Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Abstract

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), hedeflenen hücre popülasyonlarında hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri izlemek için görüntüleme tekniklerini sağlar. Büyük sinyal-gürültü oranları, GECI'leri duyusal nöronlarda uyaranla uyarılan aktiviteyi tespit etmek için güçlü bir araç haline getirir. GECI'ler, aynı anda incelenebilen nöron sayısı ile uyaran kodlamasının popülasyon düzeyinde analizini kolaylaştırır. Bu popülasyon kodlaması en uygun şekilde in vivo olarak yapılır. Boynun altındaki somatik ve viseral yapıları innerve eden duyusal nöronların somasını barındıran dorsal kök gangliyonları (DRG), bu yapılara nispeten kolay erişilebildiği için en yaygın olarak in vivo görüntülemede kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bu teknik farelerde oral ve kraniyofasiyal yapıları innerve eden trigeminal gangliondaki (TG) duyusal nöronları incelemek için kullanıldı. DRG'ye ek olarak, trigeminal nevralji gibi duyusal nöron aktivitesindeki değişiklikleri yansıtıyor gibi görünen oral ve kraniyofasiyal yapılara özgü ağrı sendromlarının uzun listesi de dahil olmak üzere TG'yi incelemek için birçok neden vardır. Fareler, genetik araçların mevcudiyeti nedeniyle DRG ve TG nöronlarının çalışmasında en yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, boyut, kullanım kolaylığı ve potansiyel olarak önemli tür farklılıklarındaki farklılıklarla, fare TG nöronlarından ziyade sıçanları incelemek için nedenler vardır. Bu nedenle, sıçan TG nöronlarını in vivo görüntülemek için bir yaklaşım geliştirdik. Yenidoğan yavrularına (p2) intraperitoneal olarak GCaMP6'ları kodlayan bir AAV enjekte ettik ve hem TG hem de DRG nöronlarının %>90 enfeksiyonu ile sonuçlandı. Kraniyotomi ve dekortikasyonu takiben erişkinlerde TG görüntülendi ve yüzün mandibular ve maksiller bölgelerinin uyarılmasını takiben TG nöronlarında GCaMP6s floresansındaki değişiklikler izlendi. Floresanstaki artışların periferik sinir bloğu ile uyaran olarak uyarıldığını doğruladık. Bu yaklaşımın birçok potansiyel kullanımı olsa da, periferik sinir hasarını takiben değişen TG nöronlarının alt popülasyonlarını karakterize etmek için kullanıyoruz.

Introduction

Cilde veya kaslar, kemik ve iç organlar dahil olmak üzere diğer vücut yapılarına etki eden mekanik, termal ve kimyasal uyaranların sinirsel kodlaması olan somatosensation, bu yapıları innerve eden birincil afferent nöronlardaki aktivite ile başlar1. Tek birim tabanlı elektrofizyolojik yaklaşımlar, bu süreçte yer alan afferent alt tipler ve bunların uyaran-tepki özelliklerinin zaman içinde nasıl değişebileceği hakkında zengin bilgiler sağlamıştır 1,2,3. Bununla birlikte, spesifik duyusal modalitelerin nöronların spesifik alt popülasyonları tarafından taşındığını öne süren etiketli çizgi teorisini destekleyen güçlü kanıtlar olsa da, birçok nöron alt popülasyonunun aynı tür mekanik, termal ve kimyasal uyaranlara yanıt verme yeteneği, somatosensoriyel uyaranların çoğunun nöronların çoklu alt popülasyonları tarafından kodlandığını göstermektedir4, 5. Bu nedenle, somatosensasyonun daha iyi anlaşılması, yalnızca yüzlerce olmasa da 10'larca nöronun aktivitesini aynı anda inceleme yeteneği ile gelecektir.

Konfokal ve daha sonra multifoton ve dijital görüntüleme tekniklerinin nispeten yakın zamanda ortaya çıkmasıyla optik yaklaşımlardaki ilerlemeler, nöronal aktivitenin nispeten invaziv olmayan popülasyon düzeyinde analizlerini gerçekleştirme yeteneğini kolaylaştırmıştır 6,7. Bu teknolojinin uygulanmasındaki son engellerden biri, nöral aktivitenin optik değerlendirmesini sağlayacak araçların geliştirilmesi olmuştur. Bir milisaniyeden daha kısa sürede başlayıp bitebilen bir aksiyon potansiyelinin hızı göz önüne alındığında, bir aksiyon potansiyeli hızında membran potansiyelindeki değişiklikleri takip etme kapasitesine sahip voltaja duyarlı bir boya bu amaç için ideal bir araç olacaktır. Ancak bu alanda muazzam bir ilerleme kaydedilmiş olsa da 7,8,9,10, bu boyaların çoğu için sinyal-gürültü oranı, tek hücre düzeyinde yüzlerce nöronun popülasyon analizini mümkün kılacak kadar yüksek değildir. Alternatif bir yaklaşım olarak, araştırmacılar hücre içi Ca2 + konsantrasyonundaki ([Ca2 +] i) değişiklikleri izlemeye yöneldiler. Bu stratejiyle ilgili sınırlamalar en başından beri açıktı ve [Ca2 +] i'deki bir artışın nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olduğugerçeğini içeriyor 11; voltaj kapılı Ca 2+ kanallarının (VGCC'ler) aktivasyonu ile ilişkili Ca2+ akışından bağımsız olarak [Ca2 +] i'de bir artışın meydana gelebileceğini12,13; bir Ca2+ geçici olayının büyüklüğünün ve süresinin, VGCC aktivitesinden bağımsız süreçler tarafından kontrol edilebileceğini, 11,12,14; ve Ca2+ geçici akımlarının zaman seyrinin, bir aksiyon potansiyelininkinden çok daha fazlaolduğunu 15. Bununla birlikte, nöral aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak Ca2 + kullanımıyla ilişkili bir dizi önemli avantaj vardır. Bunlardan en önemlisi, hem hücre içiCa2+'daki değişimin büyüklüğünü hem de sinyalin hücre zarının iki boyutlu uzayından ziyade sitozolün üç boyutlu uzayından kaynaklandığı gerçeğini yansıtan çoğu Ca2+ göstergesiyle ilişkili sinyal-gürültü oranıdır. Ayrıca, genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerinin (GECI'ler) geliştirilmesiyle, hücrelerin belirli alt popülasyonlarında Ca2+ göstergelerinin ekspresyonunu yönlendirmek için genetik stratejilerden yararlanmak mümkündür, bu da bozulmamış preparatlarda popülasyon düzeyinde analizleri kolaylaştırır (örneğin, bkz.16).

Şu anda farelerde mevcut olan genetik araçların sayısı göz önüne alındığında, GECI'lerin bu türde en yaygın şekilde kullanılması şaşırtıcı olmamalıdır. Duyusal nöronların alt popülasyonlarında yapısal GECI ekspresyonuna sahip fare çizgileri geliştirilmiştir 7,16,17. Belirli hücre tiplerinde rekombinazları ifade eden fare çizgilerinin geliştirilmesiyle, GECI ekspresyonunu kontrol etmek için daha da karmaşık stratejiler kullanmak mümkündür15. Bununla birlikte, bu araçlar her zamankinden daha güçlü olsa da, sıçanlar gibi diğer türlerin bazı deneysel sorular için daha uygun olmasının birkaç nedeni vardır. Bunlar, daha küçük farede imkansız olmasa da zor olan bir dizi deneysel manipülasyonu kolaylaştıran daha büyük boyutu içerir; sıçanları nispeten karmaşık davranışsal görevlerde eğitmenin kolaylığı; ve sıçan duyusal nöronlarındaki çeşitli iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerinin ve ekspresyon modellerinin, insan duyusal nöronlarında gözlemlenenlere, insana göre faredeki aynı kanallardan daha benzer olabileceğine dair en azından bazı kanıtlar18.

Somatosensoriyel uyaranların transdüksiyonu genellikle primer afferentlerin periferik terminallerinde meydana gelirken, periferde başlatılan aksiyon potansiyeli, merkezi sinir sistemine ulaşmadan önce dorsal kök (DRG) veya trigeminal (TG) gangliyonlar olarak adlandırılan primer afferent somataları barındıran yapıdan geçmelidir19. Birincil afferent akson boyunca yayılan her aksiyon potansiyelinin hücre gövdesini20 istila etmeyeceğine dair kanıtlar olsa da, birincil afferent somatların ana afferent aksona bir T-kavşağı19 yoluyla bağlanmasının bir sonucu olarak, periferde başlatılan aksiyon potansiyellerinin çoğu soma21'i istila ediyor gibi görünmektedir. Bu, birincil afferentlerde popülasyon kodlamasını değerlendirmek için GECI'leri kullanırken üç deneysel avantaj sağlar: hücre gövdesinin aksonlara göre büyük boyutu, afferent aktivitenin dolaylı bir ölçüsü olarak [Ca2+]i kullanıldığında sinyalden gürültüye daha da artar; DRG'ye erişim genellikle kolaydır; ve afferent terminallerden uzamsal olarak uzak bir bölgedeki aktivitenin değerlendirilmesi, gangliyonları ortaya çıkarmak için gereken ameliyatın afferent terminallerin uyaran-tepki özellikleri üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirir. Bununla birlikte, TG beynin altında (veya paletin üstünde) bulunduğundan, DRG'den çok daha zordur. Ayrıca, DRG ve TG nöronları arasında birçok benzerlik olsa da, büyüyen bir farklılıklar listesi de vardır. Bu, TG22'deki nöronların kabaca somatotopik organizasyonunu, innerve edilmiş benzersiz yapıları, farklı merkezi terminal sonlandırma modellerini 23,24,25,26 ve şimdi hem gen ekspresyonu 27,28 hem de fonksiyonel reseptör ekspresyonu29'daki artan farklılıklar listesini içerir. Ek olarak, periferik ağrı mekanizmalarının tanımlanmasıyla ilgilendiğimiz için, trigeminal sisteme özgü gibi görünen nispeten fazla sayıda ağrı sendromu (örneğin, migren, trigeminal nevralji, ağız yanması sendromu) primer afferentlerde anormal aktivite içeriyor gibi görünen30,31,32, TG'nin doğrudan incelenmesi gerektiğini düşündürmektedir.

Bu nedenle, TG nöronlarının uyaran-tepki özellikleri farede GECI'lerle çalışılmış olsa da,16, yukarıda listelenen nedenler sıçanın çeşitli deneysel soruları ele almak için daha uygun bir tür olabileceğini düşündürdüğünden, bu çalışmanın amacı, sıçanlarda TG nöronlarını incelemek için GECI'leri kullanmak için bir yaklaşım geliştirmekti. Bunu başarmak için, periferik sinir sisteminde GECI GCaMP6'ların ekspresyonunu yönlendirmek için viral bir yaklaşım kullandık. Daha sonra TG'ye erişime izin vermek için ön beyni çıkardık. Son olarak, yüze mekanik ve termal uyaranlar uygulanırken, nöronal yanıtlar floresan mikroskobu altında değerlendirildi. Birlikte, bu veriler, birçok eyalette TG'deki değişiklikleri araştırmak için sıçanı kullanma rolünü desteklemekte ve trigeminal sistemdeki duyusal kodlama ile ilgilenen araştırmacılar için araç setini genişletmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Araştırmada hayvanların kullanımını içeren tüm deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Uluslararası Ağrı Araştırmaları Derneği tarafından ortaya konan standartlara uygun olarak gerçekleştirildi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (protokol #22051100). Her deneyin sonunda, sıçanlar, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği ve Pittsburgh Üniversitesi IACUC tarafından onaylanan bir yaklaşım olan buz gibi soğuk fosfat tamponlu salinin (PBS) kardiyak perfüzyonu ile ekzaninasyon yoluyla ötenazi yapıldı.

1. GCaMP indüksiyonu

  1. Yavruların doğumdan sonra uygun zamanda enjekte edilebilmesi için zaman hamile Sprague Dawley sıçanlarını sipariş edin.
  2. Her sıçan yavrusuna dokunmadan önce eldivenlere %70 EtOH püskürtün. Bu, barajı gençleri yamyamlaştırmaktan caydıracaktır.
  3. Sıçan yavrularını (P1-2) %70 EtOH ile sürüntü ve 3 dakika boyunca buz üzerinde uyuşturun.
  4. 25 μL steril, gaz geçirmez Hamilton şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) enjekte edin.

2. Trigeminal ganglion maruziyet cerrahisi

  1. 6-8 haftalık sıçanlara (yaklaşık 150-200 g) vücut ağırlığına göre intraperitoneal olarak anestezik kokteyl (55 mg/kg ketamin, 5.5 mg/kg ksilazin, 1 mg/kg asepromazin) uygulayın.
    NOT: Bu genellikle, bir arka pençenin zararlı bir şekilde sıkışmasına karşı bir geri çekilme refleksinin yokluğu ile değerlendirildiği gibi cerrahi bir anestezi düzlemini korumak için yeterlidir. Bununla birlikte, hayvanlar hafif hale gelirse, bir burun konisi yoluyla izofluran takviyesi yapın.
  2. Tamamen uyuşturulduktan sonra, başın ve yüzün saçlarını ve bıyıklarını tıraş edin.
  3. Fareyi kulak çubuklu stereotaksik bir çerçeveye monte edin ve vücut ısısını korumak için altına bir ısıtma yastığı (~ 37 oC) yerleştirin.
  4. Yaşamsal belirtileri (kalp atış hızı, solunum hızı, kan oksijen doygunluğu) bir fare oksimetresi veya benzeri bir cihazla izleyin.
    NOT: Vücut ısısı bir rektal prob ile izlenir ve sıçanlar geri besleme kontrollü bir sirkülasyonlu su battaniyesine yerleştirilerek korunur.
  5. Kanamayı en aza indirmek için kan damarlarını daraltmak için kafaya buz gibi tuzlu suya batırılmış gazlı bez yerleştirin. 15 numara bir neşter kullanarak, kafatası üzerinde cilt ve kasın orta hat kesisini yapın.
  6. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildin ve kasın künt diseksiyonunu kullanın.
  7. 1/4 yuvarlak matkap ucu kullanarak, ön beyni ortaya çıkarmak için kafatası kapağını dikkatlice delin. Ardından, kafatasını dikkatlice kesmek için rongeurs (2,5 mm fincan) kullanın.
  8. 15 numara neşter kullanarak beyne (Bregma: -3.80) ve koku soğancığına bir kesi yapın.
    NOT: Bu noktadan sonra daha kaudal olarak kesmek, sıçan ölümüne neden olacaktır
  9. Durayı kafatasından dikkatlice ayırmak için bir spatula kullanın ve TG'yi ve kafatasının tabanını ortaya çıkarmak için kopmuş beyni yavaşça kaldırın.
    NOT: Ekstraksiyon boyunca buz gibi soğuk salin perfüzyonunun ek kullanımı kanamayı en aza indirecek ve aşağıdaki diseksiyon alanını optimize edecektir.
  10. Bir koter kalemi kullanarak, ekstraksiyondan kaynaklanan kanamaları durdurun.
    NOT: Duranın kesilmesi kaçınılmaz kanamaya neden olur. Buz gibi soğuk aCSF (119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 2.5 mM CaCl2) hazırlamak en iyisidir.

3. GCaMP6s görüntüleme

NOT: Bu nöronların büyüklüğü ve yoğunluğu göz önüne alındığında, kullanılan görüntüleme ve veri toplama sistemi (objektif, mikroskop, ışık kaynağı, kamera) görselleştirilen GECI+ hücrelerinin sayısını belirleyecektir. Işık kaynağı, objektif ve kamera, pozlama süresi ve görüntü yakalama hızı dahil olmak üzere görüntü elde etmek için kullanılan parametreleri de belirleyecektir. Deneyin parametrelerine bağlı olarak multifoton ve konfokal teknikler kullanılabilirken, epifloresan mikroskobu birçok hücreyi çözmek için yeterli olabilir. Herhangi bir görüntü alma paketi kullanılabilir. İdeal olarak, uyaran uygulaması, görüntü alma yazılım paketi ile zaman kilitlidir.

  1. Kafatası boşluğunu objektifin altına yerleştirin ve görünür ışık kullanarak TG'yi odağa getirin.
  2. GCaMP6'ların uyarma dalga boyu 496 nm'dir ve emisyon dalga boyu 513 nm'dir; bu nedenle, GCaMP+ hücrelerini bulmak için uygun dikroik ve filtre küplerini kullanın. Nöronların alıcı ilgi alanına uygulanan uyaranlara yanıt verdiği gangliyon alanını bulmak ve çözmek için odağı ayarlayın.
  3. Yüzün 10cm'lik bir bölgesine uygulanan mekanik uyaranlara yanıt veren TG'deki çoğu nöronun görselleştirilmesini sağlamak için 2x objektif kullanın16. Çözünürlüğü artırmak için uzun çalışma mesafesine (10,8 mm) sahip 20x kuru objektif kullanın.
  4. Zaman içinde ve uyaran uygulamasına yanıt olarak floresan verilerini toplamak için toplama yazılımı (örneğin, Metamorf) kullanın.
    1. Nöronların foto-ağartmasını en aza indirmek için, floresandaki başlangıç ve uyarılmış artışları tespit etmek için mümkün olduğunca kısa pozlama süresi kullanın. Bu çalışmada kullanılan 20x, 0,40 NA hava objektifi, 120 W cıva halojenür ışık kaynağı ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera, 300 ms pozlama süresi ve 3 Hz görüntü elde etme hızı ile >90 dakika boyunca kararlı temel kayıtlar elde edin.
      NOT: 1) Bu görüntü elde etme parametreleri ampirik olarak belirlenmelidir. 2) Alıcı alana mekanik (fırça, nokta, titreşim, çimdikleme), termal (sıcak ve soğuk) ve kimyasal (kapsaisin, mentol, enflamatuar mediyatörler) uygulanabilir. Nispeten ucuz bir öznel yaklaşım, uyaranları elle uygulamaktır. Bununla birlikte, geri besleme kontrollü aktüatörlerin bilinen bir kuvvette tekrarlanan uygulama için kullanılabileceği daha objektif ve tekrarlanabilir yaklaşımlar önerilir. Geri besleme kontrollü Peltier cihazları, kontrollü ısıtma ve soğutma için yararlı olsa da, kavisli bir yüzün termal stimülasyonu için ideal değildir. Geri besleme kontrollü kızılötesi ışık kaynakları ısıtma için bir alternatiftir ve soğuk sprey, soğutma için ideal bir alternatiften daha azdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Daha önce sıçan duyusal nöronlarının15 enfeksiyonu için AAV9 serotipi ile başarılı olduğumuzdan, bu serotipi sıçan TG nöronlarında GCaMP6'ların ekspresyonu için kullandık. Bu nedenle, ilk olarak, bu virüs yenidoğan sıçan yavrularına uygulandığında AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40'ın (AAV9-GCaMP) duyusal nöron enfeksiyonu etkinliğini değerlendirmeye çalıştık20. Bu virüs, yüksek düzeyde gen ekspresyonunu yönlendiren ve sürdüren CAG promotörü kullanır. Ayrıca, AAV9'un yenidoğan sıçanlara uygulandığında duyusal nöronları etkili bir şekilde enfekte ettiği gösterilmiştir33. İlk enjeksiyonlarda doğum sonrası 5. gün (p5) yavrularında 5 μL kullanıldı ve bu da yaklaşık %51.66 ± %14.33 verimlilikle sonuçlandı (Şekil 1A). Enfeksiyon oranını arttırmak için, sonunda genç sıçanlarda (p2) daha büyük bir virüs hacmi (15 μL) kullandık ve 2.4 x 1014 virüs titresini aynı tuttuk. Bu strateji, nöronların %91.84'ü ± %3.18'i (n = 8) enfekte oldu (Şekil 1B).

Vibrissal pedi innerve eden TG nöronlarını görselleştirmek için, TG'yi in-vivo olarak ortaya çıkarmak için cerrahi bir strateji geliştirdik. Ön beynin yaklaşık% 60'ı, büyük solunum merkezlerini etkilemeden çıkarılabilir. Bu, Bregma -3.80'e kadar beyin dokusu rostralına karşılık gelir. Maruz kalan TG'nin (solda) ve infraorbital sinirin innervasyon bölgesinin (ION, sağda) bir şeması Şekil 2'de gösterilmektedir. Vibrissal pedin innervasyonuna neden olan TG bölgesi, 20x'te floresanstaki değişiklikler izlenirken vibrissal pede hafif mekanik stimülasyon (fırça) uygulanarak belirlendi. Tahmin edildiği gibi, yüzün maksiller bölümünü innerve eden TG'nin V2 bölgesi, aktive olan tek alandı. Yani, sistematik olarak çalışılmamakla birlikte, incelenen nöronlar vibrissal pede uygulanan uyaranlarla aktive edilebildiğinde, V1 (alındaki cilt) veya V3 (mandibuladaki cilt) bölgelerine uygulanan uyaranlara yanıt olarak floresanda herhangi bir değişiklik tespit edilmemiştir. Başlangıçta ve vibrissal pede uygulanan uyaranlara yanıt olarak floresanstaki değişiklikler daha sonra izlendi. İlgilenilen bölge (V2) Şekil 3A'da sınırlandırılmıştır. Duyusal nöronlarda34 nispeten düşük seviyelerde dinlenme aktivitesine ilişkin önceki raporlarla tutarlı olarak, dinlenme floresansı çoğu nöronda nispeten düşüktü ve floresanda spontan artışlara dair çok az kanıt vardı (Şekil 3B). Perifer 6,16,21 ve CNS12,35,36'daki nöronlarda uyaranla uyarılan aktiviteyi tanımlamak için kullanılan kriterler, ücretsiz olarak kullanılabilir hale getirilen çeşitli karmaşık iş akışı paketleriyle gelişen bir alandır37,38. Kullanılan çeşitli yaklaşımların güçlü ve zayıf yönlerinin tam bir tartışması, bu makalenin kapsamı dışındadır. Bu çalışmanın odak noktası bu olmadığından, gangliyonların açıkça saptanabilir nöronların bulunmadığı (çekirdeği görme yeteneğine dayanarak) bölgelerinde gözlemlenen pik yanıta dayalı olarak nispeten keyfi ve öznel kriterler kullandık, öyle ki floresandaki artış uyaran uygulamasına zaman kilitliyse bir nöronun bir uyarana yanıt verdiği düşünüldü (uyaran uygulamasından sonraki 1 saniye içinde tespit edilen floresan artışı ( hücre gövdesinden 3 cm'den daha uzak olmayan bir bölgede başlatılan en yavaş iletken aksonlarda (0,2 m/s) başlatılan bir aksiyon potansiyelinin hücre gövdesine bir saniyeden daha kısa sürede ulaşması gerektiği varsayımına dayanarak) ve pik yanıtın standart sapmasının >6 katı (ΔF/F) bir kontrol bölgesi tespit etti (Şekil 3C). Daha sonra, bu nöronların doğal uyaranlara tepki özelliklerini karakterize ettik: fırça, noktalama, sıcak ve soğuk. Bu uyaranların her birine verilen yanıtların örnekleri Şekil 4'te gösterilmektedir. Özellikle, ağrı ile ilgili çalışmalarda en sık kullanılan punktat stimülasyonuna verilen yanıt, en sağlam yanıta sahiptir (Şekil 4B, F).

Bu tekniği geliştirmedeki amacımız, TG nöronlarındaki popülasyon kodlamasındaki değişiklikleri değerlendirebilmekti. Bu nedenle, sinir hasarından 2 hafta sonra sıçanları incelemek için daha önce29 kullanıldığı gibi kronik daralma hasarını ION'A (CCI-ION) uyarladık. Modelin indüksiyonunu takiben, TG'yi ortaya çıkardık ve TG'de yaralanma bölgesine ipsilateral ve kontralateralde istirahat ve uyarılmış aktiviteyi değerlendirdik. İlginç bir şekilde, fırçaya karşı uyarılan pik yanıtın büyüklüğü, karşı tarafa uygulanan aynı uyarana verilen pik yanıta göre sinir yaralanmalı tarafta ~ 2 kat artmıştır (Şekil 5A-C). Ayrıca, iki fırça uyarısı seri olarak uygulandığında (10 s'lik bir uyaranlar arası aralıkla), yaralı ancak yaralanmamış tarafta ikinci uyarana verilen yanıtın büyüklüğünde önemli bir amplifikasyon olmuştur (Şekil 5D).

Son olarak, floresanda uyaranla uyarılan artışın çevrede başlatılan aksiyon potansiyellerinden kaynaklandığını doğrulamak için bir ilk kontrol deneyi olarak, tetrodotoksinin (1 μM) uyaranla uyarılan tepkiler üzerindeki etkisini değerlendirdik. TTX, infraorbital siniri hedeflemek için daha önce tarif edildiği gibi 28 perkütan olarak200 μL'lik bir hacimde enjekte edildi. Şekil 6'da gösterildiği gibi, uyarılmış aktivite neredeyse tamamen ortadan kaldırıldı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, TG popülasyon yanıtlarını in vivo olarak sorgulamak için AAV9-GCaMP kullanmanın faydasını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Yenidoğan AAV enjeksiyonu ile TG nöronlarında GCaMP6s enfeksiyonunun Yüksek Etkinliği. (A) P5 sıçan yavrularına intraperitoneal olarak 5 μL pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titre: 2.4 x 1014) virüsü enjekte edildi: TG nöronlarının %51.7 ± %14.3'ünde GCaMP6s ekspresyonu tespit edildi (n = hayvan başına 3 dilim, 7 sıçan). (B) Genç hayvanlarda enjeksiyon hacminin 15 μL'ye çıkarılması (p2) enfeksiyon etkinliğini artırdı: TG nöronlarının %91.8 ± %3.2'sinde GCaMP6s ekspresyonu tespit edildi (n = hayvan başına 3 dilim, 8 sıçan). Soldaki paneller GCaMP6'lar için boyandı. Ortadaki paneller, nörona özgü bir belirteç olan NeuN ile boyandı. Sağdaki paneller, GCaMP6s ve NeuN panellerinin birleştirilmiş bir görüntüsüdür. İlk paneldeki ölçek çubuğu, sonraki tüm paneller için aynıdır. Sağdaki grafik, hayvan başına dilim başına toplam nöron sayısının yüzdesi olarak GCaMP6s ekspresyonunun (ortalama ± SEM) bir grafiğidir, burada tek tek noktalar her hayvan için verilerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Trigeminal ganglion (TG), infraorbital sinir (ION) ve uyarılan yüz bölgesinin (vibrissal ped) yeri. (A) TG'ye erişim sağlamak için ön beyin çıkarıldı. (B) ION ve TG'ye göre doğal uyaranların uygulandığı yüz bölgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: GCaMP6s floresansında uyaranla uyarılmış artış. (A) 20x büyütme altında toplam görme alanı. TG'nin oftalmik (V1) ve maksiller (V2) bölümleri endikedir. (B,C) Kutudaki bölge, sırasıyla vibrissal pedin fırça stimülasyonundan önce ve sonra floresan görüntüler olan B ve C panellerinde gösterilmiştir. Beyaz daireler ilgi çekici karşılaştırıcı bölgelerdir. Nöronların, metinde açıklandığı gibi, ilgilenilen karşılaştırıcı bölgelerde gözlemlenen floresanstaki tepe değişikliğine dayalı olarak bir uyarana yanıt verdiği kabul edildi. İlk paneldeki ölçek çubuğu her iki panel için de aynıdır. (D) Yüze uygulanan bir fırça uyaranına yanıt olarak B ve C'de gösterilen nöronların floresansındaki temsili değişiklikler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Nöronların yüze uygulanan uyaranlara verdikleri tepkilere göre sınıflandırılması. Yüzün aynı bölgesine uygulanan 1 cm'lik deve kılı fırçasına (A - Fırça), 1cm2'lik monofilament ızgarasına (B - Punktat), ısıtma (C - Isı) ve soğutmaya (D - Soğuk) verilen yanıtlardan önce (üst paneller - Taban Çizgisi) ve sonrasında (orta panel - Stimülasyon) TG nöronlarının temsili görüntüleri. İlk paneldeki ölçek çubuğu, sonraki tüm paneller için aynıdır. Turuncu daireler, duyarlı bir nöron örneğini gösterir. Beyaz daireler ilgi çekici karşılaştırıcı bölgelerdir. (E-H) Uyaran başına her yanıtın temsili izleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Sinir hasarı, TG nöronlarında fırça ile uyarılan yanıtları arttırır. TG nöronlarının fırçaya tipik yanıtları, infraorbital sinirin kronik daralma hasarına (A, Contra) veya sinir hasarının (B, Ipsi) yan ipsilateraline kontralateral taraftaki sıçan yüzüne iki kez uygulanır. (C) Altı sıçandan alınan duyarlı nöronlardan toplanan verilerin analizi (çizilen veriler sıçan başınadır), fırçaya verilen ilk yanıtın büyüklüğündeki farkın önemli olduğunu doğruladı (eşleştirilmiş t-testi). (D) Birinci ve ikinci uyaran uygulamasına verilen pik yanıt bir oran (R2/R1) olarak analiz edildiğinde, toplanan verilerin analizi, sinir yaralanmalı taraftaki yanıt oranındaki artışın önemli olduğunu doğruladı. ** p < 0.01 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Tetrodotoksin (TTX) ile TG nöronlarında uyarılmış aktivite bloğu. (A) Bir fırça uyaranının (mavi çubuk) uygulanmasını takiben infraorbital sinire bitişik TTX (200 μL, 1 μM) enjeksiyonunu takiben bir sinir hasarına kadar TG nöronlarından ipsilateral floresan verileri. (B) Üç sıçandan toplanan pik yanıt verileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, TG'yi görüntülemek için bir GECI sıçanı üretmenin hızlı, invaziv olmayan bir yolunu gösteriyoruz. Yüksek düzeyde gen ekspresyonunu sürmek ve sürdürmek için bir CAG promotoru seçtik. Önceki çalışmalar, diğer AAV serotiplerinin DRG nöronlarındagen ekspresyonunu etkili bir şekilde yönlendirebileceğini öne sürerken, sonuçlarımız yenidoğanlarda32 AAV'nin intraperitoneal enjeksiyonunu içeren yeni bir çalışma ile tutarlıdır ve AAV9 serotipinin sıçan yenidoğan duyu nöronlarının enfeksiyonunda oldukça etkili olduğunu göstermektedir.

Bu teknikte sorun gidererek, optimal enfeksiyonu önleyebilecek bazı tuzaklara dikkat etmek önemlidir. Akılda tutulması gereken ana değişken, yavruların yaşıdır. Sıçan sinir sistemi, doğumdan sonraki ilk 7 gün içindehızla gelişir 40. Daha sonraki zaman noktalarında enfeksiyon girişiminde bulunduk (örneğin, p4-7), bu da değişken ve düşük verimlilikle sonuçlandı. Daha önceki zaman noktaları (p1-4) daha sağlam ve tutarlı verimlilik üretirken, p1-2 en yüksek enfeksiyon oranlarını üretir. İkinci değişken enjeksiyon hacmidir. Yaştan bağımsız olarak, 2,5 x 1014 titre ile TG veya DRG'de %70'ten fazla verimlilik üretmek için minimum 15 μL gerekliydi. P2'de bile, 10 μL'den daha düşük intraperitoneal enjeksiyonların yetişkinlerde çok az ekspresyon ürettiğini bulduk. Daha lokalize enjeksiyonların, yani doğrudan alıcı ilgi alanına, daha düşük hacimlerde benzer etkiler üretmesi mümkündür. Bununla birlikte, bu yaklaşım yavruların tamamen uyuşturulmasını gerektirir ve ilgilenilen dokuda travmaya neden olabilir. Son olarak, daha yüksek titrelerle daha küçük hacimlerin kullanılması mümkündür.

GECI görüntüleme için TG'nin açığa çıkarılması daha önce farelerdegerçekleştirilmiştir 16. Bununla birlikte, bu yaklaşımı fareye çevirmek, dikkate değer birkaç konuyu ortaya çıkardı. İlk olarak, sıçanlarda kafatası ve dura kalınlığı bir fareden çok daha fazladır. Bu nedenle, kafatası başlığının çıkarılması zorluklar doğurabilir. Küçük bir matkabın, kafatası kapağını delmenin etkili bir yolu olduğunu ve daha sonra rongeurs ile çıkarılabileceğini bulduk. İkinci bir sorun, beyin çıkarıldıktan sonra kanamadır. Bu, hem preparatın uzun ömürlülüğü hem de nöronların özellikleri olmasa da görüntülemenin netliği için devam eden bir sorun olabilir. Buz gibi BOS'a batırılmış gazlı bez, ana arterlerin kapanmasına yardımcı olmak için beynin açıkta kalan yüzeyine uygulanabilir. Küçük bir koter kaleminin kullanılması da daha fazla kanamayı önlemede etkili olabilir. Son olarak, görüntüleme penceresinin karşı tarafında bulunan Jel Köpüğü, kan ve BOS'un görüntüleme sorunlarına neden olmasını önlemeye de yardımcı olabilir. Üçüncü bir husus, çıkarılacak beyin miktarıdır. Beyin kaudalini ~ Bregma -3.80'e çıkarmanın, çıkarıldıktan sonraki bir saat içinde ölümle sonuçlanacağını bulduk. Bu nedenle, beyin küçük bölümler halinde çıkarılmalı, mümkün olduğunca TG'yi açığa çıkarırken mümkün olduğunca tutulmalıdır.

Giriş'te belirtildiği gibi, [Ca2 +] i , nöronal aktivitenin dolaylı bir ölçüsüdür ve sonuç olarak, [Ca2 +] i'deki bir artış, mutlaka nöral aktivitede bir artış olduğu anlamına gelmez. Bu nedenle, kontrol deneyleri, uyarılmış aktivite olarak kabul edilen şeyin aslında kendi başına aktivite olduğunu doğrulamak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, elektriksel olarak uyarılan uyaranlar, doğal olarak uyarılan uyaranlara benzer bir ölçekte olan [Ca2+]i'de zaman kilitli bir artış üretmelidir. Daha da önemlisi, bu aktivite sinir bloğu (yani TTX) ile ortadan kaldırılmalıdır. Bununla birlikte, bu önemli kontrollere rağmen, [Ca2 + ] i'de görünüşte uyarılmış artışların bir kısmının, gangliyonlar içindeki sinyalleşmeden, örneğin gangliyonlar içindeki verici salınımından kaynaklandığını belirtmek de önemlidir41, hücre somasını istila eden periferde başlatılan bir aksiyon potansiyelinden ziyade.

Sonuçlarımız, duyusal somatadaki GCaMP floresansındaki değişikliklerle ilişkili sinyal-gürültü oranını gösteren önceki araştırmacıların 16,42,43'ünün standart bir epifloresan mikroskobu ile kullanım için yeterli olduğunu doğrulasa da, bu çalışmada kullanılan sinir hasarı gibi manipülasyonlar, nöronal aktivitede ve Ca2+ sinyalinde bu tür dramatik değişikliklerle ilişkili olabilir34, gangliyonlar boyunca verilen yanıtlar, görünür arka planda o kadar büyük bir artışla ilişkili olabilir ki, bireysel nöronların yanıtları yapay olarak zayıflatılabilir. Bu sınırlamanın44 ele alınmasına yardımcı olabilecek görüntüleme işleme yaklaşımları geliştirilmiş olsa da, bu sorunu en etkili şekilde çözmek için konfokal veya çoklu foton görüntüleme gerekebilir.

Birlikte ele alındığında, bu teknik, sıçanlardaki TG nöronlarının uyaran-tepki özelliklerini popülasyon düzeyinde araştırmak için bir yaklaşım sağlar. ION'un CCI'si ile elde ettiğimiz sonuçlar, bu uyaran-tepki özelliklerindeki değişiklikleri tespit etmenin fizibilitesini doğrulamaktadır. Bu çalışmada sadece mekanik ve termal uyaranlar kullanılmış olsa da, bu preparat, TG nöronlarının uyaran-tepki özelliklerini tam olarak tanımlamak için kimyasal uyaranların uygulanmasına uygun olmalıdır. Benzer şekilde, kutanöz afferentlerin uyaran-tepki özelliklerine odaklanırken, kutanöz sinirin travmatik yaralanmasını takiben dinamik mekanik allodini gibi fenomenlerin ortaya çıkması nedeniyle, temporomandibular eklem gibi diğer kraniyofasiyal yapıları innerve eden afferentlerin özelliklerindeki değişiklikleri de tespit etmek mümkün olmalıdır (zararsız ve zararlı çene hareketlerine yanıt olarak), kornea veya dil. AAV9 serotipinin periferik enjeksiyonu, PNS'ye özgü GCaMP'nin nörona özgü indüksiyonuna izin verir. Bu stratejinin önemli bir yararı, viral etiketlemenin post-mitotik hücrelerde (yani nöronlar) sağlam, kalıcı bir ekspresyon sağlaması, ancak mitotik hücrelerde (örneğin epitel hücreleri) sağlamamasıdır. Ek olarak, farklı PNS dokularının ön taraması, bu viral stratejinin para/sempatik gangliyonları, DRG'yi ve enterik sinir sistemlerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir (veriler gösterilmemiştir).

Bu in vivo preparat, mevcut literatürde eksik olan birçok karşılaştırmayı keşfetmek için de temel sağlar. Sıçan TG ve DRG, sıçan ve fare TG arasında in vivo popülasyon çalışmaları henüz yapılmamıştır. Burada sunulan veriler, yapılacak bu önemli deneylerin yeni fizibilitesini göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Gold, bu hazırlığın geliştirilmesi sırasında Grunenthal'dan hibe desteği alıyordu. Grunenthal çalışmasının odağında ve bu yazıda açıklanan preparatta herhangi bir örtüşme yoktu. Diğer yazarların hiçbirinin ifşa edecek başka bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Dr. Kathy Albers ve Brian Davis'e Leica Mikroskop ve Metamorf programlarını kullandıkları için, Charles Warwick'e termal Peltier cihazımızı oluşturmamıza yardımcı oldukları için ve Dr. Raymond Sekula'ya cerrahi hazırlık sorunlarının giderilmesine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) ve R01NS122784 (MSG ve RS) hibeleriyle desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 204
<em>Canlı Olarak Taşınabilir</em> Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter