Summary
中間代謝物のGC / MS分析用試料調製のウレアーゼのメソッドは、その発明者によって提示されます。方法は、ワンステップは、単一のプロセスでは炭水化物、有機およびアミノ酸のすべてを定量化することでタンデム質量分析法による先天性のエラーの新生児スクリーニングのフォローアップが可能。
Abstract
米国で生まれたすべての乳児は現在、"先天性代謝異常"と呼ばれる42まれな遺伝性疾患までについてスクリーニングする。スクリーニング方法は、タンデム質量分析に基づいており、有機酸血症のためのスクリーンとしてアシルカルニチンを定量化し、また、アミノ酸を測定しています。すべての州はまた、ガラクトース血症などの炭水化物疾患に対する酵素のテストを実行します。結果になることがあるので肯定的な結果の非特異的、フォローアップ試験は、より決定的な方法を使用して必要です。本報告書では、先天異常のスクリーニングのための試料調製の"ウレアーゼ"の方法を説明します。結晶ウレアーゼ酵素は、他のほとんどの水溶性代謝物が単一の手順でガスクロマトグラフィーのために脱水し、誘導体化することを可能にする体液から尿素を除去するために使用されます。窒素気流下、蒸発による脱水は、アセトニトリルおよび塩化メチレンを添加することにより促進される。その後、トリメチルシリル化はユニークな触媒、トリエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸の存在下で行われます。自動注入とクロマトグラフィーは192代謝物とTMS誘導体化生物学的化合物のマススペクトルの特殊なライブラリを使用してすべての主要な成分の半定量化のマクロ駆動型のカスタム定量化が続いている。分析は、著者から使用可能なマクロとライブラリを使用して広く使われているケミステーションのプラットフォーム上で実行することができる。 、サンプルの結果の17％は、ご注文の医師によって処理されるべき調査結果を明らかにされている - 私たちの研究室では、16,000以上の患者検体は約17％の診断率を持つメソッドを使用して分析されています。約38％が以前の方法を使用して診断されていることができなかった、そのうち180確認先天、以上であるこれらに含まれる。
Protocol
尿サンプルを処理するための手順
- 37℃の水浴中に尿サンプルを解凍。オリジナルが侵害された場合、新しい容器にデカント。
- サンプル13 mlの最大分量を取り、ラベルの付いた円錐遠心管に-20℃で保管してください。
- 屈折計の尿の低下のいくつかを置くことにより、サンプルの光学濃度を測定し記録する。
- 0.2 UMフィルタを通してサンプルをフィルタリングする。
- 光学密度に応じて以下のサンプルの体積を測定する
1.000から1.009 1.00ミリリットル 1.010から1.019 0.50ミリリットル 1.020から1.050 0.25ミリリットル+ 0.25ミリリットルH 2 O - 、10ナノモルD 3メチルマロン酸、100ナノモル以下の13の各C 3乳酸、13 C 3ピルビン酸、13 C 2 15 500ナノモル（ナノモル）3クレアチン：指定されたボリュームは、次の内部標準を含むReactivialに転送されます。 Nグリシン、D 3セリン、D 5フェニルアラニン、D 11 hexanoylglycine、15 N 2オロチン酸、D 4セバシン酸、13 C 6グルコース、D 6イノシトールとD 5トリプトファン。
- 7.5単位/ウレアーゼμlの溶液（Calzymeラボラトリーズカタログ番号116A0100）20マイクロリットル（μl）をしてフラッシュと不活性隔膜を通してCO 2下で密閉され、サンプルに追加されます。
- サンプルは、圧力を維持するために、15分間隔で追加された多くの二酸化炭素ガスで30分間37℃に保持されます。
- ウレアーゼ溶液20μlよりは、バイアルは、二酸化炭素とフラッシュされる、追加、およびサンプルは、さらに15分間37℃に保たれている。
- 30:70アセトン500μlの：メタノールが追加され、ゴム栓はテフロンコーティングされたセプタムに置き換えられ、そしてサンプルを15分間-20℃で冷やしています。
- 固形物は、清浄な2.0 ccのReactivial（スペルコ/シグマ）にデカント回転数1500rpm × 10分間の遠心分離により除去されています
- 次のようにトリエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸（TEA / TFA）（Sigma）を追加します。
- 1.00ミリリットルの試料の20μlの
- 0.5ミリリットル、以下、サンプルの40μlの
- 70窒素気流下でアセトニトリルと場所で締めくくり° C定容が達成されるまで（TEA / TFAは残ります）（〜15分）。
- 沈殿物の形態（〜10分ごと）になるまで、最大4倍に手順13を繰り返します。
- 約2分間冷ます。 （〜4:00分）以上の沸騰を慎重に、そして乾燥され、塩化メチレンで締めくくる。
- ステップ15を繰り返します。
- 以下のレートでMSTFA（N -メチル- N - trimethylsilyltrifluoroacetamide）（科学熱）を追加します。
- 1.00ミリリットルのサンプルの150μlの
- 0.50ミリリットル、以下、サンプルの200μlの
- 70窒素雰囲気とインキュベート下キャップ℃で1時間。
- ガスクロマトグラフ/質量分析計で分析のために、窒素雰囲気下、microvialsに転送する。
- Agilentの5975 GC / MSによる自動注入のためのプレースmicrovials：インストゥルメントの温度は、次のとおりです。インジェクタ200℃、インターフェース250℃、オーブン80℃で1分間C、4時ランプ° C /分で80から130 ° C、ランプで6 ° C /分で130から200 ° C、12時のランプ° C /分で200から285 ° C、10分間保持する。カラム：25メートル、320ミクロンID、0.5ミクロンの膜厚のDB - 5。質量分析：ソース230℃、クアッド150℃、2.46スキャン/秒でスキャン50〜650原子質量単位。溶媒ディレイ3.5分。
代表的な結果
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Discussion
ウレアーゼ法（1）様々な変更と医学文献に62回引用されています。松本氏のグループ（2,3）は、高スループット新生児スクリーニングのための手続きを簡素化し、16000人の患者からの結果を報告した。久原とその他（4-7）先天異常の診断のいくつかのケースでのメソッドの使用を報告し、フォローアップしている。 Rhead（8）また、臨床診断のための方法の有用性を確認し、フォローアップ先天の。メソッドは、全体のミバエとその幼虫（9）のマウス、ゾウやホモジネートをノックアウト、クマの尿に適用されている。部位特異的変異誘発前後クリプトコッカスから培養培地は、ウレアーゼのステップ（10）することなく、分析した。メソッドは、トリプトファン、メチオニンおよびイソロイシンのアミノ酸（11）の経口投与での被験者をロードした後症候群の患者や認知症高齢者のベテランダウン、医学生の人間の栄養評価に適用されている。すべての8つのビタミンB群は、その劣化のある時点で全8ビタミンを必要とする、その中で、三つのアミノ酸の分解産物を定量化することによって評価した。ビタミン補給による医薬品とその緩和の毒性作用は、（12）が報告されています。正常とダウン症候群の妊娠から羊水のサンプルを分析し、（13-15）が報告された。
Disclosures
代謝スクリーニングラボでは、セントルイス大学、非営利法人が所有するCLIAライセンスの臨床検査です。博士のシューメーカーは、実験室での売上高から直接利益をしませんが、ラボの生産から間接的に恩恵を受ける可能性があります。方法、技術、結果、通常の範囲、マクロ、ソフト、ライブラリや結論のいずれも、独自の考えられないとの利害関係者に自由に使用できるようになります。
Acknowledgments
アンソニートーマスのことができる技術援助は感謝されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
