 104 cells/cm2(図4A、B)で変形可能なシリコンプレートに播種し、伸長プロトコルを開始する前に細胞を接着できるようにしました。最終的な播種密度は、単層の異常増殖を防ぐために最適化されました。播種密度が高すぎると、細胞の収縮が早まり、細胞死が早まることは注目に値します(図4D)。静的対照群では、細胞を同一のプレートに播種したが、延伸は行わなかった。iMSCSCX+細胞を2Dバイオリアクターで最低3日間、最大7日間、4%の一軸ひずみと0.5Hzで1日あたり2時間伸張しました。このストレッチ療法は、生理学的に関連性があると説明されているものと一致しています9。数日間の伸長後、ランダムな細胞組織化を示した静的グループと比較して、ある程度の細胞組織化が観察されます(図4C)。アクチンフィラメントのファロイジン染色は、静的プレートで観察されたランダムな細胞組織とは対照的に、細胞が伸長方向に対して垂直に成長しているように見えることをさらに強調しています(図4E)。新たに生成されたiTenocytesを特徴付けるために、以前に報告されたように、遺伝子発現解析のために3日目と7日目に細胞を採取しました14。遺伝子発現解析により、0日目のiMSCのみと比較して、3日目と7日目の両方でテノジェニック遺伝子(SCX、THBS4、COL1a1、BGN、MKX、およびTPPP3)5,7,19,20に有意なアップレギュレーションがあるため、iMSCSCX+細胞は機械応答性であることが明らかになりました(図5A)。さらに、延伸7日後の培地中のコラーゲン沈着は、iMSCSCX+延伸群で他のすべての群と比較して有意に高かった(図5B)。

Figure 1
図1:iMSC分化の概略図とフローサイトメトリーの特性評価。 (A)iTenocyteの生成とiMSC誘導のタイムラインの全体的な概略図。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。(B)フローサイトメトリー定量では、分化後6継代後にiPS細胞由来MSCの古典的なMSC表面マーカーを発現する細胞の割合が高いことが示されています。Sheyn D. et al.2の許可を得て翻案。 (C) 分化後の細胞の位相差画像は、線維芽細胞様の形態を示しています。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:iMSCSCX+ の生産回路図。 (A)第2世代 SCXレンチウイルスベクターを用いたトランスフェクションとiMSCの形質導入の全体像。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。(B1)プラスミドカクテルを添加する前のHEK293T/17細胞。(B2)HEK293T/17細胞は、48時間後にGFPを発現し、毒性を示します。(B3)HEK293T/17細胞で観察できるGFPの発現は、トランスフェクションが成功したことを示しています。(C)作製されたiMSCSCX+ 細胞(力価75%)は、核内でSCX-GFP+ を発現します。スケールバー = 400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:フローサイトメトリーと遺伝子発現による形質導入効率の決定。 GFP陽性細胞の絶対強度は、フローサイトメトリーを用いたSCX統合のプロキシとして使用しました。レンチウイルスのMOIを評価するために、すべての細胞についてフローサイトメトリー解析によりベクター力価を検証しました。(A)ウイルス力価ごとの絶対蛍光。(B)形質導入効率は、SCX-GFP+ 細胞の割合として評価されます。形質導入効率におけるレンチウイルス負荷の用量反応効果は、フロー結果をGFP+細胞のパーセンテージとして提示した場合に観察されました。MOI、感染の多重度、n = 3つの独立した形質導入。一元配置分散分析は、力価を比較するために使用されました。データはSD±平均です。*p < 0.05です。(C)数回の継代後のiMSCSCX+ のフローサイトメトリーでは、安定した導入遺伝子発現のレベルに変化はなく、形質導入細胞の割合にも変化がないことが示されました。力価100%で形質導入されたiMSCは、P3で分裂を停止しました。(D)iMSCをSCX-GFP+ レンチウイルスベクター(75%、MOI = 2.9 e5 TU/mL)で形質導入し、ソーティングなしで4週間の定期培養でSCXの遺伝子発現を評価しました。SCX発現はiMSCSCX+ で有意にアップレギュレーションされ、4週間後にはSCXの安定した過剰発現を示しました。TU、形質導入ユニット;データは平均± SD、**p > 0.01 です。Papalamprou A. et al.14の許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターに播種し、繰り返し伸長します。 (A)2Dバイオリアクターの概略図。Papalamprou A. et al.12の許可を得て転載。(B)細胞は、まず柔軟なシリコンプレートに播種され、37°Cでインキュベートされ、2Dバイオリアクターで周期的に伸長する前に接着できるようにします。(C)iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターで最大7日間延伸しました。静的コントロールの場合、細胞は同一のプレートに播種されましたが、伸縮は行われませんでした。(C1)7日後の静的コントロールプレートは、細胞の確率的配置を示します。(C2)7日後に延伸したプレートは、比較的多くの細胞組織化を示します。(D)観察すべきでないものの3つの例。細胞の播種密度が高すぎたり、細胞が何日も引き伸ばされたりすると、細胞が剥離し始めます。(D1)細胞はわずかに成長しすぎているだけです。黄色の矢印は、細胞の早期収縮の始まりを示します。(D2)適度なレベルの生い茂り。細胞がプレートから剥離し始めます。(D3)重度の過成長。細胞はもはや単層で成長しておらず、3D構造を形成しています。黒のスケールバー = 400 μm。白色のスケールバー = 1000 μm。 (E)7日間の延伸後(または静的プレートの場合は培養中)、細胞をアクチンフィラメントのファロイジンで固定し(赤)、核のDAPIで対比染色しました(青)。白色のスケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:2DバイオリアクターにおけるScxの過剰発現と一軸伸長によるテノジェニックマーカー遺伝子発現の刺激。 (A)iMSCSCX+ を2Dバイオリアクターで7日間延伸しました。静的コントロールの場合、細胞は同一のプレートに播種されましたが、伸縮は行われませんでした。遺伝子発現解析により、iMSCSCX+ は機械応答性であることが明らかになりました。ND = 検出なし。一元配置分散分析を使用して、 各時点とd0 です。N = 8/グループ。(B)2Dバイオリアクターでの7日間の延伸後のコラーゲン沈着。データは平均± SD です。n = 8/グループ; *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。Papalamprou A. et al.12の許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルでは、(1)iMSCへのiPS細胞の誘導、(2)レンチウイルスベクターを用いたSCXの過剰発現、(3)2D一軸張力による細胞の成熟の3つの主要なステップでiTenocytesが生成されます。

iPS細胞をiMSCに分化するために提示されたプロトコルは、私たちのグループ2によって以前に説明されています。その発表以来、臨床試験でiMSCを使用するための確立されたプロトコル21、22、23、および市販の分化キットなど、多数のプロトコルが開発されています。iMSCのトリリネージの可能性のレビューも以前に調査されています2。方法論は異なりますが、すべてのプロトコルでは、MSC表面マーカーの安定した発現を確保するために、いくつかの継代でiMSCの分化後増殖の必要性が強調されています。この段階で、約70%のコンフルエンスで1:3の分割比を使用すると、継代後4〜6日以内に比較的コンフルエントなプレートが得られます。

形質導入に最適な力価を選択する際には、細胞の生存率と効率のバランスを取ることが重要です。力価100%で形質導入されたiMSCは、SCX-GFP陽性細胞が最高レベルを示す可能性がありますが、これらの細胞は形質導入後に3継代の分裂を停止したことは注目に値します(図3C)。したがって、100%未満の力価を使用することをお勧めします。シリコンプレートを播種する前に、フローサイトメトリーを用いてSCX-GFPレベルを再評価することをお勧めします。効率が所望の閾値を下回っていることがデータから示されている場合は、特にin vivoアプリケーションにおいて、播種前にiMSCSCX+細胞を選別することをお勧めします。

iMSCSCX+細胞をシリコーンプレートに播種したら、37°Cで一晩インキュベートして、細胞を接着させてから伸長させる必要があります。シリコーンプレート中の1.25×104セル/cm2の記載された細胞密度は、静電気張力に寄与し得る単層の過成長を防止するために最適化された24。さらに、研究は、さまざまな硬さの基質中のコンフルエント培養における細胞間直接接触が細胞の挙動を変化させる可能性があることを示唆しています24,25,26。パイロット実験では、特に後の時点で、シリコーンプレートからの目に見える細胞剥離が観察されました(図4D)。これは、オーバーコンフルエンス24によるECM細胞シートの形成に起因している可能性がある。したがって、重要なパラメータには、細胞密度とストレッチ発作の数が含まれます。現在の方法では、遺伝子発現解析によるテノジェニックポテンシャルの評価のために、3日目と7日目に細胞を採取しました。ただし、細胞を2Dバイオリアクターで少なくとも3日間延伸し、その後、過増殖や細胞剥離を防ぐために、伸張したプレートと静的プレートをモニタリングすることをお勧めします。

数回のストレッチ発作の後、ある程度の細胞のアライメントと組織化が観察されます(図4C1、E)。これは、in vitroで一軸ひずみに応答してひずみ軸に垂直な細胞のアライメントが観察される多くの研究と一致しています24,27。これに対し、静的プレートは確率的セル構成を示します(図4C2、E)。

私たちの知る限り、MSCを腱細胞またはリガメントサイトに分化するためのSCXの過剰発現と機械的刺激の相乗効果を調査した研究はごくわずかです24,28,29。Gasparらは、ここで説明したものと同様の2Dバイオリアクターシステムを採用しましたが、より高いレベルの全ひずみを適用しました(1Hzで10%、12時間/日)。興味深いことに、BM-MSCとヒトテノサイトにおけるSCX、TNMD、およびCOL1a1の発現の変化を検出することはできませんでした。しかし、これは彼らの研究24で使用されたより高い適用株に起因する可能性があります。Chenらは、レンチウイルスベクターを用いて、多層シートにアセンブルしたヒトESC-MSCにおいてSCXを過剰発現させた。彼らは、一軸の繰り返し荷重(1Hzで10%ひずみ、2時間/日、最大21日間)を加え、COL1a1、COL1a2、COL14、およびTNMDのアップレギュレーションとECM堆積の増加を観察しました29。Nicholsらは、C3H10T1/2細胞に完全長マウスScx cDNAを一過性にトランスフェクションし、単軸サイクリックひずみ(1%、1Hz、30分/日、最大14日間)で3Dコラーゲンハイドロゲルで細胞を培養しました。我々の発見と同様に、彼らのグループは、緊張した過剰発現のコンストラクトでSCXとCOL1A1の発現の上昇を観察したが、周期的な伸長に応答してTNMDの発現に変化は見られなかった28。

さらに、MKXのような他の腱関連マーカーの過剰発現を考慮することは興味深いかもしれません。Tsutsumiらは、C3H10T1/2細胞でMKXを過剰発現させ、3Dシステムで周期的な機械的伸張を施すことの複合効果を調査しました。彼らは、コラーゲン線維束とアクチンフィラメントのアライメントとともに、SCX、COL1a1、DCN、およびCOL3a1の有意なアップレギュレーションを示しました30。

iTenocytesを生成するためのこの方法には限界があることを認識することが重要です。市販の2Dバイオリアクターは概念実証作業に有利ですが、そのサイズが収率を制限します。これらの細胞がハイスループットアッセイに必要であったり、腱修復療法のための既製の細胞源として必要とされる場合は、単軸延伸を大規模に実施できるシステムの探索を検討する必要があります。さらに、さらなる研究には、安定したテノジェニック発現を確認するためのiTenocytesの増殖を含める必要があり、 in vivo 再生への寄与を評価することは、テノジェニックポテンシャルを評価するために重要です。

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Disclosures

すべての著者には、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgments

この研究は、NIH/NIAMS K01AR071512 と CIRM DISC0-14350 から Dmitriy Sheyn に部分的に支援されました。2つのレンチウイルスパッケージングプラスミドは、サイモン・ノット研究所(シダーズ・サイナイ医療センター生物医科学科)からの寄贈品でした。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol  Sigma Aldrich M3148
Accutase StemCell Technologies 7920 cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution Thermofisher 15240096
Anti-CD105 Ancell 326-050
APC mouse anti-human CD44 BD Biosciences 559942
APC mouse IgG2 K isotype control BD Biosciences 555745
BenchMark fetal bovine serum GeminiBio 100-106
Biglycan Thermofisher Hs00959143_m1
Bovine serum albumin Millipore Sigma A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer Thermofisher Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Thermofisher 11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM) ATCC 30-2003
Fibronectin bovine plasma Sigma Aldrich F1141
FITC mouse anti-human CD90 BD Biosciences 555595
Gelatin from porcine skin Sigma Aldrich G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE Bio-Rad STAR117
HEK 293T/17 ATCC CRL-11268
IMDM, no phenol red Thermofisher 21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1 Cedars-Sinai iPSC Core Facility N/A https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC Miltenyi Biotec 130-113-271
KnockOut serum replacement Thermofisher 10828010
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A4544
L-Glutamine Thermofisher 2503081
Matrigel Corning 354230 basement membrane matrix
MechanoCulture FX CellScale N/A stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution Thermofisher 11140050
Mohawk human Taqman primer Thermofisher Hs00543190_m1
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276
PBS Thermofisher 10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer Thermofisher Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma Aldrich 192066
Polybrene infection/transfection reagents Millipore Sigma TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer RnD Systems 240-B
Scleraxis human Taqman primer Thermofisher Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone OriGene RC224305L4
Silicone plates CellScale N/A
Sodium azide Millipore Sigma S2002
Tenascin C human Taqman primer Thermofisher Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer Thermofisher Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer Thermofisher Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT Bioland Scientific LLC B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermofisher 25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 Thermofisher Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride Biogems 1293823

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References

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生物工学、第205号、
強膜過剰発現と2D一軸張力 <em>の組み合わせによる</em> 人工多能性幹細胞由来iTenocytesの生成
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Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D.… More

Yu, V., Papalamprou, A., Sheyn, D. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension. J. Vis. Exp. (205), e65837, doi:10.3791/65837 (2024).

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