Summary
Üreaz yöntemi aracı metabolitlerin GC / MS analizi için numune hazırlama, mucit tarafından sunulmaktadır. Bu yöntem, bir adım, tek bir süreç niceleme karbonhidratlar, organik ve amino asitler tandem kütle spektrometresi ile doğumsal yenidoğan tarama takip.
Abstract
ABD'de doğan her çocuk artık "doğuştan metabolizma" olarak adlandırılan 42 nadir genetik bozukluklar kadar gösterildi. Tarama yöntemi, tandem kütle spektrometresi ve organik acidemias için bir ekran olarak acylcarnitines rakamlarla ve aynı zamanda amino asitler ölçer. Bütün devletler, galaktozemi gibi karbonhidrat bozuklukları için enzimatik test uygulayın. Olumlu sonuçlar non-spesifik takip test sonuçları olabileceğinden daha kesin bir yöntem kullanılarak gerekli. Bu rapor, doğuştan gelen bir hata tarama için numune hazırlama "üreaz" yöntemi açıklanmıştır. Kristal üreaz enzim üre, en diğer suda eriyen metabolitleri, tek bir işlem olarak gaz kromatografisi için kurutulmuş ve derivatized izin vücut sıvıları kaldırmak için kullanılır. Buharlaşma yoluyla azot akışı Dehidrasyon asetonitril ve metilen klorür ekleyerek kolaylaştırılır. Sonra, trimethylsilylation eşsiz bir katalizör, triethylammonium trifluoroacetate varlığı yer alır. Otomatik enjeksiyon ve kromatografi 192 metabolitleri ve TMS derivatized biyolojik bileşiklerin kütle spektrumları özel kütüphaneleri kullanılarak her büyük bileşeni yarı kantifikasyon makro odaklı özel kantifikasyon tarafından takip edilmektedir. Yazarın mevcut makro ve kütüphaneleri kullanarak yaygın olarak kullanılan ChemStation platformu analizi yapılabilir. , Numunelerin sonuçlarının% 17 sipariş hekim tarafından ona göre hareket edilmelidir bulgular ortaya olduğunu Laboratuvarımızda, yaklaşık% 17 bir tanısal yöntem kullanılarak 16.000 'den fazla hasta numunelerinin analiz edilmiştir. Yaklaşık% 38 önceki yöntemler kullanılarak tanı bulunmamış olan 180 teyit doğuştan hataları üzerinden bu dahildir.
Protocol
İdrar Örnekleri İşlem Prosedürü
- 37 ° C su banyosu içinde idrar örneği Çözülme. Orijinal tehlikeye yeni bir kap içine süzün.
- Maksimum 13 ml örnek bir kısım etiketli konik santrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
- Ölçü ve birkaç damla idrar refraktometre koyarak örnek optik yoğunluk kayıt.
- Filtre 0.2 um filtresi aracılığıyla örnek.
- Optik yoğunluğuna göre aşağıda örnek hacmi ölçün
1.000-1.009 1.00 ml 1.010-1.019 0.50 ml 1.020-1.050 0.25 ml + 0.25 ml H 2 O - 10 nmoles d 3 metilmalonik asit; her biri 100 nmoles aşağıdaki 13 C 3 laktat, 13 C 3 piruvat, 13 C 2 15 500 nanomol (nmoles) 3 Kreatin: Belirtilen birimi aşağıdaki iç standartları içeren bir Reactivial aktarılır N glisin, d 3 serin, d 5 fenilalanin, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d 4 sebacic asit, 13 C 6 glikoz, d 6 inositol ve d 5 triptofan.
- 7.5 Birimler / üreaz ul çözüm (Calzyme Laboratuvarları katalog no. 116A0100) 20 mikrolitre (ul) sonra kızardı ve inert bir septum ile CO 2 altında mühürlü örnek eklenir.
- Örnek 37 daha fazla karbon dioksit gazı ile 30 dakika basınç korumak için, en az 15 dakikalık aralıklarla eklendi ° C yapılır.
- Üreaz çözeltisi ul 20 daha fazla karbon dioksit flakon ile temizlendi eklendi ve örnek bir 15 dakika boyunca 37 ° C'de tutulur.
- 500 ul 30:70 aseton, metanol eklenir Kauçuk septum, Teflon kaplı septum ile değiştirilir ve örnek 15 dakika boyunca -20 ° C'de soğutulmuş.
- Katılar sonra temiz bir 2.0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) içine dekante x 1500 devirde 10 dakika santrifüj tarafından kaldırıldı.
- Triethylammonium trifluoroacetate (TİM / TFA) (Sigma) aşağıdaki gibi ekleyin:
- 1.00 mL örnekleri için 20 ul
- 0.5 ml veya daha az, numuneler için 40 ul
- Asetonitril ve yeri ile bir azot akışı altında 70 ° C sabit hacim elde edilinceye kadar (ÇAY / TFA kalacaktır) (~ 15 dakika).
- Çökelti formları kadar (~ 10 dakika her), 4 kata kadar adım 13 tekrarlayın.
- Yaklaşık 2 dakika soğumasını bekleyin. (4:00 dakika) üzerinde kaynatın dikkatli ve kuru olması, metilen klorür ile kapalı üst.
- 15. adımı yineleyin.
- Aşağıdaki oranlarda MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Bilimsel Termal) ekleyin:
- 1.00 mL örnekleri için 150 ul
- 200 ml, 0.50 veya daha az, örnekler ul
- Cap, azot atmosferi ve inkübe altında 70 ° C 1 saat.
- Gaz kromatograf / kütle spektrometresi ile analiz için, bir azot atmosferi altında microvials transfer.
- Agilent 5975 GC / MS ile otomatik enjeksiyon yeri microvials: Cihaz sıcaklıkları: enjektör 200 ° C, arabirim 250 ° C fırında 80 ° C 1 dakika boyunca, rampa, 4 ° C / dakika 80-130 ° C, rampa 6 ° C / dakika 130-200 ° C, rampa, 12 ° C / dakika 200-285 ° C, 10 dakika tutun. Sütun: 25 m, 320 mikron kimliği, 0.5 mikron film kalınlığı DB-5. Kütle Özellikleri: kaynak 230 ° C, quad 150 ° C, 2.46 tarama / sn Tarama 50-650 amu. Solvent gecikme 3,5 dakika.
Temsilcisi Sonuçlar
Lütfen buraya tıklayın temsilcisi sonuçları görmek için.
Discussion
Üreaz yöntemi (1) çeşitli değişiklikler ile tıp literatüründe 62 kez atıf yapıldı. Matsumoto grubu (2,3), yenidoğan tarama için yüksek verimli işlemi basitleştirilmiş ve 16000 hastalarda elde edilen sonuçlar bildirdi. Kuhara ve diğerleri (4-7), birkaç olguda doğuştan hata tanı yöntemi kullanımı rapor ve takip var. Motörhead (8) ayrıca klinik tanısı için yöntemin faydaları doğruladı ve takip doğuştan. Bu yöntem tüm meyve sinekleri ve onların larvaları (9), fare, filler ve homojenatlarında knock-out, ayıların idrar tatbik edilmiştir. Site directed mutagenesis önce ve sonra Cryptococcus Kültür (10) üreaz adım olmadan medya da analiz edildi. Bu yöntem, triptofan, metionin ve izolösin amino asitlerin (11) oral dozlarda konular yükledikten sonra Down sendromlu hastalarda ve Demanslı yaşlı gazileri, tıp öğrencileri insan beslenme değerlendirmesi için uygulanan olmuştur. Tüm sekiz B vitaminleri, aralarında kendi bozulması bazı noktada 8 vitaminli gerektiren üç amino asit yıkım ürünleri niceleme değerlendirildi. Vitamini takviyesi, ilaç ve onların azaltma toksik etkileri (12) bildirilmiştir. Normal ve Down sendromu gebelik amniyon sıvısı örnekleri analiz ve rapor edilmiştir (13-15).
Disclosures
Metabolik Tarama Laboratuarı, Saint Louis Üniversitesi, kar amacı gütmeyen bir şirket tarafından sahip olunan bir CLIA lisanslı klinik laboratuvar. Dr Shoemaker laboratuar gelirlerinin doğrudan kâr değil, ancak laboratuar verimlilik dolaylı olarak yarar sağlayabilir. Yöntemler, teknikler, sonuçlar, normal sınırlarda, makro, yazılım, kütüphaneler veya sonuçların hiçbiri özel olarak kabul edilir ve ilgili tarafların serbestçe kullanılabilir.
Acknowledgments
Anthony Thomas bir teknik yardım minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
