Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Abstract

Gemanipuleerde celtherapieën die gebruik maken van chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen hebben een opmerkelijke effectiviteit bereikt bij personen met hematologische maligniteiten en worden momenteel ontwikkeld voor de behandeling van diverse solide tumoren. Tot nu toe heeft de voorlopige evaluatie van nieuwe CAR-T-celproducten voornamelijk plaatsgevonden in xenotransplantaattumormodellen met behulp van immunodeficiënte muizen. Deze aanpak is gekozen om de succesvolle implantatie van menselijke CAR-T-cellen in de experimentele setting te vergemakkelijken. Syngene muismodellen, waarin tumoren en CAR-T-cellen zijn afgeleid van dezelfde muizenstam, maken het echter mogelijk om nieuwe CAR-technologieën te evalueren in de context van een functioneel immuunsysteem en een uitgebreide tumormicro-omgeving (TME). Het hier beschreven protocol heeft tot doel het proces van het genereren van CAR-T-cellen in muizen te stroomlijnen door gestandaardiseerde methoden voor retrovirale transductie en ex vivo T-celkweek te presenteren. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden toegepast op andere CAR-constructies dan die welke in deze studie zijn gebruikt om routinematige evaluatie van nieuwe CAR-technologieën in immuuncompetente systemen mogelijk te maken.

Introduction

Adoptieve T-celtherapieën die chimere antigeenreceptoren (CAR's) tot expressie brengen, hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van kankerimmunotherapie door gebruik te maken van de kracht van het adaptieve immuunsysteem om specifiek antigeen-positieve kankercellen aan te pakken en te elimineren1. Hoewel het succes van CAR-T-celtherapieën gericht op B-celmaligniteiten klinisch is gevalideerd, blijven preklinische studies uitgevoerd in diermodellen van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe CAR's gericht op solide tumoren. Tot nu toe is echter een beperkte klinische werkzaamheid aangetoond bij solide tumorindicaties, en het wordt steeds duidelijker dat individuele preklinische modellen de farmacodynamiek en klinische werkzaamheid van een levend geneesmiddel niet nauwkeurig voorspellen 2,3. Daarom zijn onderzoekers begonnen met het uitbreiden van de preklinische studie van CAR-T-celproducten met parallelle beoordelingen in xenotransplantaat- en syngene modellen van respectievelijk menselijke en muizenkankers.

In tegenstelling tot xenotransplantaatmodellen, waarbij menselijke tumoren en T-cellen worden geënt in immunodeficiënte muizen, maken syngene modellen het mogelijk om CAR-T-celresponsen te onderzoeken in de context van een functioneel immuunsysteem. In het bijzonder bieden immuuncompetente muizen met syngene tumoren een systeem om de interactie tussen adoptief overgebrachte T-cellen en contextspecifieke milieus te bestuderen - waaronder tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's) en regulerende T-cellen (Tregs) waarvan bekend is dat ze de T-celfunctie in de tumormicro-omgeving (TME) onderdrukken4,5,6. Bovendien bieden syngene modellen een extra platform om on-target, off-tumor toxiciteit en CAR-T-celinteractie met gastheerfactoren te beoordelen die kunnen leiden tot extra toxiciteiten, waaronder cytokine release syndrome7.

Ondanks deze voordelen blijft het aantal syngene CAR-T-celstudies beperkt. Syngene modellen vereisen met name autologe engineering van CAR-T-cellen van dezelfde muizenstam en vormen dus een extra uitdaging vanwege het gebrek aan methodologie voor efficiënte muizen-T-celtransductie en ex vivo-expansie 2,8. Dit protocol schetst de methoden om stabiele CAR-expressie te bereiken door de productie van retrovirale vectoren en geoptimaliseerde T-celtransductie. Een schema van het gehele proces is weergegeven in figuur 1. Het gebruik van deze aanpak toont een efficiënte retrovirale transductie van muizen CAR-T-cellen en het bereiken van een hoge CAR-expressie zonder de noodzaak van virale concentratie door middel van ultracentrifugatie. Strategieën om de antigeenspecificiteit van het CAR-construct te veranderen worden besproken naast de co-expressie van bijkomende transgenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocollen AC-AABQ5551 en AC-AAAZ4470) met 6-8 weken oude vrouwelijke BALB/c of CF57BL/6 muizen met een gewicht tussen 20-25 g. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Dit protocol is gestructureerd rond de 'dagen na activering' van muizen-T-cellen en de virale productie begint op dag -2. Retrovirus kan na de eerste productie bij -80 °C worden bewaard, en voor toekomstig gebruik van dit protocol kan men beginnen met stap 2, T-celisolatie en activering op dag 0.

1. Retrovirale vectorproductie

OPMERKING: De virale producten zijn replicatie-defect gemaakt door de verpakkingsgenen te scheiden in twee afzonderlijke plasmiden (zie Materiaaltabel), waardoor de kans op recombinatiegebeurtenissen en onbedoelde productie van replicatiecompetent virus aanzienlijk wordt verminderd.

  1. Bereid Phoenix Eco-cellen een dag voor de transfectie voor (procedure op dag -2).
    1. Plaats ongeveer 1 x 107 cellen in een met TC behandelde plaat van 15 cm of een T150-kweekkolf met 30 ml kweekmedium (Phoenix Eco-kweekmedium, zoals beschreven in tabel 1).
    2. Incubeer een nacht bij 37 °C. Na 18-24 uur moeten de cellen voor ongeveer 70% samenvloeiend en gelijkmatig verdeeld zijn om een hoge virale opbrengst zonder overgroei te garanderen.
      OPMERKING: Gebruik voor optimale resultaten cellen met een lage doorgang en passeer ze de dag voor het plateren voor virale productie. Laat Phoenix Eco-cellen niet overgroeien tijdens de routinekweek.
  2. Bereid de transfectiemix met de lipofectie- en enhancer-reagentia, pCL-Eco (Gag/Pol) en pMSCV-expressieplasmide (pMSCV_PGK_mGFP28z) in gereduceerde serummedia (zie materiaaltabel) (procedure op dag -1).
    OPMERKING: Co-transfectie moet worden uitgevoerd in een verhouding van 1:1 van pMSCV en pCL-Eco.
    1. Tube A voorbereiden: Verdun 105 μl van het transfectiereagens in 3,75 ml gereduceerd serummedium per plaat van 15 cm en meng grondig door op en neer te vortexen of pipetteren.
    2. Bereid buis B voor: Verdun pMSCV-expressieplasmide (21 μg) en pCL-Eco (21 μg) met 90 μL enhancer-reagens tot 3,75 ml gereduceerd serummedium per plaat van 15 cm. Meng goed door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Als u meerdere virale producten genereert, maak dan een mastermix met pCL-Eco en het enhancer-reagens.
    3. Voeg buis A toe aan buis B en meng grondig door te pipetteren. Incubeer gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur, wat resulteert in een totaal volume van ongeveer 7,5 ml.
    4. Verwijder voorzichtig 10 ml celkweekmedia van de Phoenix Eco-plaat(en) en voeg het volledige volume van het transfectiemengsel toe aan de resterende media door de plaat te kantelen en druppelsgewijs te pipetteren. Breng de cellen terug naar een incubator van 37 °C.
  3. Vervang de media op getransfecteerde Phoenix Eco-cellen 16-20 uur na transfectie (procedure op dag 0).
    1. Serum en β-mercaptoethanol (2-ME, zie materiaaltabel)-vrij muizen-T-celmedium (mTCM-virale oogst, zoals vermeld in tabel 1) voorverwarmen tot 37 °C met behulp van een water- of parelbad.
    2. Verwijder het Phoenix Eco-kweekmedium voorzichtig door de plaat te kantelen en de pipetpunt in de onderste hoek te plaatsen, indien mogelijk met behulp van een vacuüm. Vermijd het te droog uitdrogen van de cellen.
    3. Voeg het opgewarmde mTCM-virale oogstmedium voorzichtig toe aan de zijkant van de gekantelde plaat door 30 ml op de langzaamste stand te pipetteren. Breng de cellen terug naar een incubator van 37 °C.
      OPMERKING: Deze stap kan ervoor zorgen dat Phoenix Eco-cellen loskomen van de plaat en virale titers verminderen. Voorverwarmde media en voorzichtig pipetteren zorgen voor een minimum aan verstoringen.
  4. Oogst het virale supernatans 48 uur na transfectie (procedure op dag 1).
    1. Oogst het virale supernatans en filtreer het door PVDF-filters van 0,45 μm (zie Materiaaltabel) om cellen en vuil te verwijderen. Aliquot en vries het virus in bij -80 °C of ga direct verder met dag 1 van stap 3 als u een nieuw virus gebruikt.
    2. Bepaal de virale titer (transducerende eenheden/ml) door middel van flowcytometrie, zoals eerder beschreven9. Deze stap is optioneel.
      1. Bepaal de virale titer door kleinschalige transductie van 1 x 105 geactiveerde muizen-T-cellen in niet-weefselkweek (TC) behandelde platen met 96 putjes, vooraf gecoat met retronectine (zie materiaaltabel) en geladen met drievoudige seriële verdunningen van retroviraal supernatans in een eindvolume van 100 μL mTCM-viraal oogstmedium.
        OPMERKING: Zie stap 2 en stap 3 hieronder voor gedetailleerde instructies over T-celisolatie, activering en transductie.
      2. Bepaal de expressie van het CAR-oppervlak 4-5 dagen na transductie door middel van flowcytometrie.
      3. Bereken de virale titer volgens de formule10: (N x F x D)/V, waarbij N het aantal getransduceerde cellen is, F de frequentie van CAR-positieve cellen, D de verdunningsfactor en V het transductievolume in ml om transducerende eenheden (TU)/ml te verkrijgen.
        OPMERKING: De virale titer kan afnemen bij bevriezing/dooi; Daarom wordt de virale titer idealiter bepaald op bevroren en vervolgens ontdooid virus.

2. Muizen T-cel isolatie

  1. Isoleer en activeer T-cellen van muizen (procedure op dag 0).
    NOTITIE: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) of 4 °C en moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving.
    1. Oogst de milt(en) van de betreffende muizenstam (bijv. Balb/c, C57BL/6) zoals eerder beschreven11 en verkrijg een eencellige suspensie door mechanische dissociatie.
    2. Plet met behulp van de achterkant van een steriele spuit de milt(en) door een celzeef van 70-100 μm in een conische buis van 50 ml.
    3. Nadat u de spuit opzij hebt gelegd, wast u de zeef met 5 ml T-celisolatiebuffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS, aangevuld met 2% foetaal runderserum, FBS).
    4. Herhaal de maischstap en was de zeef nog een keer met 5 ml T-celisolatiebuffer. Breng het uiteindelijke volume naar 50 ml met T-celisolatiebuffer.
    5. Tel levende cellen met behulp van een handmatige hemocytometer of een automatische celteller door te verdunnen in een verhouding van 1:20 en vervolgens te mengen met trypanblauw.
    6. Pelleteer de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 450 x g, bij 4 °C (of RT) en suspendeer de miltocyten opnieuw bij 1 x 108/ml bij gebruik van de aanbevolen T-celisolatiekit (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Miltocyten kunnen in dit stadium opnieuw worden gezeefd door een zeef van 40-70 μm om klonten te verwijderen.
  2. Isoleer CD3+ T-cellen door negatieve selectie volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen). Breng het isolaat na magnetische scheiding over in een conische buis van 15 ml en voer een laatste aantal levende cellen uit.
  3. Pelleteer de geïsoleerde T-cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 450 x g, bij 4 °C (of RT), en suspendeer ze opnieuw bij 1 x 106/ml in mTCM-activeringsmedium (tabel 1).
  4. Activeer T-cellen door muizen anti-CD3/anti-CD28 monoklonale antilichaam-gecoate magnetische kralen toe te voegen (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 25 μL/1 x 106 T-cellen en 100 E/ml IL-2.
  5. Plaats de cellen in een incubator bij 37 °C en laat ze een nacht staan.
    OPMERKING: Vanwege de kleine omvang van T-cellen kan een nauwkeuriger aantal levende T-cellen worden bereikt door te verdunnen in een verhouding van 1:10-1:20 en te mengen met 1:1 met trypanblauw voor handmatig tellen met behulp van een hemocytometer. Zuiverheid kan worden bepaald door middel van flowcytometrie door cellen te kleuren met een fluorescerend geconjugeerd αCD3-antilichaam. Elke milt levert tussen de 7-10 x 106 T-cellen op, afhankelijk van de leeftijd en de belasting van de muis.

3. Muizen T-cel transductie

  1. Bereid platen voor op transductie (procedure op dag 0).
    1. Smeer niet-behandelde steriele platen met 24 putjes voor met 0,5 ml humaan fibronectinetransductieversterkend reagens (zie materiaaltabel) in een eindconcentratie van 20-40 μg/ml door het te verdunnen in steriel PBS en bewaar het een nacht bij 4 °C.
      OPMERKING: Deze stap kan ook op dag 1 worden uitgevoerd door onbehandelde platen met 24 putjes te coaten met het transductiereagens en deze gedurende 2 uur bij kamertemperatuur te incuberen.
  2. Voer T-celtransductie uit (procedure op dag 1).
    1. Bereid de voorgecoate plaat voor op transductie. Verwijder het transductiereagens uit elk putje van de voorgecoate plaat met 24 putjes en blokkeer met een equivalent volume steriel gefilterd PBS + 2% runderserumalbumine (BSA) (0,5 ml) gedurende 30 minuten bij RT.
    2. Eenmaal wassen met 0,5-1 ml PBS.
  3. Voeg 0,5-1 ml zuiver retrovirus uit stap 1 of verdund op basis van virale titer toe aan elk vooraf gecoat putje en centrifugeer gedurende 90 minuten bij 2.000 x g en 32 °C.
  4. Voeg 1 ml geactiveerde T-cellen toe aan elk viraal geladen putje en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 450 x g en 32 °C. Breng de cellen 's nachts terug naar een incubator van 37 °C.
  5. Verwijder 24 uur na de transductie 1-1,5 ml celkweekmedia en vervang deze door 1-1,5 ml mTCM-complete en 10 ng/ml recombinant humaan IL-7 en IL-15 (zie materiaaltabel). Breng de cellen terug naar een incubator van 37 °C (procedure op dag 2).
    OPMERKING: Tijdens ex vivo kweek moet elke 48 uur 10 ng/ml cytokines aan de kweek worden toegevoegd en mogen T-cellen niet verder worden verdund dan 1 x 106/ml.
  6. Breng 48 uur na de transductie de cellen van de transductieplaat over naar een nieuwe plaat met 24 of 6 putjes en breng de cellen terug naar een incubator van 37 °C (procedure op dag 3).
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van T-cellen kan verbeteren door cellen 24 uur tot 2 dagen na de transductie over te dragen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van de T-cel en de virale titer.
  7. Verwijder de parel van de T-cellen en bevestig de CAR-expressie (procedure op dag 5-6).
    1. Cellen grondig opnieuw suspenderen om geactiveerde T-cellen te dissociëren van de αCD3/CD28-gecoate kralen (zie Materiaaltabel) en plaats de celsuspensie gedurende 30 s op een magneet. Breng de celsuspensie over in het gewenste ex vivo kweekvat en breng het terug naar een incubator van 37 °C.
      OPMERKING: T-cellen kunnen worden gekweekt in kweekkolven of deepwell-kweekplaten. Het wordt aanbevolen om minimaal 5 x 106 T-cellen in 30 ml mTCM-compleet medium per putje te platen in een diepe put met een plaat van 6-wellsformaat (zie Materiaaltabel).
    2. Bepaal de CAR-expressie door middel van flowcytometrie8.
      OPMERKING: GFP-CAR-expressie werd bepaald door incubatie met 100 ng/ml gezuiverd GFP. De integratie van een N-terminale epitooptag zal de detectie van alternatieve CAR-constructen vergemakkelijken.
  8. Voer ex vivo kweek van CAR-T-cellen uit (procedure op dag 7-10).
    1. Onderhoud de cellen tijdens ex vivo kweek door 50% van het kweekmedium te verwijderen en te vervangen door verse mTCM-complete + 2x 10 ng/ml IL-7 en IL-15 om de 48 uur.
      OPMERKING: Muizen CAR-T-cellen zijn 7 dagen na activering klaar voor gebruik in stroomafwaartse toepassingen en mogen niet worden gecryopreserveerd vanwege de slechte levensvatbaarheid na ontdooiing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het hier beschreven protocol heeft tot doel het proces van muizen T-celtransductie voor het genereren van CAR-T-cellen van muizen te standaardiseren. Figuur 1 geeft een gedetailleerde beschrijving van de betrokken stappen. Het proces begint met de productie van retrovirale vectoren via co-transfectie van virale componenten in Phoenix Eco-cellen. Figuur 2 geeft een beeld van de optimale dichtheid van Phoenix Eco-cellen op de dag van transfectie. Geïsoleerde T-cellen worden vervolgens 24 uur na transfectie, of 'Dag 0' van dit protocol, geactiveerd ter voorbereiding op transductie op dag 1. Na transductie worden CAR-T-cellen gekweekt in aanwezigheid van recombinant humaan IL-7 en IL-15 om voldoende vouwexpansie te bereiken met behoud van stamcelgeheugenpopulaties.

Het gebruik van de aanbevolen muizen T-celisolatiekit (zie materiaaltabel) met dit protocol levert T-celzuiverheid op van <98% voorafgaand aan transductie, zoals bepaald door flowcytometrie (Figuur 3A). Bovendien kunnen reproduceerbare CAR-expressiepercentages van 65%-75% worden bereikt met behulp van dit protocol en kan de pMSCV-retrovirale vector worden aangepast om het CAR-construct van een PGK-promotor tot expressie te brengen (Figuur 3B,C). Bepaling van retrovirale titer toont titers tot ~2 x 107 TU/ml en CAR-expressie van 74% met 1/3evan het virale supernatans geoogst na co-transfectie van pMSCV met pCL-Eco (aanvullende figuur 1).

Ten slotte leidt ex vivo-kweek met 10 ng/ml IL-7 en IL-15 tot ongeveer 15-voudige expansie, wat resulteert in ~150 x 106 T-cellen op dag 10 na activering van een enkele milt (Figuur 3D). Kweek met IL-7 en IL-15 leidt tot vergelijkbare CD8+ en CD4+ T-celfrequenties (Figuur 3E) en geconserveerde stamcelgeheugenpopulaties bepaald door CD62L+CD44-expressie na 10 dagen ex vivo kweek (Figuur 3F).

Figure 1
Figuur 1: Overzicht protocollen. Bovenste paneel: Een schematisch overzicht van de tijdlijn van het protocol. Bodempaneel: Stap-voor-stap instructies voor retrovirale vectorproductie en T-celtransductie bij muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Optimale celdichtheid voor transfectie. Brightfield-microscopiebeeld van Phoenix Eco-cellen met de optimale dichtheid vóór transfectie met pMSCV en pCL-Eco. Vastgelegd met een 10x objectieflens. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Productie van CAR-T-cellen bij muizen en ex vivo-kweek. (A) Flowcytometriegrafiek met de frequentie van BALB/c CD3+-cellen na de isolatie van T-cellen bij muizen. (B) Schematische weergave van de pMSCV retrovirale vector die wordt gebruikt voor GFP-CAR-expressie in muizen T-cellen. (C) Histogrammen van flowcytometrie die de expressie van het CAR-oppervlak op T-cellen van muizen aantonen na incubatie met gezuiverd sfGFP. UT, niet getransduceerd. (D) Vouwexpansie van CAR-T-cellen op dag 10 na activering en kweek met recombinant humaan IL-17 en IL-15. Ongeveer 8 x 106 muizen T-cellen werden geactiveerd vóór transductie en bereikten ongeveer 1,28 x 108 op dag 10 na activering. (E) Flowcytometriegrafiek met de frequentie van CD8+ en CD4+ CAR-T-cellen op dag 10 na activering. (F) Flowcytometriegrafiek die de frequentie van CD8+ T-celgeheugenpopulaties aantoont, bepaald door CD62L- en CD44-oppervlakte-expressie. Stamcelgeheugen (TSCM) wordt gekenmerkt door CD62L+CD44-, centraal geheugen (TCM) door CD62L+CD44+ en effectorgeheugen (TEM) door CD62L-CD44+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Formulering van celkweekmedia. De formuleringsdetails voor celkweekmedia die in het protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: CAR-oppervlakte-expressie en retrovirale titers. (A) Flowcytometriehistogrammen die de expressie van het CAR-oppervlak op BALB/c T-cellen tonen na incubatie met gezuiverd sfGFP. Retrovirus werd gegenereerd door Phoenix Eco-cellen te transfecteren met pMSCV_PGK_mGFP28z in combinatie met pCL-Eco en pMD2.G (I), pCL-Eco (II) of alleen (III). T-cellen werden getransduceerd met verdund retrovirus zoals aangegeven. (B) Retrovirale titers bepaald door CAR-oppervlakte-expressie van getransduceerde T-cellen. Transducerende eenheden (TU)/ml werden berekend met behulp van de formule: (N∙F∙D)/V, waarbij N het aantal getransduceerde cellen is (1 x 105), F de frequentie van CAR+ -cellen, D de verdunningsfactor en V het transductievolume in ml (0,2 ml). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: pMSCV-expressievectorsequentie. De sequentie van de GFP28z CAR en flankerende sequenties (cursief) in de pMSCV-expressievector, met NotI- en BamHI-enzymsites blauw gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft de stappen en reagentia die nodig zijn voor de retrovirale transductie van muizen-T-cellen om CAR-T-cellen te genereren voor in vivo studies. Door de retrovirale transductieomstandigheden te optimaliseren, wordt een robuuste CAR-expressie bereikt zonder dat virale concentratie nodig is door middel van ultracentrifugatie of extra reagentia. Er zijn echter meerdere wijzigingen die op deze methodologie kunnen worden toegepast.

Hoewel dit protocol het voorbeeld beschrijft van het genereren van een GFP-specifieke CAR, kunnen deze methoden worden aangepast om CAR-T-cellen van muizen te genereren die gericht zijn op elk extracellulair antigeen dat van belang is. De pMSCV_PGK retrovirale vector die in deze studie wordt gebruikt, maakt de efficiënte afgifte van de GFP-specifieke nanobody-sequentie mogelijk door enzymatische vertering met NotI en BamHI en kan worden vervangen door een door de gebruiker gedefinieerd antigeenherkenningsdomein zoals een scFv-, nanobody- of ligandbindend domein (aanvullend bestand 1). Om de beoordeling van alternatieve CAR-expressie te vergemakkelijken, wordt aanbevolen om CAR's te ontwerpen met een N-terminaal epitooplabel, zoals Myc (EQKLISEEDL) of Flag (DYKDDDDK)-tags, die kunnen worden gedetecteerd met behulp van fluorescerend geconjugeerde antilichamen12. Bovendien toont de huidige studie de productie van een enkel transgen aan; de opname van zelfsplitsende peptiden (2A-sequenties) of interne ribosoomingangsplaatsen (IRES) zou echter de coproductie van meerdere transgenen mogelijk maken, inclusief aanvullende technologieën om de T-celfunctie in vivo te verbeteren 8,13,14.

Hoewel dit protocol is ontwikkeld om de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur te elimineren door ultracentrifugatie (24.000 x g, 2 uur, 4 °C) achterwege te laten, is het vermeldenswaard dat de concentratie van het virale supernatans hogere virale titers kan bereiken en het virusvolume kan verminderen dat nodig is om een hoge CAR-expressie te bereiken8. Dit protocol stroomlijnt bovendien de productie van retrovirale vectoren door reproduceerbaar hoge virale titers (~2 x 107 TU/ml) en stabiele CAR-expressie te bereiken zonder dat de bepaling van de virale titer voorafgaand aan gebruik nodig is. Naast het vergemakkelijken van standaardisatie, kan de bepaling van de virale titer voorafgaand aan T-celtransductie echter ook de levensvatbaarheid van T-cellen verhogen door de potentiële toxiciteit veroorzaakt door onnodig hoge virale concentraties te verminderen10,15.

Suppletie met IL-7 en IL-15 wordt aanbevolen om T-celexpansie te bevorderen en T-celgeheugenpopulaties te behouden; recombinant humaan IL-2 kan echter worden gebruikt als alternatief om het aantal noodzakelijke reagentia voor ex vivo kweek te verminderen 16,17,18,19. Desalniettemin blijven de hier geschetste methoden voor het genereren van CAR-T-cellen beperkt door de relatief slechte expansie van muizen-T-cellen. De hierboven besproken maatregelen om de levensvatbaarheid van T-cellen te verbeteren, kunnen echter verder worden verbeterd door gedurende het hele transductieproces aanvullende supplementen en 2-ME in het mTCM-kweekmedium op te nemen20. Hoewel deze modificaties de T-celexpansie kunnen verbeteren van 15-voudig tot 20-voudig20, kunnen ze resulteren in een lagere transductie-efficiëntie en verminderde CAR-expressie.

Uiteindelijk maakt de productie van muizen CAR-T-cellen de ontwikkeling mogelijk van syngene modellen om de CAR-T-celfunctie binnen een intact immuunsysteem te evalueren - waardoor een contextspecifieke beoordeling van hun potentie, duurzaamheid en veiligheid mogelijk wordt. Terwijl modellen in immunodeficiënte muizen belangrijke preklinische studies mogelijk maken van een menselijk T-celproduct gericht op een menselijk tumorantigeen. De combinatie van deze complementaire modelsystemen zal onmisbaar zijn voor het begrijpen van de complexiteit van CAR-T-celbiologie, het optimaliseren van nieuwe CAR-ontwerpen en uiteindelijk het vertalen van preklinische bevindingen naar effectieve klinische therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenverstrengeling gemeld.

Acknowledgments

Wij danken L. Brockmann voor zijn kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH 1R01EB030352 en UL1 TR001873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 204
Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter