Summary
Aus Magenpatienten stammende Organoide finden zunehmend Verwendung in der Forschung, jedoch fehlen formale Protokolle zur Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellverdauen mit standardisierter Aussaatdichte. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Herstellung von Magenorganoiden aus Biopsiegewebe dar, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde.
Abstract
Magenpatienten-abgeleitete Organoide (PDOs) bieten ein einzigartiges Werkzeug für die Untersuchung der Magenbiologie und -pathologie. Folglich finden diese g.U. zunehmend Verwendung in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen. Es gibt jedoch einen Mangel an veröffentlichten Ansätzen zur Herstellung von Magen-PDOs aus Einzelzellverdauen unter Beibehaltung einer standardisierten anfänglichen Zellaussaatdichte. In diesem Protokoll liegt der Schwerpunkt auf der Initiierung von Magenorganoiden aus isolierten Einzelzellen und der Bereitstellung einer Methode zur Passage von Organoiden durch Fragmentierung. Wichtig ist, dass das Protokoll zeigt, dass ein standardisierter Ansatz für die anfängliche Zellaussaatdichte konsistent Magenorganoide aus gutartigem Biopsiegewebe liefert und eine standardisierte Quantifizierung des Organoidwachstums ermöglicht. Schließlich gibt es Hinweise auf die neue Beobachtung, dass Magen-PDOs unterschiedliche Bildungs- und Wachstumsraten aufweisen, je nachdem, ob die Organoide aus Biopsien des Körpers oder aus Antralregionen des Magens stammen. Insbesondere wird gezeigt, dass die Verwendung von Antralbiopsiegewebe für die Organoidinitiierung zu einer größeren Anzahl von Organoiden und einem schnelleren Wachstum von Organoiden über einen Zeitraum von 20 Tagen im Vergleich zu Organoiden führt, die aus Biopsien des Magenkörpers erzeugt werden. Das hierin beschriebene Protokoll bietet Forschern eine zeitnahe und reproduzierbare Methode zur erfolgreichen Erzeugung und Arbeit mit Magen-PDOs.
Introduction
Organoide sind dreidimensionale (3D) zelluläre Miniaturstrukturen, die der Architektur und Funktionalität der Organe ähneln, von denen sie abgeleitet wurden 1,2. Diese im Labor gezüchteten Modelle werden durch die Kultivierung von Stammzellen oder gewebespezifischen Zellen in einer kontrollierten Umgebung hergestellt, die es diesen Zellen ermöglicht, sich selbst zu organisieren und in verschiedene Zelltypen zu differenzieren 1,2,3. Einer der Hauptvorteile von Organoiden ist ihre Fähigkeit, die menschliche Biologie genauer zu rekapitulieren als herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturen 1,2,3. Insbesondere hat sich gezeigt, dass menschliche Organoide die genetische Vielfalt ihres Ursprungsgewebes erhalten 3,4,5. Organoide bieten eine einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung menschlicher Organe zu untersuchen, Krankheiten zu modellieren und potenzielle Therapeutika in einer kontrollierten Laborumgebung zu testen. Darüber hinaus können Organoide aus individuellen Patientenproben abgeleitet werden, was Ansätze der personalisierten Medizin und die potenzielle Entwicklung individualisierter Behandlungen ermöglicht 3,6,7.
Forscher haben menschliche Magenorganoide verwendet, um verschiedene Aspekte der Magenbiologie und -pathologie zu untersuchen. Prominente Beispiele sind die Verwendung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) zur Vorhersage des Ansprechens auf eine Chemotherapie bei Magenkrebs 8,9,10 und zur Modellierung der epithelialen Reaktion auf eine Helicobacter-pylori-Infektion 11,12,13. Menschliche Magenorganoide bestehen aus verschiedenen Zelltypen, die im Magen vorkommen, darunter Halszellen, Grubenzellen und andere Stützzellen11,14. Magenorganoide können entweder aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) oder direkt aus Magengewebe isoliert werden, das durch Biopsien gewonnen wurde, oder aus Magenresektionsproben11,14. Die Isolierung von Magenstammzellen aus Magengewebe erfolgt üblicherweise durch Isolierung und Kultivierung von Magendrüsen oder enzymatisch verdauliche Gewebeproben zur Freisetzung einzelner Zellen 9,13,15. Wichtig ist, dass sich die Differenzierung von Zellen innerhalb von Magenorganoiden, die mit einer dieser Techniken erzeugt wurden, als ähnlich erwiesen hat13. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf einen Einzelzellverdau.
Organoide stellen eine wissenschaftliche Innovation dar, die die Lücke zwischen traditioneller Zellkultur und ganzen Organen schließt. Da die Forschung auf diesem Gebiet weiter voranschreitet, sind Organoide bereit, zur Entwicklung wirksamerer Behandlungen und Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen beizutragen. Angesichts der zunehmenden Nutzung von Magen-PDOs besteht ein zeitgemäßer Bedarf an einem standardisierten Ansatz für ihre Erzeugung. Hier wird das Protokoll zur Generierung menschlicher Magen-PDOs aus Einzelzellen beschrieben, die aus gutartigem Magenbiopsiegewebe isoliert wurden, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde. Wichtig und einzigartig ist, dass eine standardisierte Anzahl von Einzelzellen für die Aussaat bestimmt wird, um zuverlässig Magen-PDOs zu erzeugen und eine anschließende Charakterisierung zu ermöglichen. Mit dieser Technik werden zuverlässige Unterschiede in der Bildung und dem Wachstum von Organoiden nachgewiesen, die aus Biopsien des Magenkörpers oder des Magenantrums generiert wurden.
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Protocol
Sämtliches menschliches Gewebe, das in diesem Protokoll verwendet wurde, wurde von Personen gesammelt, die im Rahmen einer vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961) genehmigten Magengewebeentnahmestudie eine informierte Einwilligung zur Gewebeentnahme erteilt hatten. Die Teilnehmer dieser Studie mussten sich im Rahmen ihrer Routineversorgung einer oberen Endoskopie unterziehen, mindestens 18 Jahre alt sein und in der Lage sein, eine informierte Einwilligung zu geben. Alle durchgeführten Untersuchungen hielten sich an die Richtlinien der University of Pennsylvania.
1. Experimentelle Vorbereitung
- Bereiten Sie konditionierte L-WRN-Medien wie zuvor beschriebenvor 16. Obwohl nicht zwingend erforderlich, können die Konzentrationen von Wnt-3A, R-Spondin und Noggin, die in den konditionierten Medien enthalten sind, mit einem handelsüblichen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers überprüft werden (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie RPMI-Antibiotika (RPMI-ABX), PBS-Antibiotika (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), Verdauungspuffer und magenorganoide Medien vor (siehe Ergänzende Tabelle 1 für die detaillierte Zusammensetzung). Magenorganoide Medien sind bei 4 °C 1 Woche lang stabil.
- Autoklavenpinzette, feine Präparierschere und 1,5-ml-Röhrchen.
- Beginnen Sie mit dem Auftauen der Basalmembranmatrix (Matrigel) auf Eis.
- Beginnen Sie mit dem Auftauen des Aufschlusspuffers und des Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Stellen Sie einen Inkubator-Orbitalschüttler auf 37 °C und 200 U/min ein.
2. Isolierung einzelner Zellen aus dem Biopsiegewebe
- Entnahme von Magenbiopsien während einer oberen Endoskopie17 gemäß dem institutionellen klinischen Protokoll, wahrscheinlich unter Verwendung einer Jumbo-Pinzette. Verwenden Sie eine Nadel mit stumpfer Spitze, um Gewebeproben aus der Pinzette zu entnehmen und sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit RPMI-ABX-Medien zu geben. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, um es schnell ins Labor zu bringen.
HINWEIS: Es sollten mindestens 2-4 Biopsien entnommen werden. - Lassen Sie das Biopsiegewebe am Boden des konischen Röhrchens absetzen. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium abzusaugen, und waschen Sie die Biopsien zweimal mit 1 ml PBS-ABX-Puffer. Eine Zentrifugation ist nicht erforderlich, da sich die Gewebestücke auf natürliche Weise im konischen Röhrchen absetzen.
- Mindestens 20 mg Biopsiegewebe werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PBS-DTT überführt.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einer feinen Präparierschere in Stücke, die 1-2 mm oder kleiner sind.
- Verwenden Sie eine Tisch-Minizentrifuge für 15 Sekunden, um Gewebestücke am Boden des Röhrchens zu aggregieren und so viel Überstand wie möglich abzusaugen. Ein geringes Restvolumen von PBS-DTT ist akzeptabel.
- Geben Sie 5 ml frisch erwärmten Aufschlusspuffer in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Um die kleinen Gewebestücke zu übertragen, ohne Gewebe zu verlieren, nehmen Sie 500 μl des Aufschlusspuffers und geben Sie ihn in das 1,5-ml-Röhrchen, das das Gewebe enthält. Als Nächstes modifizieren Sie die Spitze einer 1000-μl-Pipettenspitze mit einer Schere, um den Durchmesser der Spitze zu vergrößern und so eine einfache Aspiration und Übertragung von Gewebestücken in das konische 50-ml-Röhrchen mit dem Aufschlusspuffer zu ermöglichen.
- Der Aufschlusspuffer und die Gewebemischung werden bei 37 °C für 30 min mit orbitalem Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
- 5 ml erwärmtes Trypsin mit 0,25 % EDTA in den Aufschlusspuffer geben und weitere 10 Minuten bei 37 °C mit orbitalem Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
- Neutralisieren Sie den Aufschlusspuffer und das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen des Advanced (Adv.) DMEM/F12-Mediums hinzufügen und die Lösung durch ein 70-μm-Zellsieb leiten.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 1400 x g für 4 min bei 4 °C pelletiert. Abhängig von der anfänglichen Größe des Biopsiegewebes kann ein kleinzelliges Pellet sichtbar sein oder auch nicht.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Adv. DMEM/F12-Medien und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
- Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation bei 1400 x g für 4 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entfernt.
ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Isolierung einzelner Zellen aus dem Biopsiegewebe.
3. Einbettung einzelner Zellen in eine Basalmembran-Matrix-"Kuppel"
- Berechnen Sie auf der Grundlage der gezählten Anzahl lebensfähiger Zellen das Volumen der Basalmembranmatrix, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 105 lebensfähigen Zellen pro 50 μl Basalmembranmatrix zu erreichen.
- Führen Sie die folgenden Schritte zügig durch, um zu verhindern, dass die Basalmembranmatrix vor dem Auftragen polymerisiert. Entfernen Sie die aufgetaute Basalmembranmatrix aus dem Eis, geben Sie das zuvor berechnete Volumen der Basalmembranmatrix zu den Zellen und mischen Sie vorsichtig, indem Sie ca. 10 s lang auf und ab pipettieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass während dieses Schritts keine Blasen entstehen. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix nicht. - Schnelle Pipettierung von 50 μl Aliquoten der Basalmembranmatrix/Zellmischung in die Mitte einzelner Vertiefungen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
- Decken Sie die 24-Well-Platte sofort ab und drehen Sie die Platte mit einer einzigen sanften Bewegung auf den Kopf. Legen Sie die invertierte Platte für 35 Minuten in einen 37 °C warmen Gewebekultur-Inkubator, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann.
HINWEIS: Das Invertieren der Platte ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die Zellen auf den Boden der Platte sinken, und um die Membranmatrix des Grundmaterials in eine 3D-"Kuppel"-Form polymerisieren zu können. - Geben Sie 500 μl vorgewärmtes Magenorganoid-Medium in jede Vertiefung und stellen Sie sicher, dass die Oberseite jeder "Kuppel" vollständig in das Medium eingetaucht ist. Verteilen Sie das Medium an der Seite jedes Wells, um eine Störung der "Kuppel" zu vermeiden.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
4. Routinemäßige Passage von Organoiden durch Fragmentierung
- Sobald die Organoide für die Passage bereit sind, entfernen Sie das Medium aus jeder dafür vorgesehenen Vertiefung.
HINWEIS: Informationen zur Bestimmung des geeigneten Zeitpunkts für den Durchgang finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse". - Geben Sie 1 ml eiskaltes Adv. DMEM/F12-Medium direkt auf eine "Kuppel" der Basalmembranmatrix. Dies sollte leicht das Aufbrechen der "Kuppel" einleiten. Saugen und dosieren Sie weiter, bis sich alle Fragmente der "Kuppel" von der Platte lösen.
- Transportieren Sie sowohl das Medium als auch die fragmentierte Basalmembranmatrix zur nächsten Bohrung und wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bohrungen, die für die Durchfahrt vorgesehen sind. Nach der Demontage der endgültigen Basalmembranmatrix "Dome" geben Sie das Medium und die Mischung aus Organoiden und Basalmembranmatrix in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Befestigen Sie eine 1000-μl-Spitze an einer P1000-Pipette und führen Sie diese Spitze dann in eine 200-μl-Spitze ein. Dadurch entsteht eine Pipettenspitze, deren Durchmesser klein genug ist, um die Organoide zu fragmentieren und gleichzeitig die Aspiration eines größeren Volumens zu ermöglichen.
- Pipettieren Sie die Mischung aus Organoiden und Basalmembranmatrix etwa 25 Mal kräftig auf und ab, um die Organoide in kleine Stücke zu zerkleinern.
- Das fragmentierte Organoidgemisch wird mit einer Tischzentrifuge bei 4 °C für 30 s bei 2000 x g zentrifugiert. Dies führt zu einem Pellet aus fragmentierten Organoiden, das von der Basalmembranmatrix und dem Medium getrennt wird. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium und den Überstand der Basalmembranmatrix abzusaugen. Verwenden Sie kein Vakuum, um den Überstand anzusaugen, da das Pellet lose ist.
- Berechnen Sie das Volumen der frisch aufgetauten Basalmembranmatrix, so dass die Anzahl der Wells/Domes im Verhältnis 1:2 (50 μl/Dome) aufgeteilt wird. Fügen Sie die frische Basalmembranmatrix hinzu und pipettieren Sie sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Blasen entstehen.
- 50 μl der Mischung aus Organoidfragmenten und Basalmembranmatrix werden schnell in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte aliquotiert.
- Decken Sie die Platte ab, drehen Sie sie um und legen Sie sie für 35 Minuten in einen 37 °C heißen Gewebekultur-Inkubator, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann.
- Geben Sie 500 μl vorgewärmtes Magenorganoid-Medium in jede Vertiefung.
HINWEIS: Abbildung 2 zeigt eine schematische Übersicht über die Passage von Organoiden aus dem Magen durch Fragmentierung.
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Representative Results
Die anschließenden repräsentativen Ergebnisse stammen aus Biopsien, die aus dem gutartigen Epithel des Magenkörpers und der Magenantrumregionen von fünf verschiedenen Patienten entnommen wurden, die sich einer oberen Endoskopie unterzogen. Pro Patient wurden zwei bis vier "Kuppeln"/Wells plattiert und sowohl für Magenkörper- als auch für Antrumbiopsien analysiert. Organoide wurden erfolgreich aus dem Magenkörper und dem Magenantrumbiopsiegewebe von allen fünf Patienten generiert. Im Durchschnitt wurden 41 Organoide pro "Dome"/Well analysiert. Bei allen Bildern handelt es sich um Z-Projektionen, die mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, und die Quantifizierung der Organoidgröße und Sphärizität wurde mit kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle).
Organoide sind in der Regel innerhalb von 10 Tagen nach der Aussaat einzelner Zellen identifizierbar (Abbildung 3A). Am 20. Tag sind die Organoide groß und müssen in der Regel durchgelassen werden. Während die Anzahl der Organoide, die sich nach der Einzelzellaussaat bilden, etwas variabel sein kann, sind die erwarteten Ergebnisse für die Anzahl der Organoide, die aus Körper- und Antral-Magenbiopsien gebildet werden, in Abbildung 3B dargestellt. Die Anzahl der Körper- und Antralorganoide erreicht am 10. Tag nach der Aussaat ihren Höhepunkt. Obwohl nicht signifikant, beginnt die Gesamtzahl der Organoide von Tag 10 auf Tag 15 und Tag 15 auf Tag 20 abzunehmen. Es scheint eine Subpopulation von kleinen Organoiden zu geben, die sich am 10. Tag bilden und dann aufhören zu wachsen und in den folgenden 10 Tagen absterben, was diesen Trend erklären würde. Wichtig ist, dass gezeigt wird, dass die Anzahl der Organoide, die aus Antralbiopsiegewebe gebildet werden, an den Tagen 10, 15 und 20 signifikant höher ist als die von Biopsiegewebe aus dem Körper. Die Anzahl der gebildeten antralen Organoide war im Durchschnitt 2-fach höher als die Anzahl der aus dem Körper gebildeten Organoide.
In Abbildung 3C sind repräsentative Ergebnisse für das Wachstum von Organoiden nach Einzelzellaussaat zwischen Tag 10 und Tag 20 dargestellt. Während Organoide sowohl aus Antral- als auch aus Körperbiopsien vom 10. bis 20. Tag ein stetiges Wachstum verzeichneten, zeigten Organoide, die aus Antralbiopsiegewebe erzeugt wurden, eine größere Wachstumsrate im Vergleich zu Organoiden, die aus Körperbiopsiegewebe erzeugt wurden. Insbesondere hatten antrale Organoide am Tag 20 eine fast 4-fach größere Fläche als Körperorganoide.
Bei verschiedenen Patienten wird in der Regel eine Vielfalt der organoiden Morphologie in jeder einzelnen "Kuppel"/Vertiefung beobachtet (Abbildung 4A). Einige Organoide sind eher rund oder kugelförmig, während andere eine unregelmäßigere Morphologie aufweisen. Im Durchschnitt zeigte die Sphärizität, ein Maß dafür, wie kugelförmig ein Organoid ist (wobei ein Wert von 1 = eine perfekte Kugel ist)18, jedoch nur geringe Unterschiede innerhalb und zwischen Organoiden, die aus Körper- oder Antralbiopsiegewebe erzeugt wurden (Abbildung 4B). Obwohl es unterschiedliche Wachstumsraten gibt, gibt es daher in der Regel keine signifikanten morphologischen Unterschiede zwischen Organoiden, die aus Biopsiegewebe des Magenkörpers oder des Antrums erzeugt werden.
Am 20. Tag nach der Initiation sind die Magenorganoide in der Regel bereit für die Passage. Eine große Organoidgröße (≥1500 μm im Durchmesser) oder ein abgedunkeltes Inneres (was auf einen umfangreichen Zellumsatz hindeutet) des Organoids sind wichtige Anzeichen dafür, dass Organoide durchgelassen werden müssen (Abbildung 5A). Organoide, die über diesen Punkt hinausgehen, können beginnen, in 2D-Monoschichten (Abbildung 5B) zu zerfallen, die Organoide nach dem Passieren nicht zuverlässig neu bilden, was möglicherweise auf einen Verlust der Lebensfähigkeit oder Stammfähigkeit hinweist. Nach der Passage und Neuaussaat von Magenorganoiden unter Verwendung des hierin beschriebenen Fragmentierungsprotokolls enthalten die "Kuppeln" viele Organoidfragmente (Abbildung 5C), die sich in viel mehr Organoide reorganisieren und im Vergleich zur anfänglichen Aussaat einzelner Zellen (Abbildung 5D) viel schneller wachsen. Wenn das Wachstum von Organoiden zum Zeitpunkt der Passage noch einer Charakterisierung und/oder Standardisierung bedarf, können Magenorganoide stattdessen zu einzelnen Zellen verdaut werden, wie zuvor beschrieben19.
Abbildung 1: Generierung von Organoiden aus dem Magenpatienten. Schematische Übersicht, die den Prozess der Generierung von Magenpatienten-Organoiden aus Biopsien von gutartigem Magenepithel darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Passage von Organoiden des Magenpatienten. Schematische Übersicht, die die Passage von Magenpatienten-Organoiden durch Fragmentierung veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildung und Wachstum von Organoiden des Magenpatienten. (A) Repräsentative z-Projektionsbilder, die das Wachstum von Magenorganoiden an Tag 10, 15 und 20 nach Einzelzellaussaat zeigen. Die Bilder zeigen Organoide, die aus Magenkörper- und Antrumbiopsiegewebe desselben Patienten erzeugt wurden. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Mittlere (±SD) Anzahl von Magenkörper- und Antrum-Organoiden zu angegebenen Zeitpunkten nach der Einzelzellaussaat. (C) Mittlere (±SD) Fläche (μm2) der Organoide des Magenkörpers und des Antrums zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Einzelzellaussaat. n = 5 Patienten pro Gruppe und Zeitpunkt. * = statistisch signifikante Differenz (p ≤ 0,05) zum angegebenen Zeitpunkt. n.s. = kein statistisch signifikanter Unterschied zum angegebenen Zeitpunkt. Statistische Vergleiche mittels 2-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Organoid-Morphologie des Magenpatienten. (A) Repräsentative z-Projektionsbilder verschiedener Magenorganoid-Morphologien aus einer individuellen "Kuppel"/Vertiefung von Organoiden aus dem Magenkörper am Tag 15 nach Einzelzell-Seeing. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Mittlere (±SD) Magenkörper- und Antrum-Organoid-Sphärizität (wobei ein Wert von 1 = eine perfekte Kugel ist). n = 5 Patienten pro Gruppe und Zeitpunkt. n.s. = kein statistisch signifikanter Unterschied zu irgendeinem Zeitpunkt. Statistische Vergleiche mittels 2-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Passage von Organoiden des Magenpatienten. (A) Repräsentatives Bild von Organoiden, die am Tag 20 nach der Einzelzellaussaat zur Passage bereit sind. (B) Repräsentatives Bild von Organoiden, die am Tag 25 nach der Einzelzellaussaat überfällig sind. (C) Repräsentatives Bild fragmentierter Organoide nach der Neuaussaat (Passage 1 - Tag 0). (D) Repräsentatives Bild des Organoidwachstums über 5 Tage nach der Neuaussaat (Passage 1 - Tag 5). Bei allen Bildern handelt es sich um Z-Projektionen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Lösungen und Medienrezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellen beschrieben, die aus Biopsien von gutartigem Epithel aus dem Magenkörper und dem Antrum isoliert wurden. Kritische Schritte im Protokoll drehen sich um das Timing sowie den Umgang mit der Basalmembranmatrix. Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, ist es wichtig, das Protokoll so schnell wie möglich nach der Entnahme des Biopsiegewebes einzuleiten. Ziel ist es, innerhalb von 30 Minuten nach der Biopsie mit der Verdauung des Biopsiegewebes zu beginnen. Auch der Umgang mit der Basalmembranmatrix kann eine Herausforderung darstellen. Wenn es auf Eis aufgetaut wird, bleibt es eine Flüssigkeit; Bei Temperaturen über 4 °C polymerisiert es jedoch. Daher muss die Basalmembranmatrix schnell vom Eis in eine Mischung mit einzelnen Zellen oder Organoidfragmenten für die Beschichtung von "Kuppeln" überführt werden, da sie innerhalb einer Minute zu polymerisieren beginnt. Sobald es in einem Röhrchen polymerisiert ist, kann es nicht mehr in eine Pipettenspitze abgesaugt werden. In diesem Fall kann das Röhrchen auf Eis gelegt werden, bis das Matrigel wieder in eine Flüssigkeit depolymerisiert. Beim vorsichtigen Auf- und Abpipettieren, um einzelne Zellen oder Organoidfragmente mit der Basalmembranmatrix zu vermischen, ist es auch wichtig, die Bildung von Blasen zu vermeiden. Während Blasen in einer "Kuppel" der Basalmembranmatrix die Bildung und das Wachstum von Organoiden nicht zu behindern scheinen, können sie die Visualisierung behindern. Darüber hinaus muss nach dem Aliquotieren der Basalmembranmatrix/Zellmischung in die Well(s) einer Zellkulturplatte die Platte invertiert und in einen Inkubator gelegt werden. Dieser Schritt ist entscheidend, damit die Basalmembranmatrix in eine 3D-"Kuppel"-Form polymerisieren kann und verhindert wird, dass die einzelnen Zellen oder Organoidfragmente auf den Boden der Platte sinken.
Mit diesem Protokoll können Magenorganoide innerhalb von 10 Tagen nach der Einzelzellaussaat identifiziert werden. Die Erfahrung zeigt, dass sich nach dem 10. Tag nur sehr wenige neue Magenorganoide bilden, und tatsächlich kann die Gesamtzahl der Organoide vom 10. bis 20. Tag leicht abnehmen. Dies gilt für Organoide, die sowohl aus dem Magenkörper als auch aus dem Antrum erzeugt werden. Die Gesamtzahl der Organoide, die aus Magen-Antral-Biopsien gebildet werden, ist jedoch deutlich höher als aus Magen-Körper-Biopsien. Darüber hinaus übertrifft das Wachstum von Antral-Organoiden Körper-Organoide zwischen den Tagen 10-20 nach der Einzelzellaussaat bei weitem. Dieser Unterschied kann auf Schwankungen in der Wnt-Sensitivität zurückgeführt werden. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass Magenkörper-PDOs ein besseres Wachstum bei geringerer Wnt-Aktivierung aufweisen, während Magen-Antrum-PDOs bei höherer Wnt-Aktivierung gedeihen20. Der Ort der Magenbiopsien, die zur Erzeugung von Magen-PDOs verwendet werden, ist in der Literatur in der Regel nicht spezifiziert. Solche Unterschiede sollten in zukünftigen Studien berücksichtigt werden, in denen Magen-PDOs verwendet werden, die aus Magenbiopsien verschiedener Magenbereiche gewonnen wurden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Etablierung einer standardisierten Anzahl von Einzelzellen, die pro "Dome"/Well ausgesät werden können, um zuverlässig Magen-PDOs zu erzeugen. Während in einer früheren Studie eine standardisierte Anzahl von Magendrüsen angegeben wurde, die für die PDO-Generierung ausgesät werden sollten, wurde in keiner früheren Studie mit einer Einzelzellverdausmethode die Anzahl der ausgesäten Zellen erwähnt oder ob die Anzahl über verschiedene PDO-Linien hinweg konsistent war. Wenn die Anzahl der ausgesäten Zellen nicht standardisiert wird, kann dies dazu führen, dass eine sehr variable Anzahl von Stammzellen pro "Kuppel"/Vertiefung ausgesät wird. Da Stammzellen die Hauptquelle für die Bildung von Magenorganoiden sind, könnte dies zu unterschiedlichen Raten der Organoidbildung und des Wachstums führen. Daher könnte die Verwendung einer nicht standardisierten Anzahl von Einzelzellen die Interpretation von Bildungs- oder Wachstumsvergleichen über verschiedene PDO-Linien des Magens hinweg verfälschen. Hier wird gezeigt, dass die Standardisierung der Anzahl der ausgesäten Zellen auf 105 Zellen pro "Kuppel"/Vertiefung zuverlässig Magen-PDOs aus Biopsien sowohl des Körpers als auch der Antralregionen des Magens erzeugt.
Dieses Protokoll wurde für die Verwendung von frischem Magenbiopsiegewebe optimiert. Folglich kann der Erfolg dieses Protokolls variieren, wenn gefrorenes Gewebe oder auf andere Weise konserviertes Gewebe verwendet wird. Darüber hinaus gibt es keine Daten darüber, wie lange frische Biopsien lebensfähig bleiben, da das Biopsiegewebe so schnell wie möglich nach der Entnahme aus dem Magen eines Patienten verarbeitet wird. Je länger das frische Gewebe vor der Verarbeitung liegt, desto weniger lebensfähige Zellen werden isoliert.
Die Passage von Magen-PDOs durch Fragmentierung, wie in diesem Protokoll beschrieben, bietet eine einfache Methode für die routinemäßige Passage. Während Magen-PDOs mit dieser Technik bis zu 4 Mal erfolgreich durchgelassen wurden, gab es keine Versuche zu bestimmen, wie oft sie unter Aufrechterhaltung eines stetigen Wachstums und einer stetigen Lebensfähigkeit durchgelassen werden können. Einige Berichte deuten darauf hin, dass sich das Wachstum von Magenorganoiden nach 5 oder mehr Passagen verlangsamen kann21,22, während andere ein zuverlässiges Wachstum für bis zu 10 Passagen beobachtet haben23.
Die in diesem Protokoll verwendeten magenorganoiden Medien enthalten Wnt-3A, Noggin und R-Spondin, die aus konditionierten Medien von L-WRN-Zellen stammen. Zur Herstellung der konditionierten Medien wird ein von Miyoshi und Stappenbeck beschriebenes Protokoll verwendet16. Alternativ können Wnt-3A, Noggin und R-Spondin separat als rekombinante Proteine erworben werden. Der separate Kauf der einzelnen Komponenten ist ideal, um mögliche Chargeneffekte zu vermeiden, die bei der Verwendung von konditionierten Medien aus L-WRN-Zellen auftreten können. Der Kauf der rekombinanten Proteine ist jedoch teuer und kann für Forscher, die häufig mit Organoiden arbeiten, unerschwinglich sein.
Angesichts des zunehmenden Einsatzes von Magen-PDOs in verschiedenen Anwendungen ist es zeitgemäß und notwendig, standardisierte Ansätze zur Erzeugung gutartiger Magen-PDOs zu etablieren. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine zuverlässige Methode für zukünftige Untersuchungen mit Magen-PDOs. Unserer Erfahrung nach hat dieses Protokoll in über 90% der Fälle erfolgreich Organoide aus Biopsien der gutartigen Magenschleimhaut erzeugt.
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Disclosures
Die Autoren haben keine relevanten Angaben.
Acknowledgments
University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA Program am Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
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