Larvale filetvoorbereiding: een methode om intacte sensorische neuronen en bijbehorende epidermale cellen te visualiseren

Overview

Deze video beschrijft hoe larvale filets te bereiden die worden gebruikt om sensorische dendritische arborization (da) neuronen en hun bijbehorende epidermale cellen te visualiseren. Het aanbevolen protocol laat in detail zien hoe spierweefsel uit de lichaamswand kan worden verwijderd met behoud van de morfologie van de cellen, wat de immunostaining en visualisatie van de anders verduisterde da-neuronen en epidermale cellen verbetert.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Tenenbaum en Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp. (2016).

OPMERKING: De procedure voor spierverwijdering (figuur 1) is een wijziging van eerder beschreven methoden voor het bereiden van larvale filets. De stappen die voorafgaan aan en volgen op spierverwijdering worden kort geschetst en de lezer wordt verwezen naar eerder werk in Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) en Karim en Moore, J. Vis. Exp. (2011) voor meer gedetailleerde beschrijvingen.

1. Ontleed larve in koude zoutoplossing

1. Bereid een werkverdunning van koude HL3.1 zoutoplossing of koude Ca²⁺-vrije HL3.1 zoutoplossing (Tabel 1). Plaats de larve in een siliconen elastomeerschaal met net genoeg koude zoutoplossing om de bodem van de schaal te bedekken.
   OPMERKING: We raden aan om te experimenteren met het gebruik van Ca²⁺-vrije HL3.1 zoutoplossing versus standaard HL3.1 zoutoplossing tijdens larvale dissectie. Bij afwezigheid van calcium worden larvale spiersamentrekkingen sterk verminderd. Larvefilets kunnen dus gemakkelijker te manipuleren zijn wanneer ze worden ontleed in Ca²⁺-vrije HL3.1-zoutoplossing. We vinden echter dat spiercontractie ruimte creëert tussen de spier en de opperhuid en dit kan het inbrengen van een tang tussen deze weefsels vergemakkelijken en tegelijkertijd het risico op schade aan de epidermis minimaliseren. Als gevolg hiervan kan standaard HL3.1 de voorkeur hebben voor het behoud van de integriteit van de epidermis en da neuronen. We behalen goede resultaten met zoutoplossing en de keuze wordt overgelaten aan de gebruiker.
2. Plaats de larve met de ventrale kant naar boven. Het ventrale oppervlak van de larve kan worden geïdentificeerd door de abdominale deukische riemen en de dorsale kant door de primaire larvale tracheale buizen die van voor naar achter lopen. Strek de larve in de voorste-achterste richting en speld het hoofd en de staart vast aan een siliconen elastomeer dissectieschaal met behulp van insectenpennen. Gebruik een fijne ontleedschaar om langs de ventrale middellijn te snijden, beginnend aan het ene uiteinde en vorderend naar het andere.
   OPMERKING: Deze oriëntatie behoudt de vaak bestudeerde dorsale cluster van da-neuronen.
3. Nadat de larve is opengesneden, speld je de vier hoeken vast aan de ontleedschaal alsof je een boek opent. Gebruik een tang om inwendige organen, waaronder het CZS, de darm en de luchtpijp, vast te pakken en te verwijderen. Stel insectenpennen zo in dat de filet strak maar niet maximaal uitgerekt is.
   OPMERKING: Spieren zijn verankerd aan de lichaamswand bij segmentale grenzen. Hoewel spieren het grootste deel van de lichaamswand bedekken, zijn ze afwezig in een smal gebied in de buurt van de dorsale middellijn.

2. Spierverwijdering

1. Zoek de dorsale middellijn van de larve, waar spierweefsel afwezig is. Plaats een enkele tang prong zodanig dat deze onder het spierweefsel kan worden ingebracht in de vlakst mogelijke oriëntatie.
2. Beginnend bij de dorsale middellijn, in de buurt van de voorste grens van het segment, schuift u de tang voorzichtig tussen de spier en de opperhuid en zorgt u ervoor dat het contact tussen de tang en de epidermis tot een minimum wordt beperkt.
3. Trek de tang omhoog om de aanhechting van de spier aan de lichaamswand op één ankerpunt te verbreken. Herhaal dit proces voor de resterende hemi-segment(en) van belang.
   OPMERKING: Dit protocol optimaliseert het behoud van de posterieure van elk da neuron dendriet veld. Om het voorste deel van het dendrietveld te behouden, is het het beste om de tang aan het achterste uiteinde van elk segment in te voegen.
4. Pas insectenpennen zo aan dat de larvefilet maximaal in alle richtingen wordt uitgerekt.
5. Bevestig de filet terwijl deze nog aan de ontleedschotel is vastgemaakt met behulp van koude, vers bereide 4% formaldehyde in PBS gedurende 25 minuten.
6. Spoel 5 keer in PBS.
7. Gebruik een tang om spierweefsel voorzichtig weg te trekken van de resterende ankerpunten en zorg ervoor dat het contact met de opperhuid wordt geminimaliseerd.
8. Losmaken en verwijder de filet uit de ontleedschaal tot een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voer alle daaropvolgende was-, blokkeer- en immunofluorescentiekleuringsstappen uit, zoals eerder beschreven in Karim en Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figuur 1: Overzicht van spierverwijderingsprocedure. Een larve wordt ontleed en vastgemaakt aan een siliconen elastomeer ontleedschaal. Om spierweefsel te verwijderen, wordt één tangsteek tussen de spier- en epidermale cellaag ingebracht, beginnend bij de dorsale middellijn bij een segmentgrens (2.2). De tang wordt naar boven getrokken om de aanhechting tussen de spier en de lichaamswand te verbreken (2.3). Dit wordt herhaald voor interessesegmenten en vervolgens wordt de larve gefixeerd in formaldehyde (2.5). Na fixatie worden tangen gebruikt om het resterende spierweefsel van de lichaamswand te scheiden (2.7 - 2.8) De larvale cuticula en epidermis worden afgebeeld in oranje, klasse IV da neuronen in groen en spieren in rood. Insets in (2.2) en (2.7) vertegenwoordigen dwarsdoorsnedeaanzichten van een enkel larvaal hemisegment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

1x HL3.1 zoutoplossing (pH 7,2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (weglaten voor Ca2+-vrije zoutoplossing)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM trehalose

115 mM sucrose

Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C

Opmerking: Samenstelling bootst insect hemolymph na

Tabel 1: Samenstelling van koude zoutoplossing.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4