Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Kalsiumavbildning av sensoriske nevroner i rotte trigeminal ganglion

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) muliggjør en robust, populasjonsnivåanalyse av sensorisk nevronsignalering. Her har vi utviklet en ny tilnærming som muliggjør in vivo GECI-visualisering av rotte trigeminal ganglia neuron aktivitet.

Abstract

Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) muliggjør avbildningsteknikker for å overvåke endringer i intracellulært kalsium i målrettede cellepopulasjoner. Deres store signal-støy-forhold gjør GECI til et kraftig verktøy for å oppdage stimulus-fremkalt aktivitet i sensoriske nevroner. GECIs letter populasjonsnivåanalyse av stimuluskoding med antall nevroner som kan studeres samtidig. Denne populasjonskodingen gjøres mest hensiktsmessig in vivo. Dorsal rotganglia (DRG), som huser soma av sensoriske nevroner som innerverer somatiske og viscerale strukturer under nakken, brukes mest omfattende for in vivo-avbildning fordi disse strukturene nås relativt enkelt. Mer nylig ble denne teknikken brukt hos mus for å studere sensoriske nevroner i trigeminal ganglion (TG) som innerverer orale og kraniofaciale strukturer. Det er mange grunner til å studere TG i tillegg til DRG, inkludert den lange listen over smertesyndromer som er spesifikke for orale og kraniofaciale strukturer som ser ut til å gjenspeile endringer i sensorisk nevronaktivitet, som trigeminusnevralgi. Mus brukes mest i studien av DRG- og TG-nevroner på grunn av tilgjengeligheten av genetiske verktøy. Men med forskjeller i størrelse, enkel håndtering og potensielt viktige artsforskjeller, er det grunner til å studere rotte i stedet for mus TG-nevroner. Dermed utviklet vi en tilnærming for avbildning av rotte TG-nevroner in vivo. Vi injiserte nyfødte valper (p2) intraperitonealt med en AAV-kodende GCaMP6s, noe som resulterte i >90% infeksjon av både TG- og DRG-nevroner. TG ble visualisert hos voksne etter kraniotomi og dekortikasjon, og endringer i GCaMP6s fluorescens ble overvåket i TG-nevroner etter stimulering av mandibulære og maksillære regioner i ansiktet. Vi bekreftet at økning i fluorescens var stimulusfremkalt med perifer nerveblokade. Selv om denne tilnærmingen har mange potensielle bruksområder, bruker vi den til å karakterisere underpopulasjonen (e) av TG-nevroner endret etter perifer nerveskade.

Introduction

Somatosensasjon, den nevrale kodingen av mekaniske, termiske og kjemiske stimuli som påvirker huden eller andre kroppslige strukturer, inkludert muskler, bein og innvoller, starter med aktivitet i primære afferente nevroner som innervererdisse strukturene. Enkeltenhetsbaserte elektrofysiologiske tilnærminger har gitt et vell av informasjon om de afferente subtypene som er involvert i denne prosessen, samt hvordan deres stimulusresponsegenskaper kan endres over tid 1,2,3. Imidlertid, mens det fortsatt er sterke bevis til støtte for den merkede linjeteorien, som antyder at spesifikke sensoriske modaliteter formidles av spesifikke underpopulasjoner av nevroner, antyder evnen til mange underpopulasjoner av nevroner til å reagere på de samme typene mekaniske, termiske og kjemiske stimuli at flertallet av somatosensoriske stimuli er kodet av flere underpopulasjoner av nevroner4, 5. Dermed vil en bedre forståelse av somatosensasjon bare komme med evnen til å studere aktiviteten til 10, om ikke hundrevis, av nevroner samtidig.

Fremskritt i optiske tilnærminger med den relativt nylige adventen av konfokale og senere multifoton og digitale bildebehandlingsteknikker har gjort det lettere å utføre relativt ikke-invasive populasjonsnivåanalyser av nevronaktivitet 6,7. En av de siste hindringene i anvendelsen av denne teknologien har vært utviklingen av verktøy for å muliggjøre optisk vurdering av nevral aktivitet. Gitt hastigheten til et handlingspotensial som kan starte og slutte på mindre enn et millisekund, vil et spenningsfølsomt fargestoff med kapasitet til å følge endringer i membranpotensial ved hastigheten til et handlingspotensial være det ideelle verktøyet for dette formålet. Men mens det har vært enorm fremgang på dette området 7,8,9,10, er signal-støy-forholdet for mange av disse fargestoffene fortsatt ikke helt høyt nok til å muliggjøre en populasjonsanalyse av hundrevis av nevroner på enkeltcellenivå. Som en alternativ tilnærming har etterforskere vendt seg til å overvåke endringer i intracellulær Ca2+ konsentrasjon ([Ca2 +] i). Begrensningene med denne strategien har vært klare fra starten og inkluderer det faktum at en økning i [Ca2+] i er et indirekte mål på nevral aktivitet11; at en økning i [Ca2+]i kan forekomme uavhengig av Ca2+ tilstrømning assosiert med aktivering av spenningsstyrte Ca2+ kanaler (VGCC) 12,13; at størrelsen og varigheten av en Ca2+ forbigående kan styres av prosesser uavhengig av VGCC-aktivitet 11,12,14; og at tidsforløpet til Ca2+ transienter langt overstiger et handlingspotensial15. Likevel er det en rekke betydelige fordeler forbundet med bruk av Ca2+ som et indirekte mål for nevral aktivitet. Ikke minst av disse er signal-støy-forholdet forbundet med de fleste Ca2+ indikatorer, noe som reflekterer både størrelsen på endringen i intracellulær Ca2+ og det faktum at signalet oppstår fra cytosolens tredimensjonale rom i stedet for det todimensjonale rommet til cellemembranen. Videre, med utviklingen av genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECI), er det mulig å dra nytte av genetiske strategier for å drive ekspresjonen av Ca2+ -indikatorene i spesifikke underpopulasjoner av celler, noe som letter populasjonsnivåanalyser i intakte preparater (f.eks. se16).

Gitt antall genetiske verktøy som nå er tilgjengelige hos mus, bør det ikke være noen overraskelse at GECI har blitt brukt mest omfattende i denne arten. Muselinjer med konstitutivt GECI-uttrykk i subpopulasjoner av sensoriske nevroner er utviklet 7,16,17. Med utviklingen av muselinjer som uttrykker rekombinaser i spesifikke celletyper, er det mulig å bruke enda mer sofistikerte strategier for å kontrollere GECI-uttrykk15. Men mens disse verktøyene blir stadig kraftigere, er det flere grunner til at andre arter, som rotter, kan være mer hensiktsmessige for noen eksperimentelle spørsmål. Disse inkluderer den større størrelsen, noe som letter en rekke eksperimentelle manipulasjoner som er vanskelige, om ikke umulige, i den mindre musen; det enkle å trene rotter i relativt komplekse atferdsoppgaver; Og i det minste noen bevis på at biofysiske egenskaper og uttrykksmønstre av flere ionekanaler i rotte sensoriske nevroner kan være mer lik det som observeres i menneskelige sensoriske nevroner enn de samme kanalene i mus i forhold til mennesket18.

Mens transduksjon av somatosensoriske stimuli vanligvis forekommer i perifere terminaler av primære afferenter, må aksjonspotensialet initiert i periferien passere gjennom strukturen som huser primær afferente somata, referert til som dorsalrot (DRG) eller trigeminal (TG) ganglier før de når sentralnervesystemet19. Selv om det er bevis for at ikke alle handlingspotensialer som forplanter seg langs et primært afferente akson, vil invadere cellelegemet20, en konsekvens av det faktum at den primære afferente somata er koblet til hovedafferente aksonet via et T-kryss19, ser det ut til at flertallet av handlingspotensialene initiert i periferien invaderer soma21. Dette gir tre eksperimentelle fordeler ved bruk av GECI for å vurdere populasjonskoding i primære afferenter: den store størrelsen på cellelegemet i forhold til aksonene øker signalet til støy ytterligere ved bruk av [Ca2 +] i som et indirekte mål på afferente aktivitet; DRG er generelt lett tilgjengelig; Og vurdering av aktivitet på et sted som er romlig fjernt fra de afferente terminalene, minimerer den potensielle effekten av operasjonen som trengs for å eksponere gangliene på stimulus-responsegenskapene til de afferente terminalene. Men fordi TG ligger under hjernen (eller over paletten), er de langt vanskeligere å få tilgang til enn DRG. Videre, mens det er mange likheter mellom DRG og TG nevroner, er det en voksende liste over forskjeller også. Dette inkluderer den grovt sett somatotopiske organiseringen av nevroner i TG22, unike strukturer innervert, forskjellige sentrale terminale termineringsmønstre 23,24,25,26, og nå en voksende liste over forskjeller i både genuttrykk27,28 og funksjonell reseptoruttrykk29. I tillegg, fordi vi er interessert i identifisering av perifere mekanismer for smerte, antyder det relativt store antallet smertsyndrom som synes å være unikt for trigeminalsystemet (f.eks. Migrene, trigeminusnevralgi, brennende munnsyndrom) som synes å involvere avvikende aktivitet i primære afferenter 30,31,32, at TG må studeres direkte.

Således, mens stimulus-responsegenskapene til TG-nevroner har blitt studert med GECI i musen16, fordi årsakene nevnt ovenfor tyder på at rotta kan være en mer passende art for å løse en rekke eksperimentelle spørsmål, var formålet med denne studien å utvikle en tilnærming til å bruke GECI til å studere TG-nevroner hos rotter. For å oppnå dette brukte vi en viral tilnærming for å drive uttrykket av GECI GCaMP6s i det perifere nervesystemet. Vi fjernet deretter forhjernen for å gi tilgang til TG. Til slutt ble mekaniske og termiske stimuli påført ansiktet mens nevronresponser ble vurdert under fluorescerende mikroskopi. Sammen støtter disse dataene en rolle for å utnytte rotta til å undersøke endringer i TG under mange stater, og utvide verktøykassen for etterforskere som er interessert i sensorisk koding i trigeminalsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer bruk av dyr i forskning ble utført i samsvar med standarder fastsatt av National Institutes of Health og International Association for the Study of Pain og ble godkjent av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 22051100). På slutten av hvert eksperiment ble rotter euthanized via exanguination med hjerteperfusjon av iskald fosfatbufret saltvann (PBS), en tilnærming godkjent av American Veterinary Medical Association og University of Pittsburgh IACUC.

1. GCaMP-induksjon

  1. Bestill tidsgravide Sprague Dawley-rotter slik at valper kan injiseres på riktig tidspunkt etter fødselen.
  2. Spray hanskene med 70% EtOH før du håndterer hver rottepuppe. Dette vil avskrekke demningen fra å kannibalisere de unge.
  3. Vattpinnerottepupper (P1-2) med 70% EtOH og bedøves på is i 3 min.
  4. Injiser 15 mikrol AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) intraperitonealt ved hjelp av en 25 μL steril, gasstett Hamilton sprøyte.

2. Trigeminal ganglion eksponering kirurgi

  1. Administrer anestesicocktail (55 mg/kg ketamin, 5,5 mg/kg xylazin, 1 mg/kg acepromazin) intraperitonealt basert på kroppsvekt til 6-8 uker gamle rotter (ca. 150-200 g).
    MERK: Dette er vanligvis tilstrekkelig til å opprettholde et kirurgisk anestesiplan vurdert ved fravær av abstinensrefleks til skadelig klype av en bakpote. Suppler imidlertid med isofluran via en nesekjegle hvis dyrene blir lette.
  2. Når den er fullstendig bedøvet, barberer du håret og værhårene i hodet og ansiktet.
  3. Monter rotta på en stereotaksisk ramme med ørestenger og plasser en varmepute (~ 37 oC) under for å opprettholde kroppstemperaturen.
  4. Overvåk vitale tegn (hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, oksygenmetning i blodet) med et museoksymeter eller sammenlignbart.
    MERK: Kroppstemperaturen overvåkes av en rektal sonde og opprettholdes ved å plassere rotter på et tilbakemeldingskontrollert sirkulerende vannteppe.
  5. Plasser gasbind dyppet i iskald saltvann på hodet for å innsnevre blodkar for å minimere blødning. Ved hjelp av en skalpell i størrelse 15, gjør du et midtlinjesnitt av huden og muskelen over skallen.
  6. Bruk stump disseksjon av hud og muskel for å avsløre skallen.
  7. Bruk en 1/4 rund borekrone, perforer forsiktig skallehetten for å eksponere forhjernen. Bruk deretter rongeurs (2,5 mm kopp) for å forsiktig kutte gjennom skallen.
  8. Bruk en skalpell i størrelse 15, gjør et snitt i hjernen (Bregma: -3,80) og olfaktorisk pære.
    MERK: Å kutte mer caudalt forbi dette punktet vil resultere i rottedød
  9. Bruk en slikkepott for å forsiktig koble dura fra skallen og forsiktig løfte den avskårne hjernen for å avsløre TG og bunnen av skallen.
    MERK: Ytterligere bruk av iskald saltvannsperfusjon gjennom ekstraksjonen vil minimere blødning og optimalisere følgende disseksjonsfelt.
  10. Ved hjelp av en cautery penn, stamme eventuelle blødninger som følge av ekstraksjon.
    MERK: Kutting av dura vil resultere i uunngåelig blødning. Det er best å tilberede iskald aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukose, 2,5 mM CaCl2) for å bade skallehulen for å bidra til å innsnevre blodkar samtidig som nevronhelsen opprettholdes.

3. GCaMP6s bildebehandling

MERK: Gitt størrelsen og tettheten til disse nevronene, vil bilde- og datainnsamlingssystemet som brukes (objektiv, mikroskop, lyskilde, kamera) bestemme antall GECI + -celler som visualiseres. Lyskilden, målet og kameraet vil også bestemme parametrene som brukes til bildeopptak, inkludert eksponeringstid og bildeopptakshastighet. Mens multifoton og konfokalteknikker kan brukes avhengig av eksperimentets parametere, kan epifluorescensmikroskopi være tilstrekkelig til å løse mange celler. Enhver bildeinnsamlingspakke kan brukes. Ideelt sett er stimulusapplikasjonen tidslåst med programvarepakken for bildeoppkjøp.

  1. Plasser hodeskallehulen under målet og bring TG i fokus ved hjelp av synlig lys.
  2. Eksitasjonsbølgelengden til GCaMP6s er 496 nm, og dens utslippsbølgelengde er 513 nm; Bruk derfor passende dikroiske og filterkuber for å finne GCaMP+ celler. Juster fokuset for å lokalisere og løse området av ganglia der nevroner reagerer på stimuli som brukes på det mottakelige interesseområdet.
  3. Bruk et 10x mål for å muliggjøre visualiseringer av de fleste nevroner i TG som reagerer på mekaniske stimuli påført en 1 cm2 region i ansiktet16. Bruk et 20x tørt objektiv med lang arbeidsavstand (10,8 mm) for å øke oppløsningen.
  4. Bruk anskaffelsesprogramvare (f.eks. Metamorph) til å samle inn fluorescensdata over tid og som svar på stimulusapplikasjon.
    1. For å minimere fotobleking av nevronene, bruk så kort eksponeringstid som mulig for å oppdage baseline og fremkalt økning i fluorescens. Med 20x, 0.40 NA luftmålet, en 120 W kvikksølvhalogenid lyskilde og et komplementært metalloksid-halvlederkamera (CMOS) som ble brukt i denne studien, en eksponeringstid på 300 ms og en bildeinnsamlingshastighet på 3 Hz, oppnår stabile baselineopptak i >90 minutter.
      MERK: 1) Disse parameterne for bildeopptak må bestemmes empirisk. 2) Mekanisk (børste, punktering, vibrasjon, klype), termisk (varme og kulde) og kjemisk (capsaicin, mentol, inflammatoriske mediatorer) kan påføres det mottakelige feltet. En relativt billig subjektiv tilnærming er å bruke stimuli for hånd. Mer objektive og reproduserbare tilnærminger anbefales imidlertid, der feedback-kontrollerte aktuatorer kan brukes til gjentatt bruk ved en kjent kraft. Mens tilbakemeldingsstyrte Peltier-enheter er nyttige for kontrollert oppvarming og kjøling, er de ikke ideelle for termisk stimulering av et buet ansikt. Feedback-kontrollerte infrarøde lyskilder er et alternativ for oppvarming, og kaldspray er et mindre enn ideelt alternativ for kjøling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordi vi tidligere har hatt suksess med AAV9-serotypen for infeksjon av sensoriske nevroner hos rotter15, brukte vi denne serotypen for ekspresjon av GCaMP6s i rotte TG-nevroner. Vi søkte derfor først å vurdere sensorisk nevroninfeksjonseffektivitet av AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) da dette viruset ble administrert til nyfødte rotteunger20. Dette viruset bruker CAG-promotoren, som driver og opprettholder høye nivåer av genuttrykk. Videre har AAV9 vist seg å infisere sensoriske nevroner effektivt når det gis til nyfødte rotter33. De første injeksjonene benyttet 5 μL hos avkom på postnatal dag 5 (p5), noe som resulterte i ca. 51,66 % ± 14,33 % effektivitet (figur 1A). For å øke infeksjonsraten brukte vi etter hvert et større volum virus (15 μL) hos yngre rotter (p2), og holdt virustiteren på 2,4 x 1014 den samme. Denne strategien resulterte i 91,84 % ± 3,18 % (n = 8) av nevronene infisert (figur 1B).

For å visualisere TG-nevronene som innerverer vibrissalputen, utviklet vi deretter en kirurgisk strategi for å eksponere TG in vivo. Omtrent 60% av forhjernen kan fjernes uten å påvirke store respiratoriske sentre. Dette tilsvarer hjernevev rostral til Bregma -3,80. Et skjema over den eksponerte TG (venstre) og innerveringsterritoriet til infraorbitalnerven (ION, høyre) er vist i figur 2. Regionen av TG som gir opphav til innervasjonen av vibrissalputen ble bestemt ved bruk av lett mekanisk stimulering (børste) på vibrissalputen mens endringer i fluorescens overvåkes ved 20x. Som spådd var V2-regionen av TG, som innerverer den maksillære delingen av ansiktet, det eneste området som ble aktivert. Det vil si at selv om det ikke ble studert systematisk, var det ingen endringer i fluorescens oppdaget som respons på stimuli påført V1 (hud på pannen) eller V3 (hud på mandibelen) regioner når nevronene som studeres kunne aktiveres med stimuli påført vibrasjonsputen påført vibrasjonspute. Endringer i fluorescens ved baseline og som respons på stimuli påført vibrissalputen ble deretter overvåket. Interesseområdet (V2) er avgrenset i figur 3A. I samsvar med tidligere rapporter om relativt lav hvileaktivitet i sensoriske nevroner34 var hvilefluorescens relativt lav i de fleste nevroner, og det var lite tegn til spontan økning i fluorescens (figur 3B). Kriteriene som brukes for å identifisere stimulus-fremkalt aktivitet i nevroner i periferien 6,16,21 og CNS 12,35,36 er et utviklende felt med flere sofistikerte arbeidsflytpakker som har blitt gjort fritt tilgjengelig 37,38. En fullstendig diskusjon av styrker og svakheter ved de ulike tilnærmingene som er anvendt, ligger utenfor rammen av dette manuskriptet. Siden dette ikke var fokus for denne studien, brukte vi relativt vilkårlige og subjektive kriterier basert på toppresponsen observert i regioner av ganglia der det ikke var klart påviselige nevroner (basert på evnen til å se kjernen), slik at et nevron ble ansett som lydhør overfor en stimulus hvis økningen i fluorescens var tidslåst til stimulusapplikasjonen (økning i fluorescens oppdaget innen 1 s av stimulusapplikasjon ( basert på antagelsen om at et aksjonspotensial initiert i de langsomste ledende aksonene (0,2 m/s) initiert på et sted ikke mer enn 3 cm fra cellekroppen skulle nå cellekroppen på mindre enn et sekund), og var >6 ganger standardavviket til toppresponsen (ΔF/F), detekterte et kontrollsted (figur 3C). Deretter karakteriserte vi responsegenskapene til disse nevronene til naturlige stimuli: børste, punktering, varme og kulde. Eksempler på responser på hver av disse stimuli er vist i figur 4. Spesielt har responsen på punktert stimulering, som oftest brukes i smerterelaterte studier, den mest robuste responsen (figur 4B,F).

Vårt mål med å utvikle denne teknikken var å kunne vurdere endringer i populasjonskoding i TG-nevroner. Dermed tilpasset vi den kroniske innsnevringsskaden til ION (CCI-ION), som tidligere ansatt29, for å studere rotter 2 uker etter nerveskade. Etter induksjon av modellen eksponerte vi TG og vurderte hvilende og fremkalt aktivitet i TG ipsilateralt og kontralateralt til skadestedet. Interessant nok ble størrelsen på den toppfremkalte responsen på pensel økt ~ 2 ganger på den nerveskadede siden i forhold til toppresponsen på den samme stimulansen som ble brukt på den kontralaterale siden (figur 5A-C). Videre, når to børstestimuli ble påført i serie (med et interstimulusintervall på 10 s), var det en signifikant forsterkning av størrelsen på responsen på den andre stimulansen på den skadede, men ikke uskadde siden (figur 5D).

Til slutt, som et første kontrolleksperiment for å bekrefte at den stimulusfremkalte økningen i fluorescens skyldtes aksjonspotensialer initiert i periferien, vurderte vi effekten av tetrodotoksin (1 μM) på stimulusfremkalte responser. TTX ble injisert i et volum på 200 μL perkutant som beskrevet tidligere28 for å målrette infraorbitalnerven. Som vist i figur 6 ble fremkalt aktivitet nesten helt eliminert. Til sammen demonstrerer disse resultatene nytten av å bruke AAV9-GCaMP til å undersøke TG-populasjonsresponser in vivo.

Figure 1
Figur 1: Høy effektivitet av GCaMP6s-infeksjon i TG-nevroner med neonatal AAV-injeksjon. (A) P5 rotteunger ble injisert med 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titer: 2,4 x 1014) virus intraperitonealt: GCaMP6s uttrykk ble påvist i 51,7 ± 14,3 % av TG-nevronene (n = 3 skiver per dyr, 7 rotter). (B) Økning av injeksjonsvolumet til 15 μL hos yngre dyr (p2) forbedret infeksjonseffektiviteten: GCaMP6s uttrykk ble detektert i 91,8 ± 3,2% av TG-nevronene (n = 3 skiver per dyr, 8 rotter). Paneler til venstre ble farget for GCaMP6s. Paneler i midten ble farget med NeuN, en nevronspesifikk markør. Paneler til høyre er et sammenslått bilde av GCaMP6s og NeuN paneler. Skalalinjen i det første panelet er den samme for alle påfølgende paneler. Grafen til høyre er et plott av GCaMP6s uttrykk (gjennomsnittlig ± SEM) som en prosentandel av det totale antall nevroner per skive per dyr, hvor de enkelte punktene er dataene for hvert dyr. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Lokalisasjon av ganglion trigeminus (TG), nervus infraorbitalis (ION) og ansiktsområde (vibrissalpute) stimulert. (A) Forhjernen ble fjernet for å muliggjøre tilgang til TG. (B) Område av ansiktet der naturlige stimuli ble påført i forhold til ION og TG. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Stimulus-fremkalt økning i GCaMP6s fluorescens. (A) Totalt synsfelt under 20x forstørrelse. Oftalmiske (V1) og maksillære (V2) divisjoner av TG er indikert. (B,C) Området i esken er vist i panelene B og C, som er fluorescensbilder før og etter børstestimulering av vibrissalputen. Hvite sirkler er komparatorregioner av interesse. Nevroner ble ansett som lydhøre overfor en stimulus basert på toppendringen i fluorescens observert i komparatorområder av interesse som beskrevet i teksten. Skalastangen i det første panelet er den samme for begge panelene. (D) Representative endringer i fluorescens av nevroner vist i B og C som respons på en børstestimulus påført ansiktet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Klassifisering av nevroner basert på deres respons på stimuli påført ansiktet. Representative bilder av TG-nevroner før (topppaneler - Baseline) og etter (midtpanel - Stimulering) av svar på en 1 cm kamelhårbørste (A - Børste), 1 cm2 rutenett av monofilamenter (B - Punktert), oppvarming (C - Varme) og kjøling (D - Kaldt) påført samme region i ansiktet. Skalalinjen i det første panelet er den samme for alle påfølgende paneler. Oransje sirkler betegner et eksempel på et responsivt nevron. Hvite sirkler er komparatorregioner av interesse. (E-H) Representative spor av hver respons per stimulus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Nerveskade øker børstefremkalte responser i TG-nevroner. Typiske responser av TG-nevroner til børste påføres to ganger på rotteansiktet på siden kontralateralt til en kronisk innsnevringsskade av infraorbitalnerven (A, Contra) eller til siden ipsilateralt til nerveskaden (B, Ipsi). (C) Analyse av samlede data fra responsive nevroner fra seks rotter (data plottet er per rotte) bekreftet at forskjellen i størrelsen på den første responsen på børste var signifikant (paret t-test). (D) Når toppresponsen på første og andre stimulusapplikasjon ble analysert som et forhold (R2/R1), bekreftet analyse av de samlede dataene at økningen i responsforholdet på den nerveskadede siden var signifikant. ** p < 0.01 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Blokk av fremkalt aktivitet i TG-nevroner med tetrodotoksin (TTX). (A) Fluorescensdata fra TG-nevroner ipsilaterale til en nerveskade etter injeksjon av TTX (200 μL, 1 μM) ved siden av infraorbitalnerven etter påføring av en børstestimulus (blå søyle). (B) Samlede toppresponsdata fra tre rotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi en rask, ikke-invasiv måte å generere en GECI-rotte for avbildning av TG. Vi valgte en CAG-promotor for å drive og opprettholde høye nivåer av genuttrykk. Mens tidligere studier tyder på at andre AAV-serotyper effektivt kan drive genuttrykk i DRG-nevroner39, samsvarer resultatene våre med en nylig studie med intraperitoneal injeksjon av AAV hos nyfødte32, noe som indikerer at AAV9-serotypen er svært effektiv ved infeksjon av sensoriske nevroner hos rotter.

Gjennom feilsøking av denne teknikken er det verdt å merke seg noen fallgruver som kan forhindre optimal infeksjon. Den viktigste variabelen å huske på er valpens alder. Rottenervesystemet utvikler seg raskt i løpet av de første 7 dagene postnatalt40. Vi forsøkte infeksjoner på senere tidspunkt (f.eks. p4-7), noe som resulterte i variabel og dårlig effektivitet. Tidligere tidspunkter (p1-4) gir mer robust og konsistent effektivitet, med p1-2 som gir de høyeste infeksjonsratene. Den andre variabelen er injeksjonsvolumet. Uansett alder var det nødvendig med minimum 15 μL for å produsere mer enn 70% effektivitet i TG eller DRG med en titer på 2,5 x 1014. Vi fant at, selv ved p2, gir intraperitoneale injeksjoner på mindre enn 10 μL svært lite uttrykk hos den voksne. Det er mulig at mer lokaliserte injeksjoner, dvs. direkte inn i det mottakelige interessefeltet, ved lavere volumer ville gi lignende effekter. Imidlertid vil denne tilnærmingen kreve at valper er fullt bedøvet og kan forårsake traumer i vevet av interesse. Til slutt er det mulig at mindre volumer kan brukes med høyere titer.

Eksponering av TG for GECI-avbildning har tidligere blitt utført på mus16. Å oversette denne tilnærmingen til rotta avslørte imidlertid flere problemer som er verdt å vurdere. For det første er tykkelsen på skallen og dura i rotta mye større enn i en mus. Derfor kan det by på utfordringer å fjerne hodeskallehetten. Vi fant ut at en liten drill er en effektiv måte å perforere skallehetten på, som deretter kan fjernes med rongeurs. Et annet problem er blødning når hjernen er fjernet. Dette kan være et fortsatt problem for både preparatets levetid og klarheten i avbildningen, om ikke egenskapene til nevronene. Gasbind dyppet i iskald CSF kan påføres den eksponerte overflaten av hjernen for å bidra til å lukke hovedarteriene. Bruk av en liten cautery penn kan også være effektiv i å stanse ytterligere blødning. Endelig kan Gelfoam som ligger på den kontralaterale siden av bildevinduet også bidra til å forhindre blod og CSF fra å forårsake bildeproblemer. En tredje vurdering er mengden hjerne som skal fjernes. Vi fant at fjerning av hjernen caudal til ~ Bregma -3,80 vil resultere i død innen en time etter fjerning. Dermed bør hjernen fjernes i små seksjoner, og holde så mye som mulig mens du eksponerer så mye av TG som mulig.

Som nevnt i innledningen er [Ca2+] i et indirekte mål på nevronaktivitet, og følgelig betyr en økning i [Ca2+] i ikke nødvendigvis at det er en økning i nevral aktivitet. Dermed er kontrolleksperimenter avgjørende for å bekrefte at det som anses som fremkalt aktivitet, faktisk er aktivitet i seg selv. For eksempel bør elektrisk fremkalte stimuli produsere en tidslåst økning i [Ca2+]i, som er på samme skala som naturlig fremkalte stimuli. Det er viktig at denne aktiviteten elimineres med nerveblokken (dvs. TTX). Det er imidlertid også viktig å merke seg at til tross for disse viktige kontrollene, er det fortsatt mulig at noen av de tilsynelatende fremkalte økningene i [Ca2+]i skyldes signalering i gangliene, for eksempel på grunn av senderfrigjøring i ganglia41, snarere enn på grunn av et aksjonspotensial initiert i periferien som har invadert cellesoma.

Mens resultatene våre bekrefter at av tidligere etterforskere 16,42,43 som indikerer signal-støy-forholdet assosiert med endringer i GCaMP-fluorescens i sensorisk somata, er tilstrekkelig for bruk med et standard epifluorescensmikroskop, kan manipulasjoner som nerveskaden som ble brukt i denne studien være forbundet med slike dramatiske endringer i nevronaktivitet og Ca 2 + signalering34, at responser gjennom ganglia kan være forbundet med en så stor økning i tilsynelatende bakgrunn, at responsene til individuelle nevroner kan bli kunstig dempet. Mens bildebehandlingsmetoder er utviklet som kan bidra til å løse denne begrensningen44, kan konfokal eller multifotonavbildning være nødvendig for å løse dette problemet mest effektivt.

Samlet gir denne teknikken en tilnærming for å undersøke stimulus-responsegenskapene til TG-nevroner hos rotter på populasjonsnivå. Våre resultater med CCI av ION bekrefter muligheten for å oppdage endringer i disse stimulus-respons-egenskapene. Mens bare mekaniske og termiske stimuli ble ansatt i denne studien, bør dette preparatet være mottagelig for anvendelse av kjemiske stimuli for fullt ut å definere stimulus-responsegenskapene til TG-nevroner. På samme måte, mens vi fokuserte på stimulus-responsegenskaper hos kutane afferenter, på grunn av fremveksten av slike fenomener som dynamisk mekanisk allodyni etter traumatisk skade på en kutan nerve, bør det også være mulig å oppdage endringer i egenskapene til afferenter som innerverer andre kraniofaciale strukturer som det temporomandibulære leddet (som svar på uskyldige vs. skadelige kjevebevegelser), hornhinne eller tunge. Perifer injeksjon av AAV9-serotypen muliggjør nevronspesifikk induksjon av GCaMP som er PNS-spesifikk. En stor fordel med denne strategien er at viral merking gir et robust, vedvarende uttrykk i postmitotiske celler (dvs. nevroner), men ikke i mitotiske celler (f.eks. epitelceller). I tillegg indikerer foreløpig screening av forskjellige PNS-vev at denne virale strategien også kan brukes til å undersøke para / sympatiske ganglier, DRG og enteriske nervesystemer (data ikke vist).

Dette in vivo-preparatet gir også grunnlaget for å utforske mange sammenligninger som mangler i dagens litteratur. In vivo populasjonsstudier mellom rotte-TG og DRG, rotte vs. mus-TG, er ennå ikke gjennomført. Dataene som presenteres her illustrerer den nye muligheten for at disse viktige eksperimentene skal gjennomføres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Gold mottok stipendstøtte fra Grunenthal under utviklingen av dette preparatet. Det var ingen overlapping i fokus for Grunenthal-studien og forberedelsen beskrevet i dette manuskriptet. Ingen av de andre forfatterne har andre potensielle interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Kathy Albers og Brian Davis for bruken av deres Leica Microscope og Metamorph program, Charles Warwick for å hjelpe til med å bygge vår termiske Peltier enhet, og Dr. Raymond Sekula for hjelp med feilsøking av kirurgisk forberedelse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) og R01NS122784 (MSG og RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 204
<em>In Vivo</em> Kalsiumavbildning av sensoriske nevroner i rotte trigeminal ganglion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter