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Immunology and Infection

माउस में एक कैथेटर से संबंधित कैंडिडा अल्बिकन्स संक्रमण मॉडल

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/65307
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Summary

हम C.albicans से जुड़े कैथेटर से संबंधित संक्रमण (CRI) का एक माउस मॉडल स्थापित करते हैं, जिसमें कैथेटर पर बायोफिल्म बनता है, और C.albicans और मेजबान के बीच बातचीत नैदानिक CRI के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। यह मॉडल C.albicans बायोफिल्म से जुड़े CRI के लिए स्क्रीन थेरेपी में मदद करता है, जो नैदानिक परिवर्तन की नींव रखता है।

Abstract

कैथेटर से संबंधित संक्रमण (सीआरआई) कैथेटर आरोपण के दौरान कैंडिडा अल्बिकन्स के कारण होने वाला एक सामान्य नोसोकोमियल संक्रमण है। आमतौर पर, बायोफिल्म कैथेटर की बाहरी सतह पर बनते हैं और प्रसारित संक्रमण को जन्म देते हैं, जो रोगियों के लिए घातक होते हैं। क्लीनिकों में कोई प्रभावी रोकथाम और उपचार प्रबंधन नहीं है। इसलिए, इसकी रोकथाम और उपचार के लिए नई रणनीतियों की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग के लिए सीआरआई का एक पशु मॉडल स्थापित करना जरूरी है। इस अध्ययन में, एक पॉलीथीन कैथेटर, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मेडिकल कैथेटर, बालों को हटाने के बाद बीएएलबी / सी चूहों के पीछे डाला गया था। कैंडिडा अल्बिकन्स ATCC MYA-2876 (SC5314) बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त बाद में कैथेटर के साथ त्वचा की सतह पर inoculated था. तीव्र प्रतिदीप्ति 3 दिन बाद एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कैथेटर की सतह पर मनाया गया था. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कैथेटर की सतह पर परिपक्व और मोटी बायोफिल्म पाए गए। इन परिणामों ने कैथेटर की सतह पर कैंडिडा अल्बिकन्स के आसंजन, उपनिवेश और बायोफिल्म गठन का संकेत दिया। एपिडर्मिस के हाइपरप्लासिया और त्वचा के नमूनों में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ ने सीआरआई से जुड़ी त्वचा के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का संकेत दिया। संक्षेप में, एक माउस सीआरआई मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था। यह मॉडल सीआरआई से जुड़े कैंडिडा अल्बिकन्स के लिए चिकित्सीय प्रबंधन के अनुसंधान और विकास में सहायक होने की उम्मीद है।

Introduction

हाल के वर्षों में, जैव चिकित्सा सामग्री के विकास और आवेदन के साथ, प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण मुश्किल नैदानिक समस्याओं 1,2 के रूप में उभर रहे हैं. क्लीनिकों में चिकित्सा कैथेटर के व्यापक आवेदन के साथ, संबंधित संक्रमण और मौतों की संख्या हर साल 3,4 बहुत बड़ी है। कैथेटर से संबंधित संक्रमण (सीआरआई) के सामान्य संक्रमण मार्गों में शामिल हैं: (1) त्वचा की सतह पर रोगजनकों शरीर में घुसपैठ और कैथेटर 5,6,7 की बाहरी सतह का पालन करें; (2) अनुचित सड़न रोकनेवाला ऑपरेशन-व्युत्पन्न रोगजनकों कैथेटर पर आक्रमण, पालन और उपनिवेश करते हैं; (3) रक्त परिसंचरण में रोगजनकों का पालन और कैथेटर पर उपनिवेश; (4) रोगजनक सूक्ष्मजीव द्वारा दूषित दवाएं।

कैंडिडा सीआरआई 8,9 का तीसरा सबसे आम कारण है। इम्प्लांट की सतह पर बायोफिल्म बनने के बाद रक्तप्रवाह संक्रमण और अन्य जानलेवा आक्रामक कैंडिडिआसिस होने की बहुत संभावना है। रोग का निदान खराब है, और मृत्यु दर उच्चहै 2. यह बताया गया है कि बायोफिल्म केंद्रीय शिरापरक सम्मिलन के बाद 2 सप्ताह के भीतर कैथेटर की सतह पर और कैथेटर के लुमेन में कुछ सप्ताह बाद10,11 बनते हैं।

कैंडिडा अल्बिकन्स (सी. अल्बिकन्स) मेडिकल कैथेटर पर गठित बायोफिल्म्स खमीर, स्ट्रोमा और मायसेलियम 12,13से बना एक डबल-लेयर नेटवर्क प्रदर्शित करते हैं। अल्बिकन्स बायोफिल्म का गठन न केवल दवा प्रतिरोध और प्रतिरक्षा चोरी13 के लिए एक कुंजी है, बल्कि प्रसारित बीजाणुओं का उत्पादन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है, जो आगे हेमटोजेनस संक्रमण 2,12 की ओर जाता है और इसके परिणामस्वरूप अधिक गंभीर और यहां तक कि जीवन-धमकाने वाले परिणाम होते हैं। C. albicans जुड़े सीआरआई नैदानिक फंगल रक्तप्रवाह संक्रमण 7,14 का एक प्रमुख कारण है, और अधिक से अधिक 40% के साथ रोगियों के सी. केंद्रीय शिरापरक कैथेटर में albicans संक्रमण बैक्टीरिया15 में विकसित होगा.

अमेरिका के संक्रामक रोग सोसायटी के अनुसार, कैंडिडा सीआरआई के अनुशंसित उपचार में (1) संक्रमित कैथेटर को हटाना; (2) रोगियों को 14 दिन-प्रणालीगत एंटिफंगल थेरेपी8 के अधीन करना; (3) एक नया कैथेटर प्रत्यारोपितकरना 4. हालांकि, नैदानिक अनुप्रयोगों में, कैथेटर को कभी-कभी पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता है। कुछ रोगियों को केवल प्रणालीगत एंटीबायोटिक दवाओं और रोगाणुरोधी ताला चिकित्सा के साथ इलाज किया जा सकता है, मजबूत साइड इफेक्ट16,17 के साथ.

सी अल्बिकन्स के मौजूदा पशु मॉडल, जैसे ऑरोफरीन्जियल कैंडिडिआसिस मॉडल, योनि कैंडिडिआसिस मॉडल, और कैंडिडिआसिस18,19 के कारण आक्रामक प्रणालीगत संक्रमण मॉडल नैदानिक सीआरआई के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित नहीं हो सकते हैं। इसलिए, इस अध्ययन में, चूहों में एक सी अल्बिकन्स से जुड़े सीआरआई मॉडल की स्थापना की गई थी। नैदानिक आमतौर पर इस्तेमाल किया पॉलीथीन कैथेटर चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण20,21 के रूप में इस्तेमाल किया गया, और सी. albicans त्वचा की सतह पर inoculated थे चिकित्सा कैथेटर और biofilms के गठन के लिए सी albicans के आसंजन अनुकरण करने के लिए.

इस मॉडल को हमारी प्रयोगशाला में विभिन्न चिकित्सीय22 के एंटी-बायोफिल्म प्रभाव को स्क्रीन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इसके अलावा, के अंतराल का पता लगाने के कारण सी. कैथेटर संक्रमण के बाद albicans , एक सी. बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त albicans तनाव (EGFP) का निर्माण किया गया था और प्रत्यारोपित कैथेटर पर सी albicans के कालोनियों और biofilms के सहज अवलोकन की सुविधा के लिए चूहों में inoculated.

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Protocol

प्रायोगिक जानवरों, नर BALB/c चूहों (12-16 ग्राम), प्रयोगशाला पशु केंद्र, शीआन जियाओतोंग विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र से खरीदे गए थे। सभी प्रक्रियाओं को शीआन जियाओतोंग विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु नैतिक समिति द्वारा लाइसेंस संख्या SCXK (शानक्सी) 2021-103 के साथ अनुमोदित किया गया था।

1. बफर और उपकरण तैयार करना

  1. Transfect C. albicans एक उच्च अभिव्यक्ति प्लास्मिड pCaExp के साथ उपभेदों.
    1. एटीसीसी से सी. अल्बिकन्स (SC5314) खरीदें। ईजीएफपी जीन (प्लाज्मिड मानचित्र चित्रा 1 में दिखाया गया है) के पूर्ण खुले पढ़ने फ्रेम युक्त एक उच्च अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pCaExp के साथ सी albicans ट्रांसफ़ेक्ट करके EGFP उच्च अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट तनाव22 प्राप्त करें और बाद के प्रयोगों के लिए इसका उपयोग करें।
  2. संस्कृति ट्रांसफ़ेक्ट सी।
    1. खमीर निकालने से सी अल्बिकन्स फ्लोरोसेंट तनाव के मोनोक्लोनल कालोनियों का चयन करें, वाईपीडी तरल माध्यम (वाईपीडी + 50 माइक्रोग्राम/एमएल कार्बेनिसिलिन) के 5 एमएल में रातोंरात (30 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम) निकालें।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर centrifugation के बाद सामान्य खारा में सी albicans resuspension.
    3. मैलापन की तुलना 0.5 मैकफारलैंड मानक से करके सी. एल्बिकन्स निलंबन की एकाग्रता को 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित करें।
  3. सर्जिकल उपकरण तैयार करें।
    1. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों (कैंची, संदंश, hemostatic संदंश, सुई धारकों, सिवनी सुई) आटोक्लेव सुनिश्चित करें. बाँझ पॉलीथीन कैथेटर (आंतरिक व्यास: 0.28 मिमी; बाहरी व्यास: 0.63 मिमी) का उपयोग किया जाता है।
      नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल कैथेटर एथिलीन ऑक्साइड गैस के साथ निष्फल थे और पैकेजिंग 30 मिनट से अधिक के लिए यूवी के संपर्क में एक अल्ट्रा साफ तालिका में खोला गया था. चूहों में आरोपण से पहले, कैथेटर संदूषण को रोकने के लिए 75% इथेनॉल में डूब गए थे।

2. माउस सीआरआई मॉडल की स्थापना

नोट: शल्य चिकित्सा प्रक्रिया चित्रा 2 में दिखाया गया है.

  1. 30 BALB/c चूहों (12-16 ग्राम, पुरुष) को विशिष्ट-रोगज़नक़ मुक्त (SPF) स्थितियों में पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच और 12 h-12 h वैकल्पिक प्रकाश और अंधेरे चक्र के साथ अनुकूलित करें।
  2. बेतरतीब ढंग से 30 BALB/c चूहों को तीन समूहों (n = 10 चूहों/समूह) में विभाजित करें: (ए) सामान्य नियंत्रण समूह; (बी) कैथेटर समूह (कैथेटर के बिना प्रत्यारोपित सी. albicans); (सी) मॉडल समूह ( कैथेटर के साथ प्रत्यारोपित सी।
  3. 1-4% isoflurane के साथ चूहों Anesthetize और एक प्रवण स्थिति में एक ऑपरेटिंग टेबल पर चूहों जगह. सही पलटा का नुकसान और पैर की अंगुली उत्तेजना के लिए कोई प्रतिक्रिया सफल संज्ञाहरण की पुष्टि करता है। बालों को निकालें और शल्य साइट को आयोडोफोर या क्लोरहेक्सिडिन और अल्कोहल स्क्रब के तीन वैकल्पिक दौर के साथ बाँझ करें।
  4. चूहों को बिना किसी उपचार के सामान्य नियंत्रण समूह में छोड़ दें और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान करें।
  5. कैथेटर और मॉडल समूहों में चूहों के लिए, 3% isoflurane पर संज्ञाहरण बनाए रखने. पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति से पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई की पुष्टि करें और आवश्यकतानुसार आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को समायोजित करें।
  6. कैथेटर समूह में चूहों के लिए, intradermally एक छेद बनाने के लिए वापस depilated क्षेत्र में एक 1 एमएल बाँझ सिरिंज सुई डालें. सिरिंज सुई को हटाने के बाद छेद में एक कैथेटर (लंबाई में लगभग 1 सेमी) डालें।
  7. मॉडल समूह में चूहों के लिए, त्वचा पर कॉमेंसल सी अल्बिकन्स अनुकरण करने के लिए बैक-डिपिलेशन क्षेत्र पर सी. अल्बिकन्स निलंबन के 20 माइक्रोन के पिपेट 20 माइक्रोन।
  8. समाधान त्वचा द्वारा अवशोषित हो जाता है के बाद, चरण 2.5 में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रियाओं के साथ वापस depilated क्षेत्र में एक कैथेटर डालें.
  9. पिपेट बाहरी वातावरण में सी. अल्बिकन्स अनुकरण करने के लिए ऊतक के लिए कैथेटर के साथ निलंबन के एक और 20 माइक्रोन।
  10. टेप और धुंध के साथ कैथेटर को ठीक करें और चूहों को खिलाने के लिए पिंजरों में लौटाएं। उपचार के अंत में, लगातार तीन दिनों के लिए एनाल्जेसिया के रूप में मेलॉक्सिकैम (4 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
    नोट: सर्जरी के बाद, चूहों को सावधानीपूर्वक पानी और भोजन के साथ खिलाया गया था। चूहों की दिन में दो बार निगरानी की गई। चूहे को IACUC- अनुमोदित विधि द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी यदि उन्हें खिलाने में कठिनाइयों, महत्वपूर्ण वजन घटाने (10-20%), और हाइपोथर्मिया का अनुभव हुआ।

3. सीआरआई मॉडल का मूल्यांकन

  1. 3 दिनों के बाद, 3% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा उन्हें बलिदान करें। चूहों के पीछे से कैथेटर और त्वचा के ऊतकों के नमूने ले लीजिए.
  2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा कैथेटर पर सी. albicans और biofilms का निरीक्षण.
    1. कैथेटर को 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5% ग्लूटार्डाल्डिहाइड समाधान में विसर्जित करें। बाँझ पीबीएस के साथ कैथेटर तीन बार कुल्ला.
    2. 3 घंटे के लिए 1% osmic एसिड के साथ कैथेटर फिक्स और बाँझ पीबीएस के साथ उन्हें तीन बार कुल्ला.
    3. आरोही सांद्रता (50%, 70%, 80%, 90%, और 100%, 15 मिनट / ढाल) के साथ ढाल इथेनॉल समाधान में कैथेटर पर कोशिकाओं निर्जलीकरण.
    4. टर्ट-ब्यूटाइल अल्कोहल में कैथेटर को तीन बार (हर बार 30 मिनट) विसर्जित करें।
    5. तरल नाइट्रोजन में कैथेटर को जल्दी से फ्रीज करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्रीज-ड्रायर में नमूने को फ्रीज-ड्राई करें।
    6. स्पटर-कोट एक आयन बीम बयान द्वारा एक 10 एनएम सोने के साथ कैथेटर नमूने.
    7. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (उच्च निर्वात, 1.5 केवी शर्तों के तहत) के तहत प्रत्येक समूह की कैथेटर सतह पर सी. एल्बिकन्स और इसकी बायोफिल्म की उपस्थिति का निरीक्षण करें और प्रत्येक समूह में छवियों को रिकॉर्ड करें।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कैथेटर पर सी albicans का निरीक्षण.
    1. 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में कैथेटर को विसर्जित करें।
    2. 484 एनएम उत्तेजना के तहत एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा प्रत्येक समूह की कैथेटर सतह पर सी अल्बिकन्स और इसकी बायोफिल्म की उपस्थिति का निरीक्षण करें और प्रत्येक समूह में छवियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: आवर्धन 400x है। कैंडिडा अल्बिकन्स की प्रतिदीप्ति को 490 एनएम पर उत्तेजना और 510 एनएम पर उत्सर्जन के साथ देखा जा सकता है।
  4. माउस त्वचा में रहने वाले सी अल्बिकन्स का निरीक्षण करें।
    1. 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मलाडेहाइड समाधान में चूहों की पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों को विसर्जित करें।
    2. आरोही सांद्रता (50%, 70%, 80%, 90%, और 100%, 15 मिनट / ढाल) के साथ एक ढाल इथेनॉल समाधान में पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों निर्जलीकरण).
    3. 55-60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन में निर्जलित पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों को एम्बेड करें। भंगुर ऊतकों से बचने के लिए तापमान पर ध्यान दें। संभव के रूप में कई अशुद्धियों को दूर करने के लिए, इस कदम को तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) दोहराएँ.
    4. पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों (मोटाई = 5 माइक्रोन) को माइक्रोटोम के साथ अनुभागित करें।
    5. 20 मिनट के लिए दो बार xylene में स्लाइड विसर्जित करके पैराफिन वर्गों Dewax.
    6. हर बार 5 मिनट के लिए ढाल इथेनॉल (पूर्ण इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, पानी) के साथ eluting के माध्यम से वर्गों को पुनर्जलीकरण.
    7. एक बार बहते पानी से धोने से पहले 15 मिनट के लिए आवधिक एसिड समाधान में अनुभाग को विसर्जित करके आवधिक एसिड के साथ वर्गों को दाग दें और आसुत जल को दो बार आसुत करें।
    8. अंधेरे में 30 मिनट के लिए शेवरॉन धुंधला समाधान (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के साथ वर्गों को दाग दें और 5 मिनट के लिए बहते पानी के नीचे वर्गों को कुल्ला।
    9. क्रमशः बहते पानी (2-3 मिनट), विभेदित समाधान (5-10 मिनट), और बहते पानी से धोने से पहले 3-5 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन समाधान में वर्गों को विसर्जित करें।
    10. तटस्थ गम के साथ अनुभाग को सील करने से पहले इथेनॉल में तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) और ज़ाइलीन दो बार (5 मिनट प्रत्येक) में वर्गों को विसर्जित करें।
    11. एक खुर्दबीन के साथ नमूना की छवियों का निरीक्षण करें और माउस त्वचा में सी albicans अवशेषों का विश्लेषण.
      नोट: आवर्धन ऐपिस के लिए 10x और उद्देश्य लेंस के लिए 4x या 10x है।
  5. पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों में हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का निरीक्षण करें।
    1. पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों को 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में विसर्जित करें। आरोही सांद्रता (50%, 70%, 80%, 90%, और 100%, 15 मिनट / ढाल) के साथ ढाल इथेनॉल समाधान में पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों को निर्जलित करें।
    2. पैराफिन में निर्जलित पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों एम्बेड के रूप में चरण 3.4.3 में वर्णित है.
    3. पृष्ठीय त्वचा के ऊतकों (मोटाई = 5 मिमी) को माइक्रोटोम से खंडित करें।
    4. 20 मिनट के लिए दो बार xylene में स्लाइड विसर्जित करके पैराफिन वर्गों Dewax.
    5. हर बार 5 मिनट के लिए ढाल इथेनॉल (पूर्ण इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, पानी) के साथ eluting के माध्यम से वर्गों को पुनर्जलीकरण.
    6. फ्लोट रंग को हटाने के लिए नल के पानी के साथ rinsing से पहले 4 मिनट के लिए hematoxylin के साथ वर्गों दाग.
    7. बहते पानी के साथ स्लाइड rinsing से पहले 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड-इथेनॉल समाधान के साथ नमूना भेद.
    8. 5 मिनट के लिए 85% और 95% इथेनॉल में नमूना विसर्जित करें, और उन्हें 3 मिन के लिए ईोसिन समाधान के साथ दाग दें।
    9. उन्हें ढाल इथेनॉल (70%, 90%, 95%, और 100%) और 2 मिनट प्रत्येक के लिए xylene में विसर्जित करके नमूना निर्जलीकरण.
    10. तटस्थ राल के साथ नमूना सील करें।
    11. एक खुर्दबीन के साथ नमूने की छवियों का निरीक्षण करें और रोग परिवर्तनों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

कैथेटर पर सी. अल्बिकन्स और बायोफिल्म एसईएम द्वारा देखे जा सकते हैं। जैसा कि चित्रा 322 में दिखाया गया है, कैथेटर समूह में पॉलीथीन कैथेटर की सतह चिकनी थी, और कोई पालन रोगजनक सूक्ष्मजीव नहीं देखा गया था। हालांकि, मॉडल समूह में पॉलीथीन कैथेटर की सतह पर परिपक्व और घने सी. एल्बिकन्स बायोफिल्म दिखाई दे रहे थे, यह दर्शाता है कि सी. एल्बिकन्स प्रयोगात्मक परिस्थितियों में चूहों में कैथेटर सतह पर सफलतापूर्वक उपनिवेश बना सकते हैं और बायोफिल्म बना सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परिणामों ने उपरोक्त निष्कर्षों(चित्रा 4)22को और सत्यापित किया। कैथेटर समूह में पॉलीथीन कैथेटर की सतह पर कोई स्पष्ट प्रतिदीप्ति नहीं थी। हालांकि, पक्षपाती सी द्वारा उत्सर्जित मजबूत प्रतिदीप्ति albicans कोशिकाओं मॉडल समूह में कैथेटर सतह पर दिखाई दे रहा था. इससे संकेत मिलता है कि बड़ी संख्या में सी. अल्बिकन्स कोशिकाएं कैथेटर की सतह का पालन करती हैं, जिसने चूहों में सी. अल्बिकन्स बायोफिल्म से संबंधित सीआरआई मॉडल के सफल निर्माण का प्रदर्शन किया।

माउस त्वचा के ऊतकों के संक्रमण को अधिक सहजता से सत्यापित करने के लिए, शेफ पीरियडेट धुंधला विश्लेषण किया गया था। यह कवक कोशिकाओं के कार्बोहाइड्रेट का पता लगाता है, जो आमतौर पर नैदानिक अनुसंधान (चित्रा 5)22में उपयोग किया जाता है। सामान्य नियंत्रण और कैथेटर समूह में त्वचा के ऊतकों को आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) द्वारा नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था, जिसने ऊतकों में सी अल्बिकन्स कोशिकाओं की अनुपस्थिति का संकेत दिया था। मॉडल समूह में सकारात्मक पीएएस-दाग वाले सी अल्बिकन्स कोशिकाओं की एक छोटी संख्या देखी गई, जो आगे सी. अल्बिकन्स से संबंधित आक्रमण और आसंजन के सफल सिमुलेशन को मान्य करती है।

इसके बाद, सी अल्बिकन्स द्वारा प्रेरित चूहों की त्वचा के ऊतकों में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का मूल्यांकन हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा किया गया था। जैसा कि चित्रा 622 में दिखाया गया है, एपिडर्मिस परत को काफी मोटा किया गया था और मॉडल समूह में त्वचा के अंदरूनी हिस्से तक बढ़ाया गया था। सूजन घुसपैठ भी दिखाई दे रही थी, यह दर्शाता है कि सी अल्बिकन्स के संक्रमण ने माउस त्वचा के ऊतकों में स्पष्ट रोग परिवर्तन किए। एपिडर्मिस परत, डर्मिस परत, वसामय ग्रंथियां, बालों के रोम और अन्य संरचनाएं कैथेटर समूह में स्पष्ट और पूर्ण थीं। सामान्य नियंत्रण समूह के समान कोई एडिमा और सूजन घुसपैठ नहीं देखी गई। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि अकेले कैथेटर डालने त्वचा के ऊतकों में स्पष्ट परिवर्तन का कारण नहीं था. मॉडल समूह के ऊतकों में पैथोलॉजिकल परिवर्तन सी. अल्बिकन्स के कारण होने वाले संक्रमण के परिणामस्वरूप हुए। सारांश में, परिणाम सी. अल्बिकन्स बायोफिल्म से जुड़े सीआरआई माउस मॉडल की सफल स्थापना को मान्य करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: pCaExp प्लाज्मिड एटलस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध C.albicans जुड़े सीआरआई चूहों मॉडल की प्रक्रिया दिखा रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्येक समूह में कैथेटर की सतह पर एसईएम। (ए) कैथेटर समूह; (बी) मॉडल समूह (1000x, स्केल बार = 50 माइक्रोन; 5000x, स्केल बार = 10 माइक्रोन)। यह आंकड़ा मो एट अल.22 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्येक समूह में कैथेटर सतह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। (ए) कैथेटर समूह; (बी) मॉडल समूह (स्केल बार = 100 माइक्रोन)। यह आंकड़ा मो एट अल.22 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रत्येक समूह में चूहों की पीठ की त्वचा का एच एंड ई धुंधला हो जाना। (ए) कैथेटर समूह; (बी) मॉडल समूह; (सी) नियंत्रण समूह, (40x, स्केल बार = 400 माइक्रोन; 100x, स्केल बार = 200 माइक्रोन)। यह आंकड़ा मो एट अल.22 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रत्येक समूह में चूहों की पीठ की त्वचा का पीएएस धुंधला हो जाना। (ए) कैथेटर समूह; (बी) मॉडल समूह; (सी) नियंत्रण समूह, (40x, स्केल बार = 400 माइक्रोन; 100x, स्केल बार = 200 माइक्रोन)। त्वचा के अंदरूनी हिस्से में एपिडर्मिस परत का महत्वपूर्ण मोटा होना और विस्तार मॉडल समूह (लाल आयतों) में देखा जा सकता है। यह आंकड़ा मो एट अल.22 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीआरआई नैदानिक अभ्यास23 में सबसे आम nosocomial संक्रमण में से एक है. त्वचा उपांगों में रोगजनकों, जैसे एपिडर्मिस, वसामय ग्रंथियां, और बालों के रोम, सीआरआई23,24 के सभी संभावित कारण हैं। कैंडिडा तीसरा सबसे बड़ा रोगज़नक़ है जो सीआरआई का कारण बनता है, जिसमें कैंडिडा अल्बिकन्स बायोफिल्म संक्रमण25,26 का सबसे आम प्रकार था। इसलिए, हमने कैंडिडा अल्बिकन्स बायोफिल्म से संबंधित सीआरआई के एक प्रासंगिक पशु मॉडल का निर्माण करने का लक्ष्य रखा ताकि संबंधित सीआरआई के उपचार और रोकथाम का समर्थन किया जा सके।

सीआरआई मॉडल का निर्माण करने के लिए, चूहों की पृष्ठीय त्वचा में सी. एल्बिकन्स की एक छोटी मात्रा को जोड़ा गया था, जो नैदानिक स्थिति का अनुकरण करता है जिसमें सी. अल्बिकन्स का हिस्सा नियमित नसबंदी द्वारा त्वचा के गहरे ऊतकों और उपांगों में पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है। कैथेटर के आरोपण के बाद, सी. albicans की उपस्थिति की नकल करने के लिए फिर से inoculated किया गया था सी. सर्जरी के दौरान बाहरी वातावरण में albicans.

इस अध्ययन में, मॉडल निर्माण के लिए एक 3-दिवसीय समय बिंदु का चयन किया गया था, जो बायोफिल्म गठन में कठिनाई के कारण पारंपरिक सी अल्बिकन्स बायोफिल्म से संबंधित पशु मॉडल18,27 की तुलना में कम है। संक्रमण के बाद, सी. अल्बिकन्स आसंजन और बायोफिल्म गठन इस मॉडल में कैथेटर सतह पर दिखाई दे रहे थे, जो एसईएम और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परिणामों (चित्रा 3 और चित्रा 4) द्वारा साबित हुआ था। यह सी की एकाग्रता के कारण हो सकता है इस अध्ययन में अल्बिकन्स 1 × 108 सीएफयू / एमएल, जो अन्य पशु मॉडल18,27 की तुलना में बहुत अधिक था. इसके अलावा, कैथेटर के आसपास की त्वचा बाहरी वातावरण के लगातार संपर्क में रहती है। सीआरआई का सामना करने वाले चरम वातावरण का अनुकरण करने के लिए, सर्जरी के बाद सी. अल्बिकन्स को फिर से टीका लगाया गया।

संक्रमण की पुनरावृत्ति अक्सर रोगजनकों के कारण होती है जो आसपास के ऊतकों23,28,29में रहते हैं। इसलिए, सीआरआई के लिए ऊतकों में रोगजनकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति महत्वपूर्ण है। इस पत्र में, पीएएस धुंधला त्वचा के ऊतकों में सी अल्बिकन्स के अवशेषों की जांच करने के लिए किया गया था। इस पद्धति का उपयोग सीआरआई के लिए नई चिकित्सीय दवाओं या विधियों के निकासी प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है।

अंत में, ईजीएफपी के साथ एक कैंडिडा अल्बिकन्स तनाव का उपयोग कैथेटर पर कैंडिडा अल्बिकन्स उपनिवेशण के सहज अवलोकन की सुविधा के लिए एक माउस सीआरआई मॉडल बनाने के लिए किया गया था। इस तनाव का उपयोग कैंडिडा अल्बिकन्स और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, मेजबान के लिए कैंडिडा अल्बिकन्स का आक्रमण और आसंजन, चिकित्सीय के एंटी-कैंडिडा अल्बिकन्स प्रभाव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। इसके अलावा, बाहरी वातावरण और शरीर से प्राप्त रोगजनकों को अनुकरण करने के लिए दो-चरणीय टीकाकरण विधि का उपयोग किया गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि संक्रमण के बाद बाद माइक्रोबियल संस्कृति का आयोजन नहीं किया गया था। बायोफिल्म की उपस्थिति संस्कृतियों30,31,32 की कम संवेदनशीलता में एक महत्वपूर्ण कारक है. पिछली रिपोर्टों से पता चलता है कि संक्रमण के बाद माइक्रोबियल संस्कृति में कम संवेदनशीलता, विशिष्टता और सटीकता30,31,32,33,34 थी। इसके बजाय, प्रत्यारोपण पर बायोफिल्म की उपस्थिति एक अधिक विश्वसनीय सूचकांक है। इसलिए, एसईएम और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इस अध्ययन में बायोफिल्म बनाने वाले कैंडिडा अल्बिकन्स की कल्पना और पहचान करने के लिए किया गया था।

हालांकि, इस मॉडल ने रोगी की कमजोर प्रतिरक्षा और क्लीनिकों में देखे गए कैंडिडा अल्बिकन्स संक्रमण के बीच बातचीत का अनुकरण नहीं किया। यदि मॉडल इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड उपचार (जैसे ग्लूकोकार्टोइकोड्स के निरंतर इंजेक्शन)35 पर विचार कर सकता है, तो कैंडिडा अल्बिकन्स टीकाकरण से पहले, नैदानिक स्थितियों में होने वाले संक्रमणों को बेहतर ढंग से अनुकरण करना संभव होगा।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पत्र में रिपोर्ट किए गए कार्यों को प्रभावित करने के लिए प्रकट हो सकते थे।

Acknowledgments

हम शानक्सी प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2021SF-118) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 81973409, 82204631) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 Mactutrius turbidibris Shanghai Lujing Technology Co., Ltd 5106063
2.5% glutaraldehyde fixative solution Xingzhi Biotechnology Co., Ltd DF015
4 °C refrigerator Electrolux (China) Electric Co., Ltd ESE6539TA
Agar Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd 01-023
Analytical balances Shimadzu ATX124
Autoclaves Sterilizer SANYO MLS-3750
Butanol Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd 200-889-7
Carbenicillin Amresco C0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope  Nikon Eclipse Ts2-FL
Glucose Macklin  D823520
Inoculation ring Thermo Scientific 251586
Isoflurane RWD 20210103
Paraformaldehyde Beyotime Biotechnology P0099
PAS dye kit Servicebio G1285
Peptone Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd 01-001
Polyethylene catheter Shining Plastic Mall PE100
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine  RWD R550
SEM Hitachi TM-1000
Temperature incubator Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd ZQTY-50N
Ultrapure water water generator Heal Force NW20VF
Ultrasound machine Do-Chrom DS10260D
Xylene Sinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd 10023428
Yeast extract Thermo Scientific Oxoid LP0021B

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 205
माउस में एक कैथेटर से संबंधित <em>कैंडिडा अल्बिकन्स</em> संक्रमण मॉडल
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Yang, C., Mo, F., Zhang, J., Zhang,… More

Yang, C., Mo, F., Zhang, J., Zhang, P., Li, Q., Zhang, J. A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse. J. Vis. Exp. (205), e65307, doi:10.3791/65307 (2024).

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