拉瓦尔圆角制备：可视化完整感官神经元和相关表皮细胞的方法

Overview

此视频描述了如何准备幼虫圆角，用于可视化感官树突状化 （da） 神经元及其相关的表皮细胞。特色协议详细展示了如何从身体壁上去除肌肉组织，同时保留细胞的形态，从而改善免疫染色和可视化否则模糊的达神经元和表皮细胞。

Protocol

本协议摘自特姆和加维斯，从拉瓦尔圆角去除果蝇肌肉组织，用于感官神经元和表皮细胞免疫荧光分析， J . Vis . Exp . （ 2016 年）。

注： 肌肉切除程序（图1）是修改先前描述的准备幼虫圆角的方法。肌肉切除前后步骤简要概述，读者参考布伦特等人以前在 J.Vis.Exp.（2009年） 和卡里姆和摩尔 ，J.Vis.Exp上的工作。 （2011）更详细的描述。

1. 在冷盐水中解剖拉瓦

1. 准备冷HL3.1盐水或冷Ca²⁺无HL3.1盐水的工作稀释（表1）。将幼虫放在硅胶弹性体盘中，用足够冷的盐水覆盖菜底。
   注： 我们建议在幼虫解剖期间试验使用 Ca²⁺无 HL3.1 盐水与标准 HL3.1 盐水。在没有钙的情况下，幼虫肌肉收缩大大减少。因此，在 Ca^{2+ 无 HL3.1}盐水中解剖幼虫圆角时可能更容易操作。然而，我们发现肌肉收缩在肌肉和表皮之间创造了空间，这可以促进这些组织之间插入钳子，同时最大限度地降低表皮受损的风险。因此，标准HL3.1可能更可取于保持表皮和达神经元的完整性。我们通过盐水获得良好的效果，选择权留给用户。
2. 将幼虫与腹腔侧向上定位。幼虫的腹腔表面可以通过腹部凹陷带和从前部到后部的原幼虫气管的后侧识别。将幼虫拉伸到前后方向，用昆虫针将头部和尾部固定在硅胶弹性体解剖盘上。使用细切剪刀沿心室中线切割，从一端开始，向另一端推进。
   注： 此方向保留了通常研究的达神经元的后部簇。
3. 幼虫被切开后，将四个角钉在解剖盘上，就像打开一本书一样。使用钳子抓住和切除内部器官，包括CNS、肠道和气管。调整昆虫别针，使圆角绷紧，但不会最大伸长。
   注： 肌肉被锚定在身体壁的细分边界。虽然肌肉覆盖了身体的大部分壁，但它们不在后部中线附近的狭窄区域。

2. 肌肉去除

1. 定位幼虫的后部中线，那里没有肌肉组织。将单个钳子插在一个钳子下方，以便可以将其插入最平坦的方向的肌肉组织下面。
2. 从后部中线开始，靠近段前边界，小心地滑动肌肉和表皮之间的钳子，注意尽量减少钳子和表皮之间的接触。
3. 向上拉力，在一个锚点打破肌肉与身体壁的连接。重复此过程，以处理感兴趣的剩余的 Hemi 细分市场。
   注： 此协议优化了每个达神经元凹陷场后部的保存。为了保留树突场前部，最好在每个段的后端插入钳子。
4. 重新调整昆虫别针，使幼虫圆角最大地向四面八方伸展。
5. 修复圆角，而它仍然固定在解剖盘使用冷，新鲜准备的4%甲醛在PBS25分钟。
6. 在PBS中冲洗5次。
7. 使用钳子小心地从剩余的锚点拉开肌肉组织，注意尽量减少与表皮的接触。
8. 将圆角从解剖盘中取出至 1.5 毫升微中福管。执行所有后续的洗涤，阻塞和免疫荧光染色步骤，如卡里姆和摩尔，J.Vis.Exp。 (2011).

Representative Results

图1：肌肉切除程序概述。 幼虫被解剖并固定在硅胶弹性体解剖盘上。为了去除肌肉组织，在肌肉和表皮细胞层之间插入一个钳子爪，从靠近段边界（2.2）的后部中线开始。钳子向上拉，以打破肌肉和身体壁之间的连接 （2.3）。这是重复的兴趣段，然后幼虫固定在甲醛（2.5）。固定后，钳子用于将剩余的肌肉组织与身体壁分离（2.7 - 2.8），幼虫皮质层和表皮用橙色、绿色四级达神经元和红色肌肉描绘。插图 （2.2） 和 （2.7） 表示单个幼虫赫米段的横截面视图。 请单击此处查看此图的更大版本。

1x HL3.1 盐水 （pH 7.2）

5米赫皮斯

70米纳克

5毫克

1.5 mM 卡克莱尔 2 （省略了 Ca2+ 免费盐水）

4毫米毫克2

10米纳赫科3

5米三氯环素

115米蔗糖

过滤消毒并存储在 4 °C

注：构图模仿昆虫淋巴

表1：冷盐水的组成。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4