Summary
Denne protokollen strømlinjeformer retroviral vektorproduksjon og murine T-celletransduksjon, noe som letter effektiv generering av musens CAR-T-celler.
Abstract
Konstruerte celleterapier som benytter kimære antigenreseptor (CAR)-T-celler har oppnådd bemerkelsesverdig effektivitet hos personer med hematologiske maligniteter og er for tiden under utvikling for behandling av ulike solide svulster. Så langt har den foreløpige evalueringen av nye CAR-T-celleprodukter hovedsakelig funnet sted i xenografttumormodeller ved bruk av immundefekte mus. Denne tilnærmingen er valgt for å legge til rette for vellykket engraftment av humane CAR-T-celler i eksperimentell setting. Syngene musemodeller, der svulster og CAR-T-celler er avledet fra samme musestamme, tillater imidlertid evaluering av nye CAR-teknologier i sammenheng med et funksjonelt immunsystem og omfattende tumormikromiljø (TME). Protokollen beskrevet her tar sikte på å strømlinjeforme prosessen med mus CAR-T cellegenerering ved å presentere standardiserte metoder for retroviral transduksjon og ex vivo T-cellekultur. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes på andre CAR-konstruksjoner utover de som ble brukt i denne studien for å muliggjøre rutinemessig evaluering av nye CAR-teknologier i immunkompetente systemer.
Introduction
Adoptive T-celleterapier som uttrykker kimære antigenreseptorer (CAR) har revolusjonert feltet kreftimmunterapi ved å utnytte kraften i det adaptive immunsystemet for å spesifikt målrette og eliminere antigen-positive kreftceller: 1. Mens suksessen til CAR-T-celleterapier rettet mot B-cellemaligniteter har blitt klinisk validert, er prekliniske studier utført i dyremodeller fortsatt avgjørende for utviklingen av nye CARer rettet mot solide svulster. Imidlertid har begrenset klinisk effekt blitt vist i solide tumorindikasjoner så langt, og det blir stadig tydeligere at individuelle prekliniske modeller ikke nøyaktig forutsier farmakodynamikken og klinisk effekt av en levende medisin 2,3. Derfor har forskere begynt å utvide den prekliniske studien av CAR-T-celleprodukter til å omfatte parallelle vurderinger i xenograft og syngene modeller av henholdsvis humane og murine kreft.
I motsetning til xenograft-modeller, hvor humane svulster og T-celler er innpodet i immundefekte mus, muliggjør syngene modeller undersøkelse av CAR-T-celleresponser i sammenheng med et funksjonelt immunsystem. Spesielt gir immunkompetente mus som bærer syngene svulster et system for å studere samspillet mellom adoptivt overførte T-celler og kontekstspesifikke miljøer - inkludert tumorassosierte makrofager (TAM) og regulatoriske T-celler (Tregs) kjent for å undertrykke T-cellefunksjon i tumormikromiljøet (TME) 4,5,6. Videre tilbyr syngene modeller en ekstra plattform for å vurdere on-target, off-tumor toksisitet og CAR-T-celleinteraksjon med vertsfaktorer som kan føre til ytterligere toksisitet, inkludert cytokin frigjøringssyndrom7.
Til tross for disse fordelene er antallet syngene CAR-T-cellestudier fortsatt begrenset. Spesielt krever syngene modeller autolog konstruksjon av CAR-T-celler fra samme musestamme og utgjør dermed en ekstra utfordring på grunn av mangelen på metodikk for effektiv murine T-celletransduksjon og ex vivo ekspansjon 2,8. Denne protokollen skisserer metodene for å oppnå stabilt CAR-uttrykk gjennom produksjon av retrovirale vektorer og optimalisert T-celletransduksjon. Et skjema over hele prosessen er vist i figur 1. Bruken av denne tilnærmingen demonstrerer effektiv retroviral transduksjon av murine CAR-T-celler og oppnåelse av høyt CAR-uttrykk uten behov for viral konsentrasjon gjennom ultrasentrifugering. Strategier for å endre antigenspesifisiteten til CAR-konstruksjonen diskuteres i tillegg til samekspresjon av ytterligere transgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protokoller AC-AABQ5551 og AC-AAAZ4470) ved bruk av 6-8 uker gamle kvinnelige BALB / c eller CF57BL / 6 mus som veier mellom 20-25 g. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). Denne protokollen er strukturert rundt "dagene etter aktivering" av murine T-celler, og virusproduksjonen begynner på dag -2. Retrovirus kan lagres ved -80 °C etter initiell produksjon, og for fremtidig bruk av denne protokollen kan man starte med trinn 2, T-celleisolering og aktivering på dag 0.
1. Retroviral vektorproduksjon
MERK: De virale produktene har blitt gjort replikasjonsdefekte ved separasjon av emballasjegenene i to separate plasmider (se materialtabellen), noe som reduserer sannsynligheten for rekombinasjonshendelser og utilsiktet produksjon av replikasjonskompetent virus.
- Klargjør Phoenix Eco-celler én dag før transfeksjon (dag -2 prosedyre).
- Plate ca. 1 x 107 celler i en 15 cm TC-behandlet plate eller T150 kulturkolbe, ved bruk av 30 ml kulturmedium (Phoenix Eco culture medium, som beskrevet i tabell 1).
- Inkuber over natten ved 37 °C. Etter 18-24 timer skal cellene være omtrent 70% sammenflytende og jevnt fordelt for å sikre et høyt viralt utbytte uten gjengroing.
MERK: For optimale resultater, bruk celler med lav passasje og passasje dem dagen før plating for viral produksjon. Ikke la Phoenix Eco-celler vokse igjen under rutinedyrking.
- Klargjør transfeksjonsblandingen som inneholder lipofeksjons- og forsterkerreagensene, pCL-Eco (Gag/Pol) og pMSCV-ekspresjonsplasmid (pMSCV_PGK_mGFP28z) i medier med redusert serum (se materialfortegnelse) (dag -1 prosedyre).
MERK: Co-transfeksjon bør utføres i forholdet 1:1 mellom pMSCV og pCL-Eco.- Forbered rør A: Fortynn 105 μL av transfeksjonsreagenset i 3,75 ml redusert serummedium per 15 cm plate og bland grundig ved virveldannelse eller pipettering opp og ned.
- Forbered rør B: Fortynn pMSCV-ekspresjonsplasmid (21 μg) og pCL-Eco (21 μg) med 90 μL forsterkerreagens til 3,75 ml redusert serummedium per 15 cm plate. Bland godt ved å pipettere opp og ned.
MERK: Hvis du genererer flere virale produkter, sett opp en masterblanding som inneholder pCL-Eco og forsterkerreagenset. - Tilsett tube A til tube B og bland godt ved pipettering. Inkuber i 10-20 minutter ved romtemperatur, noe som resulterer i et totalt volum på ca. 7,5 ml.
- Fjern forsiktig 10 ml cellekulturmedier fra Phoenix Eco-platen(e) og tilsett hele volumet av transfeksjonsblandingen til det gjenværende mediet ved å vippe platen og pipettere dråpevis. Returner celler til en 37 °C inkubator.
- Endre mediet på transfekterte Phoenix Eco-celler 16-20 timer etter transfeksjon (dag 0-prosedyren).
- Forvarmende serum og β-merkaptoetanol (2-ME, se materialfortegnelse)-fritt murine T-cellemedium (mTCM-viral høsting, som listet opp i tabell 1) til 37 °C ved bruk av vann- eller perlebad.
- Fjern forsiktig Phoenix Eco Culture-mediet ved å vippe platen og plassere pipettespissen nederst i hjørnet ved hjelp av et vakuum hvis mulig. Unngå overtørking av cellene.
- Tilsett forsiktig det oppvarmede mTCM-virale høstmediet til siden av den vippede platen ved å pipetere 30 ml på den tregeste innstillingen. Returner celler til en 37 °C inkubator.
MERK: Dette trinnet kan føre til at Phoenix Eco-celler løsner fra platen og reduserer virale titere. Forvarmede medier og skånsom pipettering vil minimere forstyrrelser.
- Høst den virale supernatanten 48 timer etter transfeksjon (dag 1 prosedyre).
- Høst den virale supernatanten og filtrer den gjennom 0,45 μm PVDF-filtre (se materialtabell) for å fjerne celler og rusk. Aliquot og fryse viruset ved -80 °C eller fortsett direkte til dag 1 i trinn 3 hvis du bruker ferskt virus.
- Bestem virustiteren (transduserende enheter/ml) ved hjelp av flowcytometri, som tidligere beskrevet9. Dette trinnet er valgfritt.
- Bestem virustiteren ved småskala transduksjon av 1 x 105 aktiverte murine T-celler i ikke-vevskultur (TC)-behandlede 96-brønnsplater, forhåndsbelagt med retronektin (se materialtabell) og lastet med trefoldige serielle fortynninger av retroviral supernatant i et endelig volum på 100 μL mTCM-viralt høstmedium.
MERK: Se trinn 2 og trinn 3 nedenfor for detaljerte instruksjoner om T-celleisolering, aktivering og transduksjon. - Bestem CARs overflateuttrykk 4-5 dager etter transduksjon ved flowcytometri.
- Beregn viral titer i henhold til formelen10: (N x F x D) / V, hvor N er antall celler transduced, F er frekvensen av CAR-positive celler, D er fortynningsfaktoren, og V er transduksjonsvolumet i ml for å oppnå transduserende enheter (TU) / ml.
MERK: Viral titer kan reduseres ved frysing/tining; Derfor er viral titer ideelt bestemt på frosset og deretter tint virus.
- Bestem virustiteren ved småskala transduksjon av 1 x 105 aktiverte murine T-celler i ikke-vevskultur (TC)-behandlede 96-brønnsplater, forhåndsbelagt med retronektin (se materialtabell) og lastet med trefoldige serielle fortynninger av retroviral supernatant i et endelig volum på 100 μL mTCM-viralt høstmedium.
2. Murine T-celleisolasjon
- Isoler og aktiver murine T-celler (dag 0 prosedyre).
MERK: Disse trinnene kan utføres ved romtemperatur (RT) eller 4 °C og bør utføres i et sterilt miljø.- Høst milten (e) fra musestammen av interesse (f.eks. Balb / c, C57BL / 6) som tidligere beskrevet11 og oppnå en enkeltcellesuspensjon gjennom mekanisk dissosiasjon.
- Bruk baksiden av en steril sprøyte, knus milten (e) gjennom en 70-100 μm cellesil i et 50 ml konisk rør.
- Etter å ha satt sprøyten til side, vask silen med 5 ml T-celleisolasjonsbuffer (fosfatbufret saltvann, PBS, supplert med 2% føtalt bovint serum, FBS).
- Gjenta mosetrinnet og vask silen en gang til med 5 ml T-celleisolasjonsbuffer. Bring det endelige volumet til 50 ml med T-celleisolasjonsbuffer.
- Telle levende celler ved hjelp av et manuelt hemocytometer eller en automatisk celleteller ved å fortynne i forholdet 1:20 og deretter blande ved 1: 1 med trypanblått.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 10 minutter ved 450 x g, ved 4 °C (eller RT), og resuspender miltocytter ved 1 x 108/ml hvis du bruker det anbefalte T-celleisolasjonssettet (se materialfortegnelse).
MERK: Milt kan bli anstrengt gjennom en 40-70 μm sil på dette stadiet for å fjerne klumper.
- Isoler CD3+ T-celler ved negativt valg i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse). Etter magnetisk separasjon, overfør isolatet til et 15 ml konisk rør og utfør en endelig telling av levende celler.
- Pellet de isolerte T-cellene ved sentrifugering i 10 minutter ved 450 x g, ved 4 °C (eller RT), og resuspender dem ved 1 x 106/ml i mTCM-aktiveringsmedium (tabell 1).
- Aktiver T-celler ved å tilsette murine anti-CD3 / anti-CD28 monoklonale antistoffbelagte magnetiske perler (se materialtabellen) i forholdet 25 μL / 1 x 106 T-celler og 100 U / ml IL-2.
- Plasser cellene i en inkubator ved 37 °C og la dem stå over natten.
MERK: På grunn av den lille størrelsen på T-celler, kan et mer nøyaktig antall levende T-celler oppnås ved å fortynne i forholdet 1:10-1:20 og blande ved 1:1 med trypanblått for manuell telling ved hjelp av et hemocytometer. Renhet kan bestemmes ved flowcytometri ved å fargelegge celler med et fluorescerende konjugert αCD3-antistoff. Hver milt vil gi mellom 7-10 x 106 T-celler, avhengig av musens alder og belastning.
3. Murine T-celletransduksjon
- Forbered plater for transduksjon (dag 0 prosedyre).
- Forbelegg av ikke-behandlede sterile 24-brønnsplater med 0,5 ml humant fibronektintransduksjonsforsterkerreagens (se materialtabell) i en endelig konsentrasjon på 20-40 μg / ml ved å fortynne den i steril PBS og lagre ved 4 ° C over natten.
MERK: Dette trinnet kan også utføres på dag 1 ved å belegge ubehandlede 24-brønnsplater med transduksjonsreagenset og inkubere dem ved romtemperatur i 2 timer.
- Forbelegg av ikke-behandlede sterile 24-brønnsplater med 0,5 ml humant fibronektintransduksjonsforsterkerreagens (se materialtabell) i en endelig konsentrasjon på 20-40 μg / ml ved å fortynne den i steril PBS og lagre ved 4 ° C over natten.
- Utfør T-celletransduksjon (dag 1 prosedyre).
- Forbered den forhåndsbelagte platen for transduksjon. Fjern transduksjonsreagenset fra hver brønn i den forhåndsbelagte 24-brønnsplaten og blokken med et ekvivalent volum sterilfiltrert PBS + 2% bovint serumalbumin (BSA) (0,5 ml) i 30 minutter ved RT.
- Vask en gang med 0,5-1 ml PBS.
- Tilsett 0,5-1 ml pent retrovirus fra trinn 1 eller fortynnet basert på virustiter til hver forhåndsbelagt brønn og sentrifuge i 90 minutter ved 2000 x g og 32 °C.
- Tilsett 1 ml aktiverte T-celler til hver viralt belastede brønn og sentrifuge i 10 minutter ved 450 x g og 32 °C. Returner celler til en 37 °C inkubator over natten.
- 24 timer etter transduksjon, fjern 1-1,5 ml cellekulturmedier og erstatt det med 1-1,5 ml mTCM-komplett og 10 ng / ml rekombinant humant IL-7 og IL-15 (se materialfortegnelse). Returner celler til en 37 °C inkubator (dag 2 prosedyre).
MERK: Under ex vivo kultur må 10 ng / ml cytokiner tilsettes kulturen hver 48. time, og T-celler skal ikke fortynnes utover 1 x 106 / ml. - 48 timer etter transduksjon, overfør celler fra transduksjonsplaten til en fersk 24-brønns eller 6-brønns plate og returner celler til en 37 ° C inkubator (dag 3 prosedyre).
MERK: T-celle levedyktighet kan forbedres ved å overføre celler på 24 timer til 2 dager etter transduksjon, avhengig av start T-celle levedyktighet og viral titer. - De-perle T-cellene og bekreft CAR-uttrykk (dag 5-6 prosedyre).
- Fullstendig re-suspendere celler for å dissosiere aktiverte T-celler fra αCD3/CD28-belagte perler (se materialfortegnelse) og plasser cellesuspensjonen på en magnet i 30 s. Overfør cellesuspensjonen til ønsket ex vivo dyrkningsbeholder og returner den til en 37 °C inkubator.
MERK: T-celler kan dyrkes i kulturflasker eller dype brønnkulturplater. Det anbefales å plate minimum 5 x 106 T-celler i 30 ml mTCM-komplett medium per brønn i en dyp brønn i en 6-brønns plate (se materialfortegnelse). - Bestem CAR-uttrykk ved flowcytometri8.
MERK: GFP-CAR-uttrykk ble bestemt ved inkubasjon med 100 ng / ml renset GFP. Inkorporering av en N-terminal epitopkode vil lette påvisning av alternative CAR-konstruksjoner.
- Fullstendig re-suspendere celler for å dissosiere aktiverte T-celler fra αCD3/CD28-belagte perler (se materialfortegnelse) og plasser cellesuspensjonen på en magnet i 30 s. Overfør cellesuspensjonen til ønsket ex vivo dyrkningsbeholder og returner den til en 37 °C inkubator.
- Utfør ex vivo kultur av CAR-T celler (dag 7-10 prosedyre).
- Under ex vivo kultur, vedlikehold cellene ved å fjerne 50% av kulturmediet og erstatte det med fersk mTCM-komplett + 2x 10 ng / ml IL-7 og IL-15 hver 48 h.
MERK: Murine CAR-T-celler er klare til bruk i nedstrøms applikasjoner 7 dager etter aktivering og bør ikke kryopreserveres på grunn av dårlig levedyktighet etter tining.
- Under ex vivo kultur, vedlikehold cellene ved å fjerne 50% av kulturmediet og erstatte det med fersk mTCM-komplett + 2x 10 ng / ml IL-7 og IL-15 hver 48 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her tar sikte på å standardisere prosessen med murine T-celletransduksjon for generering av mus CAR-T-celler. Figur 1 gir en detaljert beskrivelse av trinnene som er involvert. Prosessen begynner med produksjon av retrovirale vektorer via co-transfeksjon av virale komponenter til Phoenix Eco-celler. Figur 2 gir et bilde av den optimale tettheten av Phoenix Eco-celler på transfeksjonsdagen. Isolerte T-celler aktiveres deretter 24 timer etter transfeksjon, eller "dag 0" av denne protokollen, som forberedelse til transduksjon på dag 1. Etter transduksjon dyrkes CAR-T-celler i nærvær av rekombinant humant IL-7 og IL-15 for å oppnå tilstrekkelig foldekspansjon samtidig som stamcelleminnepopulasjoner bevares.
Bruk av det anbefalte murine T-celleisolasjonssettet (se materialtabellen) med denne protokollen gir T-cellerenhet på <98 % før transduksjon, målt ved flowcytometri (figur 3A). Videre kan reproduserbare CAR-ekspresjonsrater på 65%-75% oppnås ved bruk av denne protokollen og pMSCV retroviral vektoren modifisert for å uttrykke CAR-konstruksjonen fra en PGK-promotor (figur 3B,C). Bestemmelse av retroviral titer viser titere på opptil ~2 x 107 TU/ml og CAR-uttrykk på 74 % med 1/3rd av viral supernatant høstet etter co-transfeksjon av pMSCV med pCL-Eco (tilleggsfigur 1).
Til slutt fører ex vivo-kultur med 10 ng / ml IL-7 og IL-15 til omtrent 15 ganger ekspansjon, noe som resulterer i ~ 150 x 106 T-celler ved dag 10 etter aktivering fra en enkelt milt (figur 3D). Dyrkning med IL-7 og IL-15 fører til sammenlignbare CD8+- og CD4+ T-cellefrekvenser (figur 3E) og bevarte stamcelleminnepopulasjoner bestemt ved CD62L+CD44-uttrykk etter 10 dager med ex vivo-kultur (figur 3F).
Figur 1: Protokolloversikt. Topppanel: En skjematisk oversikt over protokollens tidslinje. Bottompanel: Trinnvise instruksjoner for retroviral vektorproduksjon og mus T-celletransduksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimal celletetthet for transfeksjon. Brightfield-mikroskopibilde av Phoenix Eco-celler med optimal tetthet før transfeksjon med pMSCV og pCL-Eco. Tatt med en 10x objektivlinse. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Murine CAR-T celleproduksjon og ex vivo dyrkning. (A) Flowcytometriplott som viser frekvensen av BALB/c CD3+-celler etter murine T-celleisolasjon. (B) Skjematisk fremstilling av pMSCV retroviral vektor brukt for GFP-CAR ekspresjon i murine T-celler. (C) Flowcytometrihistogrammer som viser CAR-overflateuttrykk på musens T-celler etter inkubasjon med renset sfGFP. UT, utransduced. (D) Fold utvidelse av CAR-T-celler ved dag 10 etter aktivering og kultur med rekombinant humant IL-17 og IL-15. Ca. 8 x 106 murine T-celler ble aktivert før transduksjon og nådde ca. 1,28 x 108 ved dag 10 etter aktivering. (E) Flowcytometriplott som viser frekvensen av CD8+- og CD4+ CAR-T-celler på dag 10 etter aktivering. (F) Flowcytometriplott som demonstrerer frekvensen av CD8+ T-celleminnepopulasjoner bestemt av CD62L og CD44 overflateuttrykk. Stamcelleminne (TSCM) er preget av CD62L + CD44-, sentralt minne (TCM) av CD62L + CD44 +, og effektorminne (TEM) av CD62L-CD44 +. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Formulering av cellekulturmedier. Formuleringsdetaljene for cellekulturmedier som brukes i protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfigur 1: CAR overflateuttrykk og retrovirale titer. (A) Flowcytometrihistogrammer som viser CAR-overflateuttrykk på BALB/c T-celler etter inkubasjon med renset sfGFP. Retrovirus ble generert ved å transfektere Phoenix Eco-celler med pMSCV_PGK_mGFP28z i kombinasjon med pCL-Eco og pMD2.G (I), pCL-Eco (II) eller alene (III). T-celler ble transdusert med fortynnet retrovirus som indisert. (B) Retrovirale titere bestemt av CAR-overflateuttrykk av transduserte T-celler. Transduserende enheter (TU)/ml ble beregnet ved hjelp av formelen: (N∙F∙D)/V, hvor N er antall celler som transduseres (1 x 105), F er frekvensen til CAR+ -celler, D er fortynningsfaktoren, og V er transduksjonsvolumet i ml (0,2 ml). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: pMSCV-uttrykksvektorsekvens. Sekvensen av GFP28z CAR og flankerende sekvenser (kursiv) i pMSCV-ekspresjonsvektoren, med NotI og BamHI enzymsteder uthevet i blått. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver trinnene og reagensene som er nødvendige for retroviral transduksjon av murine T-celler for å generere CAR-T-celler for in vivo studier. Optimalisering av retrovirale transduksjonsbetingelser oppnår robust CAR-uttrykk uten behov for viral konsentrasjon gjennom ultrasentrifugering eller ytterligere reagenser. Det er imidlertid flere modifikasjoner som kan brukes på denne metodikken.
Mens denne protokollen beskriver eksempelgenereringen av en GFP-spesifikk CAR, kan disse metodene tilpasses for å generere musens CAR-T-celler rettet mot ethvert ekstracellulært antigen av interesse. Den pMSCV_PGK retrovirale vektoren som brukes i denne studien, muliggjør effektiv frigjøring av den GFP-spesifikke nanokroppssekvensen ved enzymatisk fordøyelse med NotI og BamHI og kan erstattes med et brukerdefinert antigengjenkjenningsdomene som et scFv-, nanobody- eller ligandbindende domene (tilleggsfil 1). For å lette vurderingen av alternativt CAR-uttrykk, anbefales det å designe CARs med en N-terminal epitopkode, for eksempel Myc (EQKLISEEDL) eller Flag (DYKDDDDK) tags, som kan detekteres ved bruk av fluorescerende konjugerte antistoffer12. Videre demonstrerer den nåværende studien produksjonen av et enkelt transgen; Imidlertid vil inkorporering av selvspaltende peptider (2A-sekvenser) eller interne ribosominngangssteder (IRES) muliggjøre samproduksjon av flere transgener, inkludert tilleggsteknologier for å forbedre T-cellefunksjonen in vivo 8,13,14.
Selv om denne protokollen ble utviklet for å eliminere behovet for spesialutstyr ved å utelate ultrasentrifugering (24 000 x g, 2 timer, 4 ° C), er det verdt å merke seg at konsentrasjonen av viral supernatant kan oppnå høyere virale titere og redusere volumet av virus som kreves for å oppnå høyt CAR-uttrykk8. Denne protokollen strømlinjeformer i tillegg retroviral vektorproduksjon ved å oppnå reproduserbart høye virale titere (~2 x 107 TU / ml) og jevnt CAR-uttrykk uten behov for viral titerbestemmelse før bruk. I tillegg til å legge til rette for standardisering, kan imidlertid bestemmelse av viral titer før T-celletransduksjon også øke T-cellenes levedyktighet ved å redusere potensiell toksisitet forårsaket av unødvendig høye virale konsentrasjoner10,15.
Tilskudd med IL-7 og IL-15 anbefales for å fremme T-celleutvidelse og bevare T-celleminnepopulasjoner; Imidlertid kan rekombinant humant IL-2 brukes som et alternativ for å redusere antall nødvendige reagenser for ex vivo kultur 16,17,18,19. Ikke desto mindre forblir metodene for CAR-T-cellegenerering som er skissert her, begrenset av den relativt dårlige ekspansjonen av murine T-celler. Imidlertid kan tiltakene for å forbedre T-cellenes levedyktighet diskutert ovenfor forbedres ytterligere ved å inkludere ytterligere tilskudd og 2-ME i mTCM-kulturmediet gjennom transduksjonsprosessen20. Selv om disse modifikasjonene kan forbedre T-celleutvidelsen fra 15 ganger til opptil 20 ganger20, kan de resultere i lavere transduksjonseffektivitet og redusert CAR-uttrykk.
Til syvende og sist gjør produksjonen av murine CAR-T-celler det mulig å utvikle syngene modeller for å evaluere CAR-T-cellefunksjonen i et intakt immunsystem - noe som letter en kontekstspesifikk vurdering av deres styrke, holdbarhet og sikkerhet. Mens modeller i immundefekte mus tillater viktige prekliniske studier av et humant T-celleprodukt rettet mot et humant tumorantigen. Kombinasjonen av disse komplementære modellsystemene vil være uunnværlig for å forstå kompleksiteten i CAR-T-cellebiologi, optimalisere nye CAR-design og til slutt oversette prekliniske funn til effektive kliniske terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker L. Brockmann for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH 1R01EB030352 og UL1 TR001873.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M.
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
