Summary
השיטה urease של הכנת המדגם לניתוח GC / MS של מטבוליטים מתווך מוצג על ידי הממציא שלה. השיטה מאפשרת צעד אחד המעקב של ההקרנה היילוד עבור הטעויות המולדות של ספקטרומטריית מסה במקביל על ידי פחמימות לכימות, אורגני וחומצות אמינו בתהליך כל אחד.
Abstract
כל תינוק נולד בארה"ב מוקרן כעת לתקופה של עד 42 הפרעות גנטית נדירה בשם "הטעויות המולדות של חילוף החומרים". שיטת ההקרנה מבוסס על טנדם ספקטרומטריית מסה מכמת acylcarnitines כמסך עבור acidemias אורגני וגם אמצעים חומצות אמינו. כל המדינות גם לבצע בדיקות אנזימטיות להפרעות פחמימות כגון galactosemia. כי התוצאות עלולות להיות בלתי ספציפיים, מעקב ובדיקה של תוצאות חיוביות נדרש בשיטה מוחלטות יותר. הדו"ח הנוכחי מתאר את "urease" השיטה של הכנת המדגם להקרנה שגיאה מולדת. אנזים urease הקריסטל משמש כדי להסיר אוריאה מתוך נוזלי הגוף המתירה ביותר אחרות מסיסים במים מטבוליטים להיות מיובש derivatized עבור גז כרומטוגרפיה בהליך אחד. התייבשות על ידי אידוי בזרם החנקן הוא הקל על ידי הוספת אצטוניטריל ו מתילן כלוריד. ואז, trimethylsilylation מתקיים בנוכחות זרז trifluoroacetate ייחודי, triethylammonium. הזרקת כרומטוגרפיה אוטומטיים מלווה כימות מאקרו מונחה מותאם אישית של 192 מטבוליטים למחצה כימות של כל רכיב מרכזי באמצעות ספריות המקצועית של ספקטרה המונית של תרכובות ביולוגיות derivatized TMS. הניתוח עשוי להתבצע על פלטפורמה בשימוש נרחב Chemstation באמצעות פקודות מאקרו וספריות זמין המחבר. במעבדה שלנו, מעל 16,000 דגימות המטופל כבר ניתחו בשיטת אבחון עם תשואה של כ 17% - כלומר, 17% את תוצאות דגימות לחשוף ממצאים שיש פעל על ידי הרופא ההזמנה. כולל אלה מעל 180 הטעויות המולדות אישר, מתוכם כ 38% לא יכול היה להיות מאובחן בשיטות הקודמות.
Protocol
נוהל עיבוד דגימות שתן
- ההפשרה דגימת שתן בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. למזוג לתוך מיכל חדש אם המקורי נפגעת.
- קחו aliquot מרבי של 13 מ"ל של המדגם ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס בצינור שכותרתו צנטריפוגה חרוטי.
- מדוד ורשום את צפיפות אופטית של המדגם על ידי הצבת כמה טיפות של שתן refractometer.
- סנן המדגם 0.2 באמצעות מסנן אממ.
- מדדו את היקף המדגם מתחת לפי צפיפות אופטית
1.000-1.009 1.00 מ"ל 1.010-1.019 0.50 מ"ל 1.020-1.050 0.25 מ"ל + 0.25 מ"ל H 2 O - נפח המצוין הוא הועבר לאחר מכן Reactivial המכיל את הסטנדרטים הפנימיים הבאים: 500 nanomoles (nmoles) 3 קריאטין; 10 nmoles ד 3 חומצה methylmalonic: 100 nmoles כל אחד 13 הבאים C 3 לקטט, 13 C 3 pyruvate, 13 ג'2 15 N גליצין, סרין 3 ד, ד 5 פנילאלנין, ד 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, חומצה 4 ד sebacic, 13 גלוקוז 6 C, D ו - אינוסיטול 6 ד 5 טריפטופן.
- 20 מיקרוליטר (μl) של 7.5 יחידות / פתרון μl של urease (Calzyme מעבדות מס. 116A0100) מתווסף המדגם, שהוא הסמיק ואז חתום תחת CO 2 דרך מחיצת אינרטי.
- המדגם נערך על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם יותר גז פחמן דו חמצני נוסף ב 15 דקות intervals לשמור על הלחץ.
- 20 μl יותר של הפתרון urease הוא הוסיף, את הבקבוקון הוא הסמיק עם דו תחמוצת הפחמן, ועל המדגם שמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- 500 μl של אצטון 30:70: מתנול הוא הוסיף, מחצה גומי מוחלף מחצה מצופה טפלון, ועל המדגם הוא מקורר ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- מוצקים יוסרו על ידי צנטריפוגה ב 1500 סל"ד x 10 דקות לאחר מכן יצק לתוך נקי 2.0 סמ"ק Reactivial (Supelco / סיגמא)
- הוסף trifluoroacetate triethylammonium (תה / TFA) (Sigma) כדלקמן:
- 20 μl של 1.00 דגימות מ"ל
- 40 μl של 0.5 מ"ל, או פחות, דגימות
- למעלה מן עם אצטוניטריל מקום תחת זרם חנקן על 70 מעלות צלזיוס עד נפח קבוע מושגת (תה / TFA יישאר) (~ 15 דקות).
- חזור על שלב 13, עד 4 פעמים עד לקבלת משקע (~ 10 דקות כל אחד).
- בואו מגניב כ -2 דקות. למעלה מן עם מתילן כלוריד, נזהר של לרתוח, ויבש (~ 4:00 דקות).
- חזור על שלב 15.
- הוסף MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (תרמי מדעי) בשיעורים הבאים:
- 150 μl של 1.00 דגימות מ"ל
- 200 μl של 0.50 מ"ל, או פחות, דגימות
- שווי תחת אווירה חנקן לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- העברה microvials, תחת אווירה חנקן, לניתוח על ספקטרומטר כרומטוגרף / מסת הגז.
- Microvials מקום להזרקה אוטומטית על ידי 5975 Agilent GC / MS: טמפרטורות כלי הם: מזרק 200 ° C, ממשק 250 מעלות צלזיוס, בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1; כבש ב 4 ° C / דקה 80-130 ° C, כבש ב 6 ° C / דקה 130-200 מעלות צלזיוס, כבש ב 12 ° C / דקה 200-285 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 10 דקות. טור: 25 מ ', 320 מיקרון מזהה, סרט 0.5 מיקרון עובי DB-5. Spec המוניים: מקור 230 ° C, מרובע 150 ° C, סריקה 50-650 האמו ב 2.46 סריקות / sec. מרכך עיכוב 3.5 דקות.
נציג תוצאות
אנא לחץ כאן כדי לראות את התוצאות נציג.
Discussion
השיטה urease (1) צוטט 62 פעמים בספרות הרפואית עם שינויים שונים. הקבוצה של מאטסומוטו (2,3) לפשט את הליך המיון תפוקה גבוהה בילוד ודיווח על תוצאות מ 16,000 חולים. Kuhara ואחרים (07/04), דיווחו על שימוש בשיטת בכמה מקרים של אבחון שגיאה מולדות ומעקב. Rhead (8) אישר גם השירות של שיטה לאבחון קליני ומעקב של הטעויות המולדות. השיטה יושמה שתן של דובים, עקום החוצה עכברים, פילים homogenates של זבובי פירות שלמים הזחלים שלהם (9). התקשורת והתרבות מ קריפטוקוקוס לפני ואחרי mutagenesis אתר מכוונת נותחו גם בלי לשלב urease (10). השיטה יושמה הערכה תזונתית האדם סטודנטים לרפואה, תסמונת דאון בחולים וותיקי קשישים מטורפים לאחר טעינת נבדקים עם האכלות של חומצות אמינו טריפטופן, מתיונין isoleucine (11). Eight כל ויטמינים B-הוערכו על ידי לכימות מוצרי פירוט של שלוש חומצות אמינו, אשר ביניהם, לדרוש את כל הוויטמינים 8 בשלב כלשהו השפלה שלהם. ההשפעות הרעילות של תרופות להפחתת שלהם על ידי תוספת ויטמין דווחה (12). דגימות מי השפיר של הריונות תסמונת דאון נורמלי נותחו דיווחו (13-15).
Disclosures
המעבדה הקרנת מטבולית היא מעבדה מורשית CLIA-קליניים בבעלות אוניברסיטת סנט לואיס, תאגיד ללא מטרות רווח. ד"ר סנדלר לא רווח ישירות בהכנסות מעבדה, אך הוא עשוי ליהנות בעקיפין מן התפוקה מעבדה. אף אחד שיטות, טכניקות, תוצאות, טווחי רגיל, פקודות מאקרו, ספריות תוכנה או מסקנות נחשבים קנייני זמינים באופן חופשי לכל המעוניין.
Acknowledgments
הסיוע הטכני יכול של אנתוני תומאס הוא הודה בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
