Summary
중간 metabolites의 GC / MS 분석을위한 샘플 준비 urease 방법은 그 발명가에 의해 제공됩니다. 방법은 허용 한 단계 모두 단일 프로세스에서 quantifying 탄수화물, 유기 및 아미노산의 탠덤 질량 분광법에 의해 타고난 오류에 대한 신생아 선별의 후속.
Abstract
미국에서 태어난 모든 아기는 이제 '대사 타고난 오류 "라는 희귀한 유전 질환 42까지에 대한 검사를합니다. 심사 방법은 탠덤 질량 분석계에 기초하고 있으며 유기 acidemias을위한 화면으로 acylcarnitines을 단정 또한 아미노산을 측정합니다. 모든 상태는 또한 갈락토 오스 혈증과 같은 탄수화물 장애에 대한 효소 테스트를 수행합니다. 결과가 될 수 있기 때문에 긍정적인 결과가 아닌 특정 후속 테스트는보다 확실한 방법을 사용해야합니다. 현재 보고서는 타고난 오류 검사를위한 샘플 준비의 "urease"방법을 설명합니다. 결정 urease 효소는 대부분의 다른 수용성 metabolites가 한 프로 시저에서 가스 크로마 토그래피를위한 탈수 및 derivatized 수 수 체액에서 요소를 제거하는 데 사용됩니다. 질소 스트림의 증발에 의해 탈수가 acetonitrile과 염화 메틸렌을 추가하여 용이합니다. 그러면 trimethylsilylation는 독특한 촉매, triethylammonium의 trifluoroacetate의 존재에 이루어진다. 자동 분사와 크로마 토그래피는 192 metabolites와 TMS derivatized 생물 학적 화합물의 질량 스펙트럼의 전문 라이브러리를 사용하여 모든 주요 구성 요소의 세미 부량의 매크로 기반의 사용자 정의 부량옵니다. 분석은 저자에서 사용할 수있는 매크로와 라이브러리를 사용하여 널리 사용 Chemstation 플랫폼에서 수행할 수 있습니다. , 샘플 결과의 17 % 주문에 의해 의사에 따라 행동해야 결과를 공개입니다 - 우리 연구실에서 16,000 이상의 환자 샘플을 17 % 정도의 진단 항복과 함께 방법을 사용하여 분석하고 있습니다. 38 %가 이전의 방법을 사용하여 진단되지 않았을 수있는 180 확인 타고난 오류, 이상이 포함되어 있습니다.
Protocol
소변 샘플 처리 절차
- 37 ° C의 물을 욕조에 소변 샘플을 해동. 원본이 손상 됐다면 새 용기에 가만히 따르다.
- 샘플 13 ML 최대 나누어지는를 타고 표시 원뿔 원심 분리기 튜브에서 -20 ° C에서 그것을 저장합니다.
- 측정 및 굴절계의 소변 방울의 커플을 배치하여 시료의 광학 밀도를 기록합니다.
- 0.2 음 필터를 통해 샘플을 필터링합니다.
- 광학 밀도에 따라 아래의 샘플의 볼륨을 측정
1.000-1.009 1.00 ML 1.010-1.019 0.50 ML 1.020-1.050 0.25 ML + 0.25 ML H 2 O - ; 10 nmoles D 3 Methylmalonic 산성, 100 nmoles 다음 13 C 3 락트 산의 각 13 C 3 pyruvate, 13 C 2 15 500 nanomoles (nmoles) 3 크레아틴 : 지정된 볼륨이 다음 내부 표준을 포함하는 Reactivial로 전송됩니다 N 글리신, 세린 D 3, D 5 페닐알라닌, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, D 4 sebacic 산성, 13 C 6 포도당, D 6 이노시톨 및 D 5 트립토판.
- 7.5 단위 / urease의 μl 솔루션 (Calzyme 연구소 카탈로그 안돼. 116A0100) 20 microliters는 (μl) 다음 플러시 및 불활성 심장을 통해 CO 2에 따라 봉인있는 예제에 추가됩니다.
- 더 많은 이산화탄소 가스를 30 분 압력을 유지 15 분 간격으로 추가 ° C가 샘플은 37에서 열립니다.
- urease 솔루션 20 μl 이상은 유리병이 이산화탄소로 플러시이며, 추가 및 예제는 또 다른 15 분 동안 37 ° C에서 관리하고 있습니다.
- 30:70 아세톤 500 μl : 메탄올이, 추가 고무 심장이 테플론 코팅 심장으로 대체되며, 샘플은 15 분 -20 ° C에서 차게됩니다.
- 고체는 다음 깨끗한 2.0 CC Reactivial (Supelco / 시그마)에 decanted 1500 RPM X 10 분 원심 분리에 의해 제거됩니다
- 다음과 같이 triethylammonium의 trifluoroacetate (차 / TFA) (시그마)를 추가합니다
- 1.00 ML 시료 20 μl
- 0.5 ML, 이하, 시료 40 μl
- 70 질소 기류 하에서 acetonitrile과 장소에서 최고 ° C 일정한 볼륨이 달성 때까지 (차 / TFA가 유지됩니다) (~ 15 분).
- 침전 양식 (~ 10 분마다)까지, 4까지 시간을 단계 13를 반복합니다.
- 약 2 분 동안 식지. (~ 4:00 분) 이상의 종기에주의하고, 건조되고, 메틸렌 클로라이드로 내려 톱.
- 15 단계를 반복합니다.
- 다음과 같은 속도로 MSTFA (N - 메틸 - N - trimethylsilyltrifluoroacetamide) (과학 열)를 추가합니다
- 1.00 ML 시료 150 μl
- 0.50 ML, 이하, 시료 200 μl
- 70 질소 분위기와 부화 이하 총액 ° 1 시간 C.
- 가스 크로마토 그래프 / 질량 분석계에 대한 분석, 질소 분위기에서 microvials로 전송합니다.
- 애질런트 5975 GC / MS에 의해 자동 분사에 대한 플레이스 microvials : 악기 온도는 다음과 같습니다 주입기 200 ° C, 인터페이스 250 ° C, 오븐 80 ° 1 분 C, 4 램프 ° C / 분 80-130 ° C, 램프에 6 ° C / 분 130-200 ° C, 12 ° C 램프 / 분 200-285 ° C, 10 분 만요. 칼럼 : 25m, 320 마이크론 ID, 0.5 미크론 필름 두께 DB - 5. 질량 분석기 : 소스 230 ° C, 쿼드 150 ° C, 2.46 스캔 / 초에서 스캔 50-650 AMU. 솔벤트 지연 3.5 분.
대표 결과
주시기 바랍니다 여기를 클릭 대표 결과를 볼 수 있습니다.
Discussion
urease 방법 (1) 다양한 수정 의료 문학에서 62 번 언급되었습니다. 마츠모토의 그룹 (2,3)은 높은 처리량 신생아 검사에 대한 절차를 단순화하고 16,000 환자에서 결과를 발표했다. Kuhara 및 기타 (4-7)은 타고난 오류 진단의 여러 경우에 방법의 사용을보고하고 후속있다. 르헤드 (8) 또한 임상 진단 방법의 유틸리티를 확인하고 후속 타고난 오류. 방법은 전체 과일 파리와 그 유충 (9)의 마우스, 코끼리와 homogenates을 뺏으 곰의 소변에 적용되었습니다. 사이트 감독의 돌연변이 유발 전후 Cryptococcus의 문화 미디어도 urease 단계 (10)없이 분석했다. 방법은, 트립토판과 메티오닌 이소 류신 아미노산 (11)의 경구 복용으로 과목을 로딩 후 증후군 환자와 미친 노인 퇴역 군인 다운, 의대생 인간의 영양 평가에 적용되었습니다. 몽땅 B - 비타민은 그들 가운데 자신의 저하 특정 시점에 총 8 개의 비타민을 필요로, 세 가지 아미노산의 분해 제품을 quantifying에 의해 평가되었다. 비타민 보완하여 의약품과 완화의 독성 효과 (12)보고되었습니다. 정상 및 다운 증후군의 임신에서 양수 샘플 분석 및 (13-15)보고되었다.
Disclosures
신진 대사 선별 연구소는 세인트 루이스 대학, 비영리 법인이 소유한 CLIA - 라이선스 임상 연구소입니다. 슈메이커 박사는 실험실의 수익에서 직접 수익을하지 않지만 실험실 생산성의 간접적 혜택을 수도 있습니다. 방법, 기술, 결과, 정상 범위, 매크로, 소프트웨어, 라이브러리 또는 결론의 아무도 독점적인 것으로 간주되지 및 이해 관계자에게 자유롭게 사용할 수 있습니다.
Acknowledgments
안소니 토마스의 수 기술 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
