Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In-vivo Кальциевая визуализация сенсорных нейронов тройничного ганглия крысы

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Генетически кодируемые кальциевые индикаторы (GECI) позволяют проводить надежный анализ сигналов сенсорных нейронов на популяционном уровне. Здесь мы разработали новый подход, который позволяет визуализировать in vivo активность нейронов тройничных ганглиев крыс.

Abstract

Генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI) позволяют использовать методы визуализации для мониторинга изменений внутриклеточного кальция в целевых клеточных популяциях. Их большое соотношение сигнал/шум делает GECI мощным инструментом для обнаружения вызванной стимулом активности в сенсорных нейронах. GECI облегчают популяционный анализ кодирования стимулов с количеством нейронов, которые могут быть изучены одновременно. Это популяционное кодирование наиболее целесообразно выполнять in vivo. Ганглии дорсальных корешков (DRG), в которых находятся сомы сенсорных нейронов, иннервирующих соматические и висцеральные структуры ниже шеи, наиболее широко используются для визуализации in vivo , поскольку доступ к этим структурам относительно прост. Совсем недавно эта методика была использована на мышах для изучения сенсорных нейронов в тройничном ганглии (ТГ), которые иннервируют ротовые и черепно-лицевые структуры. Существует множество причин для изучения ТГ в дополнение к DRG, включая длинный список болевых синдромов, специфичных для оральных и черепно-лицевых структур, которые, по-видимому, отражают изменения в активности сенсорных нейронов, такие как невралгия тройничного нерва. Мыши наиболее широко используются при изучении нейронов DRG и TG из-за доступности генетических инструментов. Тем не менее, учитывая различия в размерах, простоте обращения и потенциально важные видовые различия, есть причины изучать TG-нейроны крыс, а не мышей. Таким образом, нами был разработан подход к визуализации TG-нейронов крыс in vivo. Мы вводили новорожденным щенкам (p2) внутрибрюшинно AAV, кодирующий GCaMP6s, что приводило к >90% инфицированию нейронов TG и DRG. ТГ визуализировалась у взрослого человека после трепанации черепа и декортикации, а изменения флуоресценции GCaMP6s отслеживались в нейронах ТГ после стимуляции нижнечелюстной и верхнечелюстной областей лица. Мы подтвердили, что увеличение флуоресценции было вызвано стимулом при блокаде периферических нервов. Несмотря на то, что этот подход имеет множество потенциальных применений, мы используем его для характеристики субпопуляции (популяций) нейронов ТГ, измененных после повреждения периферических нервов.

Introduction

Соматоощущение, нейронное кодирование механических, тепловых и химических раздражителей, воздействующих на кожу или другие структуры организма, включая мышцы, кости и внутренние органы, начинается с активности первичных афферентных нейронов, которые иннервируютэти структуры. Электрофизиологические подходы, основанные на единичных единицах, предоставили огромное количество информации о афферентных подтипах, участвующих в этом процессе, а также о том, как их свойства стимул-реакция могут изменяться с течением времени 1,2,3. Тем не менее, несмотря на то, что остаются убедительные доказательства в поддержку теории меченых линий, которая предполагает, что специфические сенсорные модальности передаются определенными субпопуляциями нейронов, способность многих субпопуляций нейронов реагировать на одни и те же типы механических, тепловых и химических стимулов предполагает, что большинство соматосенсорных стимулов кодируются несколькими субпопуляциями нейронов. 5. См. Таким образом, лучшее понимание соматочувствительности придет только при условии одновременного изучения активности 10, если не сотен, нейронов.

Прогресс в оптических подходах с относительно недавним появлением конфокальных и, впоследствии, многофотонных и цифровых методов визуализации облегчил возможность проведения относительно неинвазивного анализа активности нейронов на популяционном уровне 6,7. Одним из последних препятствий в применении этой технологии стала разработка инструментов, позволяющих проводить оптическую оценку нейронной активности. Учитывая скорость потенциала действия, которая может начинаться и заканчиваться менее чем за миллисекунду, чувствительный к напряжению краситель, способный следовать за изменениями мембранного потенциала со скоростью потенциала действия, был бы идеальным инструментом для этой цели. Но, несмотря на то, что в этой области был достигнут огромный прогресс(7,8,9,10), отношение сигнал/шум для многих из этих красителей все еще недостаточно велико, чтобы можно было провести популяционный анализ сотен нейронов на уровне отдельных клеток. В качестве альтернативного подхода исследователи обратились к мониторингу изменений внутриклеточной концентрации Ca2+ ([Ca2+]i). Ограничения этой стратегии были очевидны с самого начала и включают в себя тот факт, что увеличение [Ca2+]i является косвенной мерой нейронной активности11; что увеличение [Ca2+]i может происходить независимо от притокаCa2+, связанного с активацией потенциал-зависимых каналовCa2+ (VGCC)12,13; что величина и продолжительность переходного процесса Ca2+ могут контролироваться процессами, независимыми от активности VGCC 11,12,14; и что временной ход переходных процессов Ca2+ намного превышает ход потенциала действия15. Тем не менее, существует ряд существенных преимуществ, связанных с использованием Ca2+ в качестве косвенного показателя нейронной активности. Не последнее место среди них занимает отношение сигнал/шум, связанное с большинством индикаторов Ca2+, отражающее как величину изменения внутриклеточногоCa2+, так и тот факт, что сигнал возникает из трехмерного пространства цитозоля, а не из двумерного пространства клеточной мембраны. Кроме того, с разработкой генетически кодируемых индикаторов Ca2+ (GECI) стало возможным использовать преимущества генетических стратегий для стимулирования экспрессии индикаторов Ca2+ в конкретных субпопуляциях клеток, облегчая анализ на популяционном уровне интактных препаратов (см., например,16).

Учитывая количество генетических инструментов, доступных в настоящее время у мышей, неудивительно, что GECI наиболее широко использовались у этого вида. Разработаны линии мышей с конститутивной экспрессией GECI в субпопуляциях сенсорных нейронов 7,16,17. С развитием мышиных линий, экспрессирующих рекомбиназы в определенных типах клеток, стало возможным использовать еще более сложные стратегии для контроля экспрессии GECI15. Однако, несмотря на то, что эти инструменты становятся все более мощными, существует ряд причин, по которым другие виды, такие как крысы, могут быть более подходящими для некоторых экспериментальных вопросов. К ним относятся больший размер, облегчающий ряд экспериментальных манипуляций, которые трудны, если не невозможны, на меньшей мыши; легкость обучения крыс относительно сложным поведенческим задачам; и, по крайней мере, некоторые доказательства того, что биофизические свойства и паттерны экспрессии нескольких ионных каналов в сенсорных нейронах крыс могут быть более похожи на те, которые наблюдаются в сенсорных нейронах человека, чем те же каналы у мышей по сравнениюс человеческими.

В то время как трансдукция соматосенсорных стимулов обычно происходит в периферических терминалях первичных афферентов, потенциал действия, инициированный на периферии, должен пройти через структуру, в которой находятся первичные афферентные соматы, называемые дорсальными корешками (DRG) или тройничным (TG) ганглиями, прежде чем достичь центральнойнервной системы. Хотя имеются доказательства того, что не каждый потенциал действия, распространяющийся вдоль первичного афферентного аксона, вторгается в тело клетки20, вследствие того факта, что первичные афферентные соматы соединены с главным афферентным аксоном через Т-соединение19, большинство потенциалов действия, инициированных на периферии, по-видимому, вторгаются в сому21. Это дает три экспериментальных преимущества при использовании GECI для оценки популяционного кодирования в первичных афферентах: большой размер тела клетки по отношению к аксонам еще больше увеличивает сигнал/шум при использовании [Ca2+]i в качестве косвенной меры афферентной активности; DRG, как правило, легко доступны; А оценка активности в участке, который пространственно удален от афферентных окончаний, сводит к минимуму потенциальное влияние операции, необходимой для обнажения ганглиесов, на свойства стимул-реакция афферентных окончаний. Однако, поскольку ТГ расположены под мозгом (или над палитрой), к ним гораздо труднее получить доступ, чем к DRG. Кроме того, несмотря на то, что между нейронами DRG и TG есть много общего, список различий также растет. Это включает в себя грубо соматотопическую организацию нейронов в TG22, уникальные иннервированные структуры, различные паттерны окончания центральных концов 23,24,25,26, а теперь и растущий список различий как в экспрессии генов27,28, так и в экспрессии функциональных рецепторов29. Кроме того, поскольку мы заинтересованы в идентификации периферических механизмов боли, относительно большое количество болевых синдромов, которые, по-видимому, являются уникальными для тройничной системы (например, мигрень, невралгия тройничного нерва, синдром жжения во рту), которые, по-видимому, включают аберрантную активность в первичных афферентах 30,31,32, позволяет предположить, что ТГ необходимо изучать напрямую.

Таким образом, несмотря на то, что свойства ТГ-нейронов типа «стимул-реакция» были изучены с помощью ГЭСИ у мыши16, поскольку перечисленные выше причины позволяют предположить, что крыса может быть более подходящим видом для решения различных экспериментальных вопросов, целью настоящего исследования была разработка подхода к использованию ГЭСИ для изучения нейронов ТГ у крысы. Для достижения этой цели мы использовали вирусный подход, чтобы стимулировать экспрессию GECI GCaMP6 в периферической нервной системе. Затем мы удалили передний мозг, чтобы обеспечить доступ к ТГ. Наконец, механические и тепловые стимулы были приложены к лицу, в то время как нейронные реакции оценивались под флуоресцентной микроскопией. В совокупности эти данные подтверждают роль крысы в исследовании изменений в ТГ при многих состояниях, расширяя инструментарий для исследователей, заинтересованных в сенсорном кодировании в тройничном нерве.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием животных в исследованиях проводились в соответствии со стандартами, установленными Национальными институтами здравоохранения и Международной ассоциацией по изучению боли, и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию животных Университета Питтсбурга (протокол #22051100). В конце каждого эксперимента крыс усыпляли путем обескровливания с сердечной перфузией ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS), подход, одобренный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией и IACUC Университета Питтсбурга.

1. Индукция GCaMP

  1. Закажите беременных крыс Спрэг-Доули, чтобы щенкам можно было делать инъекции в нужное время после рождения.
  2. Опрыскайте перчатки 70% EtOH перед тем, как обработать каждого крысодетка. Это удержит мать от поедания молодняка.
  3. Взять мазок у детенышей крыс (P1-2) с 70% EtOH и обезболить на льду в течение 3 мин.
  4. Введите 15 мкл AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) внутрибрюшинно с помощью стерильного газонепроницаемого шприца Hamilton объемом 25 мкл.

2. Операция по обнажению тройничного ганглия

  1. Вводят анестезирующий коктейль (55 мг/кг кетамина, 5,5 мг/кг ксилазин, 1 мг/кг ацепромазина) внутрибрюшинно в зависимости от массы тела 6-8-недельным крысам (примерно 150-200 г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, этого достаточно для поддержания хирургической плоскости анестезии, что оценивается по отсутствию рефлекса отведения на вредное ущипление задней лапы. Тем не менее, добавка изофлурана через носовой конус, если животные становятся светлыми.
  2. После полной анестезии сбрейте волосы и усы на голове и лице.
  3. Прикрепите крысу к стереотаксической раме с амбушюрами и положите под нее грелку (~37 oC) для поддержания температуры тела.
  4. Контролируйте жизненно важные показатели (частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, насыщение крови кислородом) с помощью мышиного оксиметра или аналогичного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела контролируется ректальным зондом и поддерживается путем помещения крыс на циркулирующее водяное одеяло с обратной связью.
  5. Положите на голову марлю, смоченную в ледяном физиологическом растворе, чтобы сузить кровеносные сосуды и свести к минимуму кровотечение. С помощью скальпеля 15-го размера сделайте разрез по средней линии кожи и мышц над черепом.
  6. Используйте тупое рассечение кожи и мышц, чтобы обнажить череп.
  7. Используя сверло на 1/4 круга, осторожно проколите черепную крышку, чтобы обнажить передний мозг. Затем с помощью ронжеров (чашка 2,5 мм) аккуратно разрезают череп.
  8. Скальпелем размера 15 сделайте надрез в головном мозге (Брегма: -3,80) и обонятельной луковице.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более каудальный разрез после этой точки приведет к гибели крыс
  9. С помощью шпателя осторожно отделите твердую мозговую оболочку от черепа и осторожно приподнимите отрубленный мозг, чтобы обнажить ТГ и основание черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительное использование перфузии ледяного физиологического раствора на протяжении всей экстракции минимизирует кровотечение и оптимизирует последующее поле диссекции.
  10. С помощью шприца для прижигания остановите кровотечение, возникшее в результате удаления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезание твердой мозговой оболочки приведет к неизбежному кровотечению. Лучше всего приготовить ледяную аКСФ (119 мМ NaCl, 26,2 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1 мМ2PO4, 1,3 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 2,5 мМ CaCl2) для омовения полости черепа, чтобы помочь сужению кровеносных сосудов при сохранении здоровья нейронов.

3. Визуализация GCaMP6s

ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая размер и плотность этих нейронов, используемая система визуализации и сбора данных (объектив, микроскоп, источник света, камера) будет определять количество визуализируемых клеток GECI+ . Источник света, объектив и камера также определяют параметры, используемые для получения изображения, включая время экспозиции и скорость захвата изображения. В то время как многофотонные и конфокальные методы могут быть использованы в зависимости от параметров эксперимента, эпифлуоресцентная микроскопия может быть достаточной для разрешения многих клеток. Можно использовать любой пакет для получения изображений. В идеале, приложение стимула ограничено по времени программным пакетом для получения изображений.

  1. Поместите полость черепа под объектив и сфокусируйте ТГ с помощью видимого света.
  2. Длина волны возбуждения GCaMP6s составляет 496 нм, а длина волны излучения — 513 нм; таким образом, используйте соответствующие дихроичные и фильтрующие кубы для поиска ячеек GCaMP+ . Отрегулируйте фокус, чтобы найти и разрешить область ганглии, в которой нейроны реагируют на стимулы, приложенные к интересующему рецептивному полю.
  3. Используйте 10-кратный объектив, чтобы обеспечить визуализацию большинства нейронов в ТГ, реагирующих на механические раздражители, приложенные к области лица размером 1см2 16. Используйте 20-кратный сухой объектив с большим рабочим расстоянием (10,8 мм) для увеличения разрешения.
  4. Используйте программное обеспечение для сбора данных о флуоресценции с течением времени и в ответ на применение стимула.
    1. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание нейронов, используйте как можно более короткое время экспозиции, чтобы обнаружить исходное и вызванное увеличение флуоресценции. С помощью 20-кратного воздушного объектива 0,40 NA, источника света на основе галогенида ртути мощностью 120 Вт и дополнительной камеры металл-оксид-полупроводник (CMOS), используемой в настоящем исследовании, время экспозиции 300 мс и частота получения изображения 3 Гц позволяют получать стабильные базовые записи в течение >90 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Эти параметры получения изображения должны быть определены опытным путем. 2) Механические (щетка, точечный, вибрационный, щипковый), термический (тепло и холод) и химические (капсаицин, ментол, медиаторы воспаления) могут быть применены к рецептивному полю. Относительно недорогим субъективным подходом является нанесение стимулов вручную. Однако рекомендуются более объективные и воспроизводимые подходы, когда приводы с обратной связью могут использоваться для многократного применения при известном усилии. В то время как устройства Пельтье с обратной связью полезны для контролируемого нагрева и охлаждения, они не идеальны для тепловой стимуляции изогнутой поверхности. Инфракрасные источники света с обратной связью являются альтернативой для нагрева, а холодное распыление — далеко не идеальная альтернатива для охлаждения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поскольку ранее мы успешно использовали серотип AAV9 для инфекции сенсорных нейронов крыс15, мы использовали этот серотип для экспрессии GCaMP6 в TG-нейронах крыс. Поэтому мы сначала попытались оценить эффективность инфекции сенсорных нейронов AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) при введении этого вируса новорожденным крысятам20. Этот вирус использует промотор CAG, который управляет и поддерживает высокий уровень экспрессии генов. Кроме того, было показано, что AAV9 эффективно инфицирует сенсорные нейроны при введении новорожденным крысам33. Первые инъекции использовали 5 мкл для щенков на 5-й день после рождения (p5), что привело к эффективности примерно 51,66% ± 14,33% (рис. 1A). Чтобы увеличить частоту заражения, мы в конечном итоге использовали больший объем вируса (15 мкл) у молодых крыс (p2), сохраняя титр вируса 2,4 x 1014 на прежнем уровне. Эта стратегия привела к заражению 91,84% ± 3,18% (n = 8) нейронов (рис. 1B).

Чтобы визуализировать нейроны ТГ, иннервирующие вибриссальную подушку, мы разработали хирургическую стратегию воздействия ТГ in vivo. Примерно 60% переднего мозга может быть удалено, не затрагивая основные дыхательные центры. Это соответствует ростральному уровню мозговой ткани до Bregma -3,80. Схема обнаженной ТГ (слева) и иннервационной зоны подглазничного нерва (ИОН, справа) показана на рисунке 2. Область ТГ, дающая начало иннервации вибриссальной подушки, определяли путем применения к вибриссальной площадке легкой механической стимуляции (щетки) при мониторинге изменений флуоресценции в 20х. Как и предсказывалось, область V2 ТГ, которая иннервирует верхнечелюстной отдел лица, была единственной активированной областью. То есть, несмотря на то, что они не изучались систематически, не было обнаружено никаких изменений флуоресценции в ответ на стимулы, приложенные к областям V1 (кожа на лбу) или V3 (кожа на нижней челюсти), когда исследуемые нейроны могли быть активированы стимулами, приложенными к вибриссальной подушке. Затем контролировали изменения флуоресценции на исходном уровне и в ответ на стимулы, приложенные к вибриссальной подушке. Область интереса (V2) обозначена на рисунке 3A. В соответствии с предыдущими сообщениями об относительно низком уровне активности в состоянии покоя у сенсорных нейронов34, флуоресценция в состоянии покоя была относительно низкой у большинства нейронов, и было мало доказательств спонтанного увеличения флуоресценции (рис. 3B). Критерии, используемые для идентификации вызванной стимулом активности нейронов на периферии 6,16,21 и ЦНС 12,35,36, представляют собой развивающуюся область с несколькими сложными пакетами рабочих процессов, которые были размещены в свободном доступе37,38. Подробное обсуждение сильных и слабых сторон различных используемых подходов выходит за рамки данной рукописи. Поскольку это не было в центре внимания настоящего исследования, мы использовали относительно произвольные и субъективные критерии, основанные на пиковом ответе, наблюдаемом в областях ганглиесов, в которых не было четко обнаруживаемых нейронов (основанных на способности видеть ядро), так что нейрон считался реагирующим на стимул, если увеличение флуоресценции было ограничено по времени применению стимула (увеличение флуоресценции обнаруживалось в течение 1 с момента применения стимула ( основываясь на предположении, что потенциал действия, инициируемый в самых медленных проводящих аксонах (0,2 м/с), инициированный на участке не более 3 см от тела клетки, должен достичь тела клетки менее чем за секунду), и в >6 раз превышающий стандартное отклонение пикового отклика (ΔF/F), обнаруженного контрольным сайтом (рис. 3C). Далее мы охарактеризовали свойства реакции этих нейронов на естественные раздражители: щетку, точечность, тепло и холод. Примеры ответов на каждый из этих стимулов показаны на рисунке 4. Примечательно, что реакция на точечную стимуляцию, которая чаще всего используется в исследованиях, связанных с болью, имеет наиболее устойчивую реакцию (рис. 4B, F).

Наша цель при разработке этой методики состояла в том, чтобы иметь возможность оценить изменения в популяционном кодировании в нейронах ТГ. Таким образом, мы адаптировали хроническое повреждение сужения к ION (CCI-ION), как ранее использовалось29, для исследования крыс через 2 недели после повреждения нерва. После индукции модели мы подвергали воздействию ТГ и оценивали покоившуюся и вызванную активность в ТГ ипсилатеральной и контралатеральной по отношению к месту повреждения. Интересно, что величина пиковой вызванной реакции на щетку была увеличена в ~2 раза на стороне, поврежденной нервом, по сравнению с пиковой реакцией на тот же стимул, приложенный к контралатеральной стороне (рис. 5A-C). Кроме того, при последовательном применении двух стимулов (с интервалом между стимулами 10 с) наблюдалось значительное усиление величины ответа на второй стимул на поврежденной, но не неповрежденной стороне (рис. 5D).

Наконец, в качестве первоначального контрольного эксперимента, чтобы подтвердить, что вызванное стимулом увеличение флуоресценции было обусловлено потенциалами действия, инициированными на периферии, мы оценили влияние тетродотоксина (1 мкМ) на реакции, вызванные стимулом. ТТХ вводили в объеме 200 мкл чрескожно, как описано выше, 28 так, чтобы воздействовать на подглазничный нерв. Как показано на рисунке 6, вызванная активность была почти полностью устранена. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют полезность использования AAV9-GCaMP для опроса ответов популяции TG in vivo.

Figure 1
Рисунок 1: Высокая эффективность инфекции GCaMP6s в нейронах ТГ при неонатальной инъекции AAV. (A) Детенышам крыс P5 вводили 5 мкл вируса pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (титр: 2,4 x10 14) внутрибрюшинно: экспрессия GCaMP6s была обнаружена у 51,7 ± 14,3% нейронов TG (n = 3 среза на животное, 7 крыс). (B) Увеличение объема инъекции до 15 мкл у молодых животных (p2) улучшило эффективность инфекции: экспрессия GCaMP6s была обнаружена в 91,8 ± 3,2% нейронов TG (n = 3 среза на животное, 8 крыс). Панели слева были окрашены под GCaMP6. Панели в середине были окрашены NeuN, нейрон-специфичным маркером. Панели справа представляют собой объединенное изображение панелей GCaMP6s и NeuN. Масштабная линейка на первой панели одинакова для всех последующих панелей. График справа представляет собой график выражения GCaMP6s (среднее значение ± SEM) в процентах от общего числа нейронов на срез у одного животного, где отдельные точки являются данными для каждого животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Расположение тригеминального ганглия (ТГ), подглазничного нерва (ИОН) и области лица (вибриссальная подушка) стимулируемых. (А) Передний мозг был удален, чтобы обеспечить доступ к ТГ. (Б) Область лица, на которую были приложены естественные стимулы относительно ИОН и ТГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Вызванное стимулом увеличение флуоресценции GCaMP6s. (A) Общее поле зрения при 20-кратном увеличении. Показаны офтальмологические (V1) и верхнечелюстные (V2) отделы ТГ. (В,В) Область в коробке показана на панелях B и C, которые представляют собой флуоресцентные изображения до и после стимуляции вибриссальной подушки щеткой соответственно. Белые круги — это области сравнения интереса. Нейроны считались реагирующими на стимул на основе пикового изменения флуоресценции, наблюдаемого в интересующих областях сравнения, как описано в тексте. Масштабная линейка на первой панели одинакова для обеих панелей. (D) Репрезентативные изменения флуоресценции нейронов, показанные в В и С в ответ на стимул кисти, приложенный к лицу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Классификация нейронов на основе их реакции на раздражители, приложенные к лицу. Репрезентативные изображения нейронов ТГ до (верхняя панель - Baseline) и после (средняя панель - Стимуляция) ответов на 1 см щетки из верблюжьей шерсти (A - Brush), 1 см2 сетки мононитей (B - Punctate), нагрева (C - Heat) и охлаждения (D - Cold), нанесенных на одну и ту же область лица. Масштабная линейка на первой панели одинакова для всех последующих панелей. Оранжевые кружки обозначают пример отзывчивого нейрона. Белые круги — это области сравнения интереса. (Э-Н) Репрезентативные трассы каждой реакции на стимул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Повреждение нерва увеличивает реакцию кисти в нейронах ТГ. Типичные реакции нейронов ТГ на двукратное нанесение кисти на морду крысы со стороны, контралатеральной к хронической судорожной травме подглазничного нерва (А, Контра) или на сторону, ипсилатеральную к повреждению нерва (В, Ипси). (C) Анализ объединенных данных от чувствительных нейронов шести крыс (данные построены для каждой крысы) подтвердил, что разница в величине первой реакции на щетку была значимой (парный t-критерий). (D) Когда пиковая реакция на первое и второе применение стимула была проанализирована как отношение (R2/R1), анализ объединенных данных подтвердил, что увеличение коэффициента ответа на стороне, поврежденной нервами, было значительным. ** стр < 0.01 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Блокада вызванной активности в нейронах ТГ тетродотоксином (ТТХ). (А) Данные флуоресценции нейронов ТГ ипсилатерально к повреждению нерва после инъекции ТТХ (200 мкл, 1 мкМ) рядом с подглазничным нервом после применения стимула щетки (синяя полоса). (B) Объединенные данные о пике реакции от трех крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем быстрый, неинвазивный способ создания крысы GECI для визуализации ТГ. Мы выбрали CAG-промотор для стимулирования и поддержания высокого уровня экспрессии генов. В то время как предыдущие исследования показывают, что другие серотипы AAV могут эффективно управлять экспрессией генов в нейронах DRG39, наши результаты согласуются с недавним исследованием, включающим внутрибрюшинную инъекцию AAV у новорожденных32, что указывает на то, что серотип AAV9 очень эффективен при инфекции сенсорных нейронов новорожденных крыс.

При устранении неполадок этого метода стоит отметить некоторые подводные камни, которые могут помешать оптимальному заражению. Основной переменной, которую следует иметь в виду, является возраст щенков. Нервная система крыс быстро развивается в течение первых 7 дней послерождения. Мы пытались заразить в более поздние моменты времени (например, p4-7), что приводило к вариабельной и низкой эффективности. Более ранние временные точки (p1-4) обеспечивают более надежную и стабильную эффективность, при этом p1-2 обеспечивают самые высокие показатели заражения. Вторая переменная – объем впрыска. Независимо от возраста, для получения более 70% эффективности в ТГ или ДРГ с титром 2,5 x 1014 требовалось не менее 15 мкл. Мы обнаружили, что даже при p2 внутрибрюшинные инъекции менее 10 мкл вызывают очень слабую экспрессию у взрослого человека. Возможно, что более локализованные инъекции, т.е. непосредственно в интересующее рецептивное поле, при меньших объемах будут производить аналогичные эффекты. Однако такой подход потребует от щенков полной анестезии и может привести к травме интересующих тканей. Наконец, возможно, что меньшие объемы могут быть использованы с более высокими титрами.

Экспонирование ТГ для визуализации GECI ранее проводилось на мышах16. Тем не менее, перенос этого подхода на крысу выявил несколько проблем, которые стоит рассмотреть. Во-первых, толщина черепа и твердой мозговой оболочки у крысы намного больше, чем у мыши. Поэтому снятие тюбетейки может быть сопряжено с трудностями. Мы обнаружили, что маленькая дрель является эффективным способом перфорации черепной чашечки, которую затем можно удалить с помощью ронжеров. Второй проблемой является кровотечение после удаления мозга. Это может быть постоянной проблемой как для долговечности препарата, так и для четкости изображения, если не для свойств нейронов. Марлю, смоченную в ледяной спинномозговой жидкости, можно наложить на открытую поверхность мозга, чтобы помочь закрыть основные артерии. Использование небольшой шприц-ручки для прижигания также может быть эффективным для остановки дальнейшего кровотечения. Наконец, гелевая пена, расположенная на контралатеральной стороне окна визуализации, также может помочь предотвратить проблемы с визуализацией со стороны крови и спинномозговой жидкости. Третье соображение – это количество мозга, которое необходимо удалить. Мы обнаружили, что удаление каудального слоя мозга до ~Bregma -3.80 приведет к смерти в течение часа после удаления. Таким образом, мозг следует удалять небольшими участками, сохраняя при этом как можно больше ТГ.

Как отмечалось во введении, [Ca2+]i является косвенной мерой нейронной активности, и, следовательно, увеличение [Ca2+]i не обязательно означает увеличение нейронной активности. Таким образом, контрольные эксперименты имеют решающее значение для подтверждения того, что то, что считается вызванной активностью, на самом деле является активностью как таковой. Например, вызванные электрическим током стимулы должны вызывать фиксированное по времени увеличение [Ca2+]i, которое находится в том же масштабе, что и естественно вызванные стимулы. Важно отметить, что эта активность должна быть устранена с помощью блокады нерва (т.е. ТТХ). Тем не менее, также важно отметить, что, несмотря на эти важные контрольные факторы, все еще возможно, что некоторые из явно вызванных повышений [Ca2+]i связаны с передачей сигналов в ганглиях, например, из-за высвобождения передатчика в ганглиях41, а не из-за потенциала действия, инициированного на периферии, который вторгся в клеточную сому.

В то время как наши результаты подтверждают, что результаты предыдущих исследователей 16,42,43, указывающие на отношение сигнал/шум, связанное с изменениями флуоресценции GCaMP в сенсорных соматах, достаточно для использования со стандартным эпифлуоресцентным микроскопом, такие манипуляции, как повреждение нерва, используемое в настоящем исследовании, могут быть связаны с такими резкими изменениями в нейрональной активности и передаче сигналов Ca 2+ 34, что реакции по всем ганглиям могут быть связаны с таким большим увеличением видимого фона, что ответы отдельных нейронов могут быть искусственно ослаблены. Несмотря нато, что были разработаны подходы к обработке изображений, которые могут помочь устранить это ограничение, для наиболее эффективного решения этой проблемы может потребоваться конфокальная или многофотонная визуализация.

В совокупности этот метод обеспечивает подход к исследованию свойств стимул-реакция TG-нейронов у крыс на популяционном уровне. Наши результаты с CCI ION подтверждают возможность обнаружения изменений этих свойств стимул-реакция. Несмотря на то, что в настоящем исследовании использовались только механические и тепловые стимулы, этот препарат должен поддаваться применению химических стимулов для полного определения свойств «стимул-реакция» нейронов ТГ. Точно так же, в то время как мы сосредоточились на свойствах стимул-реакция кожных афферентов, из-за появления таких явлений, как динамическая механическая аллодиния после травматического повреждения кожного нерва, также должна быть возможность обнаружить изменения в свойствах афферентов, иннервирующих другие черепно-лицевые структуры, такие как височно-нижнечелюстной сустав (в ответ на безобидные и вредные движения челюсти), роговица или язык. Периферическая инъекция серотипа AAV9 позволяет осуществлять нейрон-специфическую индукцию GCaMP, специфичную для ПНС. Основное преимущество этой стратегии заключается в том, что вирусное мечение обеспечивает устойчивую, персистирующую экспрессию в постмитотических клетках (т.е. нейронах), но не в митотических клетках (например, эпителиальных клетках). Кроме того, предварительный скрининг различных тканей ПНС показывает, что эта вирусная стратегия может быть использована для исследования пара/симпатических ганглиев, DRG и энтеральной нервной системы (данные не показаны).

Эта подготовка in vivo также обеспечивает основу для изучения многих сравнений, которых не хватает в современной литературе. Популяционные исследования in vivo между ТГ крыс и ДРГ, крыс и мышей, еще предстоит провести. Данные, представленные здесь, иллюстрируют новую осуществимость этих важных экспериментов, которые предстоит провести.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Д-р Голд получал грантовую поддержку от Грюненталя во время разработки этого препарата. Не было никакого совпадения между фокусом исследования Грюненталя и подготовкой, описанной в этой рукописи. Ни один из других авторов не имеет каких-либо других потенциальных конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить докторов Кэти Альберс и Брайана Дэвиса за использование их микроскопа Leica и программы Metamorph, Чарльза Уорвика за помощь в создании нашего теплового устройства Пельтье и доктора Раймонда Секулу за помощь в устранении неполадок в хирургической подготовке. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) и R01NS122784 (MSG и RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Неврология выпуск 204
<em>In-vivo</em> Кальциевая визуализация сенсорных нейронов тройничного ганглия крысы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter