Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/65307
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Summary

אנו מבססים מודל עכברי של זיהום הקשור לצנתר C.albicans (CRI), שבו נוצר ביופילם על הצנתר, והאינטראקציה בין C.albicans למארח מתואמת היטב עם CRI הקליני. מודל זה מסייע לסנן טיפולים עבור CRI הקשור לביופילם של C.albicans , ומניח בסיס לשינוי קליני.

Abstract

זיהום הקשור לצנתר (CRI) הוא זיהום נוסוקומי נפוץ הנגרם על ידי קנדידה אלביקנס במהלך השתלת קטטר. בדרך כלל, ביופילמים נוצרים על פני השטח החיצוניים של הצנתר ומובילים לזיהומים מופצים, שהם קטלניים לחולים. אין מניעה וניהול טיפול יעיל במרפאות. לכן, דחוף להקים מודל בעלי חיים של CRI לסינון פרה-קליני של אסטרטגיות חדשות למניעתו ולטיפול בו. במחקר זה, צנתר פוליאתילן, צנתר רפואי בשימוש נרחב, הוחדר לחלק האחורי של עכברי BALB/c לאחר הסרת שיער. קנדידה אלביקנס ATCC MYA-2876 (SC5314) המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר חוסן לאחר מכן על פני העור לאורך הצנתר. פלואורסצנטיות אינטנסיבית נצפתה על פני הצנתר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3 ימים לאחר מכן. ביופילמים בוגרים ועבים נמצאו על פני הצנתר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. תוצאות אלה הצביעו על הידבקות, נשאות והיווצרות ביופילם של קנדידה אלביקנס על פני הצנתר. היפרפלזיה של האפידרמיס וחדירת תאים דלקתיים בדגימות העור הצביעו על השינויים ההיסטופתולוגיים של העור הקשור ל- CRI. לסיכום, מודל CRI עכבר הוקם בהצלחה. מודל זה צפוי להיות מועיל במחקר ופיתוח של ניהול טיפולי עבור קנדידה אלביקנס הקשורים CRI.

Introduction

בשנים האחרונות, עם הפיתוח והיישום של חומרים ביו-רפואיים, זיהומים הקשורים לשתלים מתגלים כבעיות קליניות קשות 1,2. עם היישום הרחב של צנתרים רפואיים במרפאות, מספר זיהומים הקשורים ומוות הוא עצום מדי שנה 3,4. נתיבי הזיהום הנפוצים של זיהום הקשור לצנתר (CRI) כוללים: (1) פתוגנים על פני העור חודרים לגוף ונצמדים לפני השטח החיצוניים של הצנתר 5,6,7; (2) פתוגנים שמקורם בפעולה אספטית לא תקינה פולשים, נצמדים ומתיישבים בצנתר; (3) פתוגנים במחזור הדם נצמדים ומתיישבים בצנתר; (4) תרופות מזוהמות על ידי מיקרואורגניזם פתוגני.

קנדידה היא הסיבה השלישית בשכיחותה ל-CRI 8,9. סביר מאוד להניח שהוא יגרום לזיהום בזרם הדם ולקנדידה פולשנית מסכנת חיים אחרת לאחר היווצרות ביופילמים על פני השטח של השתל. הפרוגנוזה גרועה, והתמותה גבוהה2. מדווח כי ביופילמים נוצרים על פני הצנתר תוך שבועיים לאחר החדרת ורידי מרכזי ובלומן של הצנתר מספר שבועות לאחר מכן10,11.

ביופילמים של קנדידה אלביקנס (C. albicans) שנוצרו על צנתרים רפואיים מציגים רשת דו-שכבתית המורכבת משמרים, סטרומה ותפטיר12,13. היווצרות ביופילמים של C. albicans היא לא רק מפתח לעמידות לתרופות ולהתחמקות חיסונית13, אלא גם חיונית לייצור נבגים מפוזרים, מה שמוביל לזיהום המטוגני נוסף 2,12 ומביא לתוצאות חמורות יותר ואף מסכנות חיים. C. albicans-associated CRI הוא הגורם העיקרי לזיהומים קליניים פטרייתיים בזרם הדם 7,14, ויותר מ-40% מהחולים עם זיהום C. albicans בצנתר ורידי מרכזי יתפתחו לחיידק15.

על פי האגודה למחלות זיהומיות של אמריקה, הטיפול המומלץ בקנדידה CRI כולל (1) הסרת הצנתר הנגוע; (2) מתן טיפול אנטי-פטרייתי סיסטמי בן 14 יום8; (3) השתלה מחדש של צנתר חדש4. עם זאת, ביישומים קליניים, צנתרים לא ניתן להסיר באופן מלא לפעמים. חלק מהחולים יכולים להיות מטופלים רק עם אנטיביוטיקה סיסטמית וטיפול נעילה מיקרוביאלית, מלווה תופעות לוואי חזקות 16,17.

מודלים קיימים של בעלי חיים של C. albicans, כגון מודל קנדידיזיס אורופרינגיאלי, מודל קנדידיזיס בנרתיק, ומודל זיהום מערכתי פולשני הנגרם על ידי קנדידה18,19 אינם יכולים להיות מתואמים היטב עם CRI קליני. לכן, במחקר זה נקבע מודל CRI הקשור ל-C. albicans בעכברים. צנתרי פוליאתילן נפוצים קליניים שימשו כשתלים תת-עוריים20,21, ו-C. albicans חוסנו על פני העור כדי לדמות את ההיצמדות של C. albicans לצנתרים הרפואיים ואת היווצרות הביופילמים.

מודל זה שימש בהצלחה במעבדה שלנו כדי לסנן את אפקט האנטי-ביופילם של טיפולים שונים22. בנוסף, בשל זיהוי הפיגור של C. albicans לאחר זיהום בצנתר, זן C. albicans המכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) נבנה וחוסן בעכברים כדי להקל על התצפית האינטואיטיבית של מושבות וביופילמים של C. albicans על הצנתר המושתל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חיות ניסוי, עכברי BALB/c זכרים (12-16 גרם), נרכשו ממרכז חיות המעבדה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג. כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה האתית המוסדית לבעלי חיים של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג עם מספר הרישוי SCXK (שאאנשי) 2021-103.

1. חיץ והכנת ציוד

  1. Transfect C. albicans זנים עם pCaExp פלסמיד בעל ביטוי גבוה.
    1. רכוש C . albicans (SC5314) מ- ATCC. השיגו את הזן הפלואורסצנטי22 בעל ביטוי גבוה של EGFP על-ידי הדבקת C. albicans עם פלסמיד pCaExp בעל ביטוי גבוה המכיל את מסגרת הקריאה הפתוחה המלאה של גן EGFP (מפת הפלסמיד מוצגת באיור 1) והשתמשו בה לניסויים הבאים.
  2. תרבית את זני C. albicans הנגועים.
    1. מושבות חד-שבטיות נבחרות של זן פלואורסצנטי C. albicans מהצלחת והתרבית של תמצית שמרים, פפטון דקסטרוז בינוני (YPD) למשך הלילה (30°C ו-220 סל"ד) ב-5 מ"ל של מדיום נוזלי YPD (YPD + 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצלין).
    2. השהה מחדש את C. albicans במי מלח רגילים לאחר צנטריפוגה ב 400 x g למשך 5 דקות ב- RT.
    3. התאם את ריכוז תרחיף C. albicans ל- 1 x 108 תאים/מ"ל על ידי השוואת העכירות לתקן 0.5 McFarland.
  3. הכינו את כלי הניתוח.
    1. יש להקפיד על אוטוקלאבינג של כל כלי הניתוח (מספריים, מלקחיים, מלקחיים המוסטטיים, מחזיקי מחטים, מחטי תפרים) בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. נעשה שימוש בצנתרי פוליאתילן סטריליים (קוטר פנימי: 0.28 מ"מ; קוטר חיצוני: 0.63 מ"מ).
      הערה: הצנתרים ששימשו במחקר זה עוקרו בגז אתילן אוקסיד והאריזה נפתחה בשולחן נקי במיוחד שנחשף לקרינת UV במשך יותר מ-30 דקות. לפני ההשתלה בעכברים, הצנתרים היו טבולים באתנול 75% כדי למנוע זיהום.

2. הקמת מודל CRI לעכבר

הערה: ההליך הכירורגי מוצג באיור 2.

  1. התאקלמו 30 עכברי BALB/c (12-16 גרם, זכר) בתנאים ספציפיים נטולי פתוגן (SPF) עם גישה חופשית למים ולמזון ומחזור אור וחושך לסירוגין של 12 שעות-12 שעות.
  2. חלקו באופן אקראי 30 עכברי BALB/c לשלוש קבוצות (n = 10 עכברים/קבוצה): (A) קבוצת ביקורת רגילה; (B) קבוצת צנתרים (צנתרים שהושתלו ללא C. albicans); (C) קבוצת מודל (צנתרים שהושתלו ב-C. albicans).
  3. מרדימים את העכברים עם איזופלורן 1-4% ומניחים את העכברים על שולחן ניתוחים במצב נוטה. אובדן רפלקס התיקון ואי תגובה לגירוי הבוהן מאשרים את ההרדמה המוצלחת. הסר את השיער ולעקר את אתר הניתוח עם שלושה סיבובים לסירוגין של יודופור או כלורהקסידין וקרצוף אלכוהול.
  4. השאירו את העכברים בקבוצת הביקורת הרגילה ללא כל טיפול וספקו גישה חופשית למזון ומים.
  5. עבור העכברים בקבוצות הצנתר והמודל, יש לשמור על הרדמה ברמה של 3% איזופלורן. יש לוודא עומק הרדמה הולם על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן ולהתאים את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך.
  6. עבור העכברים בקבוצת הצנתר, יש להחדיר מחט מזרק סטרילית בנפח 1 מ"ל לאזור הערימה האחורית כדי ליצור חור. הכנס קטטר (כ 1 ס"מ אורך) לתוך החור לאחר הסרת מחט מזרק.
  7. עבור העכברים בקבוצת המודל, פיפטה 20 μL של C. albicans מתרחפת על אזור depilation האחורי כדי לדמות את C. albicans commensal על העור.
  8. לאחר שהתמיסה נספגת על ידי העור, הכנס קטטר לאזור depilated האחורי עם אותם הליכים כמתואר בשלב 2.5.
  9. פיפטה עוד 20 μL של C. albicans תרחיף לאורך הצנתר אל הרקמה כדי לדמות C. albicans בסביבה החיצונית.
  10. לתקן את הצנתרים עם סרט וגזה ולהחזיר את העכברים לכלובים להאכלה. בסיום הטיפול יש להזריק לעכברים מלוקסיקאם (4 מ"ג/ק"ג) כמשככי כאבים למשך שלושה ימים רצופים.
    הערה: לאחר הניתוח, עכברים הוזנו בזהירות עם מים ומזון. העכברים היו במעקב פעמיים ביום. עכברים הומתו בשיטה שאושרה על ידי IACUC אם חוו קשיי האכלה, ירידה משמעותית במשקל (10-20%) והיפותרמיה.

3. הערכת מודל CRI

  1. לאחר 3 ימים, מרדימים את העכברים עם 3% איזופלורן ומקריבים אותם על ידי נקע צוואר הרחם. אספו את הצנתרים ואת דגימות רקמת העור מגב העכברים.
  2. התבונן ב- C. albicans וביופילמים על הצנתר על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
    1. יש לטבול את הצנתרים בתמיסת גלוטראלדהיד 2.5% בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות. שטפו את הצנתרים עם PBS סטרילי שלוש פעמים.
    2. תקן את הצנתרים עם 1% חומצה אוסמית במשך 3 שעות ושטוף אותם עם PBS סטרילי שלוש פעמים.
    3. יש לייבש את התאים שעל הצנתרים בתמיסת אתנול הדרגתית בריכוזים עולים (50%, 70%, 80%, 90% ו-100%, 15 דקות/שיפוע).
    4. לטבול את הצנתרים באלכוהול טרט-בוטיל שלוש פעמים (30 דקות בכל פעם).
    5. יש להקפיא במהירות את הצנתרים בחנקן נוזלי, ולייבש בהקפאה את הדגימה במייבש כביסה בהקפאה בהתאם להוראות היצרן.
    6. יש לצפות את דגימות הצנתר בזהב 10 ננומטר על ידי שיקוע קרן יונים.
    7. התבונן בנוכחות C. albicans והביופילם שלו על פני הצנתר של כל קבוצה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (בתנאי ואקום גבוה, 1.5 kV) ורשום את התמונות בכל קבוצה.
  3. צפו ב-C. albicans על הצנתר במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    1. יש לטבול את הצנתרים בתמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ב-4°C למשך 48 שעות.
    2. צפו בנוכחות C . albicans והביופילם שלו על פני הצנתר של כל קבוצה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת עירור של 484 ננומטר ותיעדו את התמונות בכל קבוצה.
      הערה: ההגדלה היא 400x. ניתן לראות את הפלואורסצנטיות של קנדידה אלביקנס בעירור ב 490 ננומטר ופליטה ב 510 ננומטר.
  4. שימו לב ל-C. albicans השוכנים בעור העכבר.
    1. יש לטבול את רקמות העור הגבי של עכברים בתמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ב-4°C למשך 48 שעות.
    2. יש לייבש את רקמות העור הגבי בתמיסת אתנול הדרגתית עם ריכוזים עולים (50%, 70%, 80%, 90% ו-100%, 15 דקות לשיפוע).
    3. הטמע את רקמות העור הגבי המיובשות בפרפין בטמפרטורה של 55-60 מעלות צלזיוס. שימו לב לטמפרטורה כדי למנוע רקמות שבירות. כדי להסיר זיהומים רבים ככל האפשר, חזור על שלב זה שלוש פעמים (30 דקות כל אחד).
    4. חתכו את רקמות העור הגבי (עובי = 5 מיקרומטר) בעזרת מיקרוטום.
    5. Dewax את קטעי פרפין על ידי טבילת שקופיות xylene פעמיים במשך 20 דקות.
    6. יש להחזיר לחות לחלקים באמצעות פליטה עם אתנול הדרגתי (אתנול מוחלט, 90% אתנול, 75% אתנול, מים) למשך 5 דקות בכל פעם.
    7. מכתימים את החלקים בחומצה מחזורית על ידי טבילת הקטע בתמיסת החומצה התקופתית למשך 15 דקות לפני שטיפה במים זורמים פעם אחת ומים מזוקקים פעמיים.
    8. הכתימו את המקטעים בתמיסת צביעת שברון (לפי הוראות היצרן) למשך 30 דקות בחושך ושטפו את המקטעים תחת מים זורמים למשך 5 דקות.
    9. לטבול את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 3-5 דקות לפני שטיפה במים זורמים (2-3 דקות), תמיסה מובחנת (5-10 דקות) ומים זורמים, בהתאמה.
    10. טבלו את החלקים באתנול שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) ובקסילן פעמיים (5 דקות כל אחד) לפני שאיטום החלק עם מסטיק נייטרלי.
    11. צפו בתמונות הדגימה במיקרוסקופ ונתחו את שאריות C. albicans בעור העכבר.
      הערה: ההגדלה היא פי 10 עבור העינית ופי 4 או 10 עבור עדשת המטרה.
  5. שימו לב לשינויים ההיסטופתולוגיים ברקמות העור הגבי.
    1. יש לטבול את רקמות העור הגבי בתמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ב-4°C למשך 48 שעות. יש לייבש את רקמות העור הגבי בתמיסת אתנול הדרגתית בריכוזים עולים (50%, 70%, 80%, 90% ו-100%, 15 דקות לשיפוע).
    2. הטמע את רקמות העור הגבי המיובשות בפרפין כמתואר בשלב 3.4.3.
    3. חותכים את רקמות העור הגבי (עובי = 5 מ"מ) עם מיקרוטום.
    4. Dewax את קטעי פרפין על ידי טבילת שקופיות xylene פעמיים במשך 20 דקות.
    5. יש להחזיר לחות לחלקים באמצעות פליטה עם אתנול הדרגתי (אתנול מוחלט, 90% אתנול, 75% אתנול, מים) למשך 5 דקות בכל פעם.
    6. הכתימו את המקטעים בהמטוקסילין למשך 4 דקות לפני שטיפה במי ברז להסרת צבע הציפה.
    7. להבדיל את הדגימה עם 1% חומצה הידרוכלורית-תמיסת אתנול לפני שטיפת המגלשות עם מים זורמים.
    8. טבלו את הדגימה באתנול 85% ו-95% למשך 5 דקות, והכתימו אותה בתמיסת אאוזין למשך 3 דקות.
    9. יש לייבש את הדגימה על ידי טבילתה באתנול הדרגתי (70%, 90%, 95% ו-100%) וקסילן למשך 2 דקות כל אחד.
    10. חותמים את הדגימה בשרף נייטרלי.
    11. צפו בתמונות הדגימה במיקרוסקופ ונתחו את השינויים הפתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C . albicans ו biofilms על הצנתרים ניתן היה לצפות על ידי SEM. כפי שניתן לראות באיור 322, פני השטח של צנתרי הפוליאתילן בקבוצת הצנתרים היו חלקים, ולא נצפה מיקרואורגניזם פתוגני מודבק. עם זאת, ביופילמים בוגרים וצפופים של C. albicans נראו על פני השטח של צנתרי הפוליאתילן בקבוצת המודל, מה שמצביע על כך ש- C. albicans יכול היה ליישב בהצלחה וליצור ביופילמים על פני הצנתר בעכברים בתנאי הניסוי. יתר על כן, תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אימתו עוד יותר את המסקנות לעיל (איור 4)22. לא נמצאה פלואורסצנטיות ברורה על פני השטח של צנתרי הפוליאתילן בקבוצת הצנתרים. עם זאת, פלואורסצנטיות חזקה שנפלטה על ידי תאי C. albicans דבקים נראתה על פני הצנתר בקבוצת המודל. זה הצביע על כך שמספר גדול של תאי C. albicans נצמדו לפני השטח של הצנתרים, מה שהדגים את הבנייה המוצלחת של מודלים CRI הקשורים לביופילם של C. albicans בעכברים.

על מנת לאמת את הזיהום של רקמת עור העכבר באופן אינטואיטיבי יותר, בוצע ניתוח צביעה פריודטית של Sheff. הוא מזהה את הפחמימות של התאים הפטרייתיים, אשר נמצא בשימוש נפוץ במחקר קליני (איור 5)22. רקמת העור בקבוצת הבקרה והצנתר הרגילה הוכתמה באופן שלילי על ידי חומצה תקופתית שיף (PAS), אשר הצביעה על היעדר תאי C. albicans ברקמות. מספר קטן של תאי C. albicans חיוביים מוכתמים ב-PAS נצפו בקבוצת המודל, מה שמאמת עוד יותר את הסימולציה המוצלחת של פלישה והיצמדות הקשורות ל-C. albicans.

לאחר מכן, השינויים הפתולוגיים ברקמות העור של עכברים שנגרמו על ידי C. albicans הוערכו על ידי ניתוח היסטופתולוגי. כפי שניתן לראות באיור 622, שכבת האפידרמיס התעבתה באופן משמעותי והורחבה לחלק הפנימי של העור בקבוצת המודל. חדירת דלקת נראתה גם כן, מה שמצביע על כך שהזיהום של C. albicans גרם לשינויים פתולוגיים ברורים ברקמת העור של העכבר. שכבת האפידרמיס, שכבת הדרמיס, בלוטות החלב, זקיקי השיער ומבנים אחרים היו ברורים ושלמים בקבוצת הצנתר. לא נצפתה חדירת בצקת ודלקת, בדומה לקבוצת הביקורת הרגילה. תוצאות אלו הצביעו על כך שהחדרת הצנתר לבדה לא גרמה לשינויים ברורים ברקמת העור. השינויים הפתולוגיים ברקמות של קבוצת המודל נבעו מהזיהום שנגרם על ידי C. albicans. לסיכום, התוצאות מאששות את ההקמה המוצלחת של מודל עכבר CRI הקשור לביופילם C. albicans .

Figure 1
איור 1: אטלס פלסמיד pCaExp. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטי המראה את ההליך של מודל עכברי CRI הקשור ל-C.albicans. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: SEM על פני הצנתר בכל קבוצה. (A) קבוצת צנתרים; (B) קבוצת דגמים (1000x, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר; 5000x, סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). נתון זה שונה באישור Mo et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקרוסקופ פלואורסצנטי של פני השטח של הצנתר בכל קבוצה. (A) קבוצת צנתרים; (B) קבוצת מודל (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). נתון זה שונה באישור Mo et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: צביעת H&E של העור האחורי של עכברים בכל קבוצה. (A) קבוצת צנתרים; (ב) קבוצת מודלים; (C) קבוצת ביקורת, (40x, סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר; 100x, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). נתון זה שונה באישור Mo et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: צביעת PAS של העור האחורי של עכברים בכל קבוצה. (A) קבוצת צנתרים; (ב) קבוצת מודלים; (C) קבוצת ביקורת, (40x, סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר; 100x, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). עיבוי והרחבה משמעותית של שכבת האפידרמיס לחלק הפנימי של העור ניתן לראות בקבוצת המודל (מלבנים אדומים). נתון זה שונה באישור Mo et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRI הוא אחד הזיהומים הנוזוקומיאליים הנפוצים ביותר בקליניקה23. פתוגנים בתוספות העור, כגון האפידרמיס, בלוטות החלב וזקיקי השיער, הם כולם גורמים אפשריים ל- CRI23,24. קנדידה הוא הפתוגן השלישי בגודלו הגורם ל- CRI, שבו קנדידה אלביקנס היה הסוג הנפוץ ביותר של זיהום ביופילם25,26. לכן, מטרתנו הייתה לבנות מודל רלוונטי לבעלי חיים של CRI הקשור לביופילם של קנדידה אלביקנס, כדי לתמוך בטיפול ובמניעה של CRI קשור.

כדי לבנות את מודל ה-CRI, נוספה כמות קטנה של C. albicans לעור הגבי של עכברים, המדמה את המצב הקליני שבו לא ניתן לחסל באופן מלא חלק מ-C. albicans ברקמות העמוקות ובתוספות העור על ידי עיקור שגרתי. לאחר השתלת הצנתר, C. albicans חוסן מחדש כדי לחקות את נוכחותו של C. albicans בסביבה החיצונית במהלך הניתוח.

במחקר זה נבחרה נקודת זמן של 3 ימים לבניית המודל, שהיא נמוכה מזו של המודלים המסורתיים של בעלי חיים הקשורים לביופילם C. albicans 18,27 בשל הקושי בהיווצרות הביופילם. לאחר ההדבקה, הידבקות C. albicans והיווצרות ביופילם נראו על פני הצנתר במודל זה, אשר הוכח על ידי תוצאות SEM ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3 ואיור 4). ייתכן שהסיבה לכך היא שהריכוז של C. albicans במחקר זה היה 1 × 108 CFU/mL, שהיה גבוה בהרבה מזה של מודלים אחרים של בעלי חיים18,27. חוץ מזה, העור סביב הצנתר נמצא במגע מתמיד עם הסביבה החיצונית. כדי לדמות את הסביבה הקיצונית שבה CRI עשוי להיתקל, C. albicans חוסנו שוב לאחר הניתוח.

הישנות הזיהום נגרמת לעיתים קרובות על ידי פתוגנים שנשארים ברקמות הסובבות 23,28,29. לכן, נוכחות או היעדר פתוגנים ברקמות חשוב עבור CRI. במאמר זה, צביעת PAS בוצעה כדי לחקור את השאריות של C. albicans ברקמות העור. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את השפעת הסילוק של תרופות טיפוליות חדשות או שיטות עבור CRI.

לסיכום, זן קנדידה אלביקנס עם eGFP שימש לבניית מודל CRI של עכבר כדי להקל על התצפית האינטואיטיבית של התיישבות קנדידה אלביקנס על קטטרים. זן זה יכול לשמש גם להערכת האינטראקציה בין קנדידה אלביקנס לתאים מארחים, למשל, הפלישה וההיצמדות של קנדידה אלביקנס לפונדקאי, ההשפעה האנטי-קנדידה אלביקנס של טיפולים, והתגובה החיסונית. חוץ מזה, שיטת חיסון דו-שלבית שימשה להדמיית פתוגנים שמקורם בסביבה החיצונית ובגוף. ראוי לציין כי תרבית מיקרוביאלית לאחר ההדבקה לא נערך. נוכחותם של ביופילמים היא גורם חשוב ברגישות הנמוכה של תרביות 30,31,32. דיווחים קודמים מצביעים על כך שלתרבית מיקרוביאלית לאחר ההדבקה הייתה רגישות נמוכה, ספציפיות ודיוק 30,31,32,33,34. במקום זאת, נוכחות של ביופילמים על השתל היא מדד אמין יותר. לכן, SEM ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שימשו במחקר זה כדי לדמיין ולזהות קנדידה אלביקנס היוצרים ביופילמים.

עם זאת, מודל זה לא דימה את האינטראקציה בין החסינות המוחלשת של המטופל לבין זיהום קנדידה אלביקנס שנצפה במרפאות. אם המודל יוכל לשקול את הטיפולים מדוכאי החיסון (כגון זריקות מתמשכות של גלוקוקורטיקואידים)35 לפני החיסון של קנדידה אלביקנס , ניתן יהיה לדמות טוב יותר זיהומים המתרחשים במצבים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית מהקרן למדעי הטבע של מחוז שאאנשי (מענק מספר 2021SF-118) ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענק 81973409, 82204631).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 Mactutrius turbidibris Shanghai Lujing Technology Co., Ltd 5106063
2.5% glutaraldehyde fixative solution Xingzhi Biotechnology Co., Ltd DF015
4 °C refrigerator Electrolux (China) Electric Co., Ltd ESE6539TA
Agar Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd 01-023
Analytical balances Shimadzu ATX124
Autoclaves Sterilizer SANYO MLS-3750
Butanol Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd 200-889-7
Carbenicillin Amresco C0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope  Nikon Eclipse Ts2-FL
Glucose Macklin  D823520
Inoculation ring Thermo Scientific 251586
Isoflurane RWD 20210103
Paraformaldehyde Beyotime Biotechnology P0099
PAS dye kit Servicebio G1285
Peptone Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd 01-001
Polyethylene catheter Shining Plastic Mall PE100
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine  RWD R550
SEM Hitachi TM-1000
Temperature incubator Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd ZQTY-50N
Ultrapure water water generator Heal Force NW20VF
Ultrasound machine Do-Chrom DS10260D
Xylene Sinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd 10023428
Yeast extract Thermo Scientific Oxoid LP0021B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. microbiology reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  2. Giri, S., Kindo, A. J. A review of Candida species causing blood stream infection. Indian Journal of Medical Microbiology. 30 (3), 270-278 (2012).
  3. Weinstein, R. A., Darouiche, R. O. Device-associated infections: A macroproblem that starts with microadherence. Clinical Infectious Diseases. 33 (9), 1567-1572 (2001).
  4. Mermel, L. A., et al. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections. Clinical Infectious Diseases. 32 (9), 1249-1272 (2001).
  5. Seidler, M., Salvenmoser, S., Müller, F. -M. C. In vitro effects of micafungin against Candida biofilms on polystyrene and central venous catheter sections. International Journal of Antimicrobial Agents. 28 (6), 568-573 (2006).
  6. Chaves, F., et al. Diagnosis and treatment of catheter-related bloodstream infection: Clinical guidelines of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology and (SEIMC) and the Spanish Society of Spanish Society of Intensive and Critical Care Medicine and Coronary Units (SEMICYUC). Medicina Intensiva. 42 (1), 5-36 (2018).
  7. Raad, I. I., Bodey, G. P. Infectious complications of indwelling vascular catheters. Clinical Infectious Diseases. 15 (2), 197-208 (1992).
  8. Paul DiMondi, V., Townsend, M. L., Johnson, M., Durkin, M. Antifungal catheter lock therapy for the management of a persistent Candida albicans bloodstream infection in an adult receiving hemodialysis. Pharmacotherapy. 34 (7), e120-e127 (2014).
  9. Bouza, E., Guinea, J., Guembe, M. The role of antifungals against candida biofilm in catheter-related candidemia. Antibiotics (Basel). 4 (1), 1-17 (2014).
  10. Raad, I., et al. Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement. The Journal of Infectious Diseases. 168 (2), 400-407 (1993).
  11. Yousif, A., Jamal, M. A., Raad, I. Biofilm-based central line-associated bloodstream infections. Advances in Experimental Medicine and Biology. 830, 157-179 (2015).
  12. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  13. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  14. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  15. Anaissie, E. J., Rex, J. H., Uzun, O., Vartivarian, S. Predictors of adverse outcome in cancer patients with candidemia. The American Journal of Medicine. 104 (3), 238-245 (1998).
  16. Fujimoto, K., Takemoto, K. Efficacy of liposomal amphotericin B against four species of Candida biofilms in an experimental mouse model of intravascular catheter infection. Journal of Infection and Chemotherapy. 24 (12), 958-964 (2018).
  17. Shuford, J. A., Rouse, M. S., Piper, K. E., Steckelberg, J. M., Patel, R. Evaluation of caspofungin and amphotericin B deoxycholate against Candida albicans biofilms in an experimental intravascular catheter infection model. The Journal of Infectious Diseases. 194 (5), 710-713 (2006).
  18. Koh, A. Y., Köhler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
  19. Tucey, T. M., et al. Glucose homeostasis is important for immune cell viability during candida challenge and host survival of systemic fungal infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  20. Lawrence, E. L., Turner, I. G. Materials for urinary catheters: a review of their history and development in the UK. Medical Engineering & Physics. 27 (6), 443-453 (2005).
  21. Schumm, K., Lam, T. B. Types of urethral catheters for management of short-term voiding problems in hospitalized adults: a short version Cochrane review. Neurourology and Urodynamics. 27 (8), 738-746 (2008).
  22. Mo, F., et al. Development and evaluation of a film forming system containing myricetin and miconazole nitrate for preventing candida albicans catheter-related infection. Microbial Drug Resistance. 28 (4), 468-483 (2022).
  23. Balikci, E., Yilmaz, B., Tahmasebifar, A., Baran, E. T., Kara, E. Surface modification strategies for hemodialysis catheters to prevent catheter-related infections: A review. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 109 (3), 314-327 (2021).
  24. María, L. T., Alejandro, G. S., María Jesús, P. G. Central venous catheter insertion: Review of recent evidence. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 35 (1), 135-140 (2021).
  25. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  26. He, Y., et al. Retrospective analysis of microbial colonization patterns in central venous catheters, 2013-2017. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 8632701 (2019).
  27. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223 (2020).
  28. Cantón-Bulnes, M. L., Garnacho-Montero, J. Practical approach to the management of catheter-related bloodstream infection. Revista Espanola de Quimioterapia. 32 Suppl 2 (Suppl 2), 38-41 (2019).
  29. Böhlke, M., Uliano, G., Barcellos, F. C. Hemodialysis catheter-related infection: prophylaxis, diagnosis and treatment. The Journal of Vascular Access. 16 (5), 347-355 (2015).
  30. Fang, X., et al. Effects of different tissue specimen pretreatment methods on microbial culture results in the diagnosis of periprosthetic joint infection. Bone & Joint Research. 10 (2), 96-104 (2021).
  31. Naumenko, Z. S., Silanteva, T. A., Ermakov, A. M., Godovykh, N. V., Klushin, N. M. Challenging diagnostics of biofilm associated periprosthetic infection in immunocompromised patient: A clinical case. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (5), 786-790 (2019).
  32. Cai, Y., et al. Metagenomic next generation sequencing improves diagnosis of prosthetic joint infection by detecting the presence of bacteria in periprosthetic tissues. International Journal of Infectious Diseases. 96, 573-578 (2020).
  33. Samanipour, A., Dashti-Khavidaki, S., Abbasi, M. R., Abdollahi, A. Antibiotic resistance patterns of microorganisms isolated from nephrology and kidney transplant wards of a referral academic hospital. Journal of Research in Pharmacy Practice. 5 (1), 43-51 (2016).
  34. Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
  35. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 205
מודל זיהום <em>קנדידה אלביקנס</em> הקשור לצנתר בעכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, C., Mo, F., Zhang, J., Zhang,… More

Yang, C., Mo, F., Zhang, J., Zhang, P., Li, Q., Zhang, J. A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse. J. Vis. Exp. (205), e65307, doi:10.3791/65307 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter