Summary
De urease de methode van monstervoorbereiding voor GC / MS analyse van intermediaire metabolieten wordt gepresenteerd door de uitvinder ervan. De methode maakt een stap-follow-up van de pasgeboren screening op aangeboren afwijkingen door tandem massaspectrometrie door het kwantificeren van koolhydraten, organische en aminozuren allemaal in een enkel proces.
Abstract
Elk kind geboren in de VS is inmiddels gescreend tot 42 zeldzame genetische aandoeningen genaamd "aangeboren stofwisselingsziekten". De screening methode is gebaseerd op tandem massaspectrometrie en kwantificeert acylcarnitines als een scherm voor organische acidemias en ook maatregelen aminozuren. Alle staten voeren ook enzymatische testen op koolhydraten aandoeningen zoals galactosemie. Omdat de resultaten kunnen niet-specifieke, follow-up testen van de positieve resultaten is nodig met behulp van een meer definitieve methode. Het voorliggende rapport beschrijft de "urease" methode van monstervoorbereiding voor aangeboren afwijking screening. Kristallijne urease enzym wordt gebruikt om ureum te verwijderen uit lichaamsvloeistoffen die het mogelijk maakt de meeste andere water oplosbare metabolieten te uitgedroogd en gederivatiseerd worden voor gaschromatografie in een enkele procedure. Onttrekken van water door verdamping in een stikstofstroom wordt vergemakkelijkt door het toevoegen van acetonitril en methyleenchloride. Dan, trimethylsilylation vindt plaats in de aanwezigheid van een unieke katalysator, triethylammonium trifluoracetaat. Geautomatiseerde injectie en chromatografie wordt gevolgd door macro-gedreven custom kwantificering van 192 metabolieten en semi-kwantificatie van elke belangrijke component met behulp van gespecialiseerde bibliotheken van massa spectra van TMS gederivatiseerd biologische verbindingen. De analyse kan worden uitgevoerd op de veelgebruikte Chemstation platform met behulp van de macro's en bibliotheken verkrijgbaar bij de auteur. In ons laboratorium hebben meer dan 16.000 patiënten monsters werden geanalyseerd met behulp van de methode met een diagnostische opbrengst van ongeveer 17% - dat wil zeggen 17% van de monsters resultaten blijkt bevindingen dat verder moet worden gehandeld door de aanvragende arts. Inbegrepen in deze zijn meer dan 180 bevestigd aangeboren fouten, waarvan ongeveer 38% niet hadden kunnen worden gediagnosticeerd met behulp van eerdere methoden.
Protocol
Procedure voor de verwerking Urine monsters
- Ontdooi de urine monster in een 37 ° C waterbad. Giet in een nieuwe container als het origineel in het gedrang.
- Neem een maximale hoeveelheid van 13 ml van het monster en op te slaan bij -20 ° C in een gemerkte conische centrifugebuis.
- Meet en noteer de optische dichtheid van het monster door het plaatsen van een paar druppels urine in de refractometer.
- Filtreer het monster door een 0,2 um filter.
- Meet het volume van het monster onder volgens de optische dichtheid
1.000-1.009 1,00 ml 1.010-1.019 0,50 ml 1.020-1.050 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O - De opgegeven volume is vervolgens overgebracht naar een Reactivial met de volgende interne normen: 500 nanomoles (nmol) 3 Creatine; 10 nmol d 3 methylmalonic zuur; 100 nmol elk van de volgende 13 C 3 lactaat, 13 C 3 pyruvaat, 13 C 2 15 N glycine, d 3 serine, d 5 fenylalanine, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotaat, d 4 sebacinezuur, 13 C 6 glucose, d 6 en d inositol 5 tryptofaan.
- 20 microliter (ul) van een 7,5 eenheden / ul oplossing van urease (Calzyme Laboratories catalogus niet. 116A0100) wordt toegevoegd aan het monster, die vervolgens wordt gespoeld en verzegeld onder CO 2 door middel van een inert septum.
- Het monster wordt gehouden op 37 ° C gedurende 30 minuten met meer kooldioxide gas toegevoegd op 15 minuten om de druk te behouden.
- 20 ui meer van de urease-oplossing wordt toegevoegd, de flacon wordt gespoeld met kooldioxide, en de monster dat op 37 ° C nog 15 minuten.
- 500 pi van 30:70 aceton: methanol wordt toegevoegd, het rubber septum wordt vervangen door een Teflon coating septum, en het monster wordt gekoeld tot -20 ° C gedurende 15 minuten.
- Vaste stoffen worden verwijderd door centrifugeren bij 1500 rpm x 10 minuten daarna overgegoten in een schone 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma)
- Voeg triethylammonium trifluoracetaat (TEA / TFA) (Sigma) als volgt:
- 20 ui voor 1,00 ml monsters
- 40 pi van 0,5 ml of minder, monsters
- Top af met acetonitril en plaats onder een stikstofstroom bij 70 ° C tot constant volume is bereikt (TEA / TFA blijft) (~ 15 minuten).
- Herhaal stap 13, tot 4 keer tot een neerslag vormen (~ 10 minuten).
- Laat afkoelen ongeveer 2 minuten. Top af met methyleenchloride, die voorzichtig met overkoken, en droog (~ 4:00 minuten).
- Herhaal stap 15.
- Voeg MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Thermal Scientific) tegen de volgende tarieven:
- 150 ul voor 1,00 ml monsters
- 200 ul voor 0,50 ml of minder, monsters
- Cap onder een stikstofatmosfeer en incubeer bij 70 ° C gedurende 1 uur.
- Transfer naar microvaatjes, onder een atmosfeer van stikstof, voor analyse op gaschromatograaf / massaspectrometer.
- Plaats microvaatjes voor geautomatiseerde injectie door de Agilent 5975 GC / MS: Instrument temperaturen zijn: injector 200 ° C, de interface 250 ° C, oven 80 ° C gedurende 1 minuut; helling bij 4 ° C / minuut 80 tot 130 ° C, oprit op 6 ° C / minuut 130-200 ° C, helling van 12 ° C / minuut 200-285 ° C, gedurende 10 minuten. Column: 25 m, 320 micron ID, 0,5 micron laagdikte DB-5. Mass Spec: bron 230 ° C, quad 150 ° C, Scan 50 tot 650 amu op 2,46 scans / sec. Oplosmiddel vertraging 3,5 minuut.
Representatieve resultaten
Gelieve Klik hier om de representatieve resultaten te zien.
Discussion
De urease methode (1) werd 62 keer geciteerd in de medische literatuur met verschillende wijzigingen. Matsumoto groep (2,3) vereenvoudigde de procedure voor het high-throughput neonatale screening en de resultaten van 16.000 patiënten. Kuhara en anderen (4-7) hebben melding gemaakt van het gebruik van de methode in diverse gevallen van aangeboren afwijking diagnose en follow-up. Rhead (8) bevestigde ook de methode hulpprogramma voor de klinische diagnose en follow-up van de aangeboren fouten. De methode is toegepast op urine van beren, knock-out muizen, olifanten en homogenaten van hele vruchten vliegen en hun larven (9). Cultuur media van Cryptococcus voor en na plaats-gerichte mutagenese werden ook geanalyseerd, zonder dat de urease stap (10). De methode is toegepast op menselijke voeding beoordeling in medische studenten, het syndroom van Down patiënten en demente bejaarden veteranen na het laden van de patiënten met orale doses van de aminozuren tryptofaan, methionine en isoleucine (11). Alle acht B-vitaminen werden beoordeeld door het kwantificeren van de afbraakproducten van de drie aminozuren die, onder hen verlangen dat elke 8 vitaminen op een bepaald punt in hun degradatie. De toxische effecten van geneesmiddelen en hun mitigatie door vitamine suppletie is gemeld (12). Vruchtwater monsters van normaal en het syndroom van Down zwangerschappen werden geanalyseerd en gerapporteerd (13-15).
Disclosures
De Metabole Screening Lab is een CLIA-licentie klinisch laboratorium in handen van Saint Louis University, een non-profit organisatie. Dr Shoemaker niet direct profiteren van het laboratorium inkomsten, maar kan indirect profiteren van het laboratorium productiviteit. Geen van de methoden, technieken, resultaten, de normale range, macro's, software, bibliotheken of conclusies worden beschouwd als eigendom en zijn vrij beschikbaar voor geïnteresseerden.
Acknowledgments
De bekwame technische bijstand van Anthony Thomas is dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
