Summary
Die Urease-Methode der Probenvorbereitung für die GC / MS-Analyse der Vermittler Metaboliten von seinem Erfinder vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht in einem Schritt Follow-up der Neugeborenen-Screening auf angeborene Störungen durch Tandem-Massenspektrometrie durch Quantifizierung Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren alle in einem einzigen Prozess.
Abstract
Jedes Kind in den USA geboren ist nun für bis zu 42 seltene genetische Krankheiten abgeschirmt als "angeborene Stoffwechselstörungen." Die Screening-Methode beruht auf Tandem-Massenspektrometrie und quantifiziert Acylcarnitine als Bildschirm für organische acidemias und misst auch Aminosäuren. Alle Staaten führen auch enzymatische Tests für den Kohlenhydrat-Erkrankungen wie Galaktosämie. Da die Ergebnisse können unspezifische, Follow-up-Tests positive Ergebnisse ist erforderlich, über eine genauere Methode. Der vorliegende Bericht beschreibt die "Urease" Methode der Probenvorbereitung für die angeborene Störung Screening. Crystalline Enzym Urease wird Harnstoff aus Körperflüssigkeiten, die meisten anderen wasserlöslichen Metaboliten werden entwässert und derivatisiert für die Gaschromatographie in einem einzigen Verfahren erlaubt zu entfernen. Dehydration durch Verdunstung in einem Stickstoffstrom wird durch Zugabe von Acetonitril und Methylenchlorid erleichtert. Dann nimmt Trimethylsilylierung Platz in der Gegenwart eines einzigartigen Katalysator, Triethylammonium Trifluoracetat. Automated-Einspritzung und Chromatographie wird durch Makro-driven eigene Quantifizierung von 192 Metaboliten und Semi-Quantifizierung von allen wichtigen Komponente mit Fachbibliotheken der Massenspektren von TMS derivatisiert biologischen Verbindungen gefolgt. Die Analyse kann auf der weit verbreiteten Chemstation Plattform mit den Makros und Bibliotheken erhältlich vom Autor durchgeführt werden. In unserem Labor haben über 16.000 Patientenproben untersucht mit der Methode mit einer diagnostischen Ausbeute von etwa 17% - das ist, zeigen 17% der Proben Ergebnisse Ergebnisse, die auf vom Besteller Arzt gehandelt werden sollte. Eingeschlossen in diesen sind über 180 bestätigte angeborenen Fehler, von denen etwa 38% nicht diagnostiziert worden konnte mit den bisherigen Methoden.
Protocol
Verfahren zur Bearbeitung der Urinproben
- Thaw die Urinprobe in einem 37 ° C Wasserbad. Dekantieren in einen neuen Container, wenn die ursprüngliche gefährdet ist.
- Nehmen Sie ein Maximum Aliquot von 13 ml der Probe und speichern Sie es bei -20 ° C in einer markierten konisches Zentrifugenröhrchen.
- Messen und notieren die optische Dichte der Probe, indem Sie ein paar Tropfen Urin in das Refraktometer.
- Filtern Sie die Probe durch ein 0,2 um-Filter.
- Messen Sie das Volumen der Probe unterhalb entsprechend der optischen Dichte
1,000-1,009 1,00 ml 1,010-1,019 0,50 ml 1,020-1,050 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O - Die angegebene Menge wird dann auf eine Reactivial übertragen mit folgenden internen Standards: 500 Nanomol (nMol) 3 Creatine, 10 nmol d 3 Methylmalonsäure; 100 nmol jedes der folgenden 13 C 3 Laktat, 13 C 3-Pyruvat, 13 C 2 15 N Glycin, Serin d 3, d 5 Phenylalanin, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 Orotat, d 4 Sebacinsäure, 13 C 6 Glukose, d 6 Inositol und d 5 Tryptophan.
- 20 Mikroliter (ul) von 7,5 Einheiten / ul Lösung von Urease (Calzyme Laboratories Katalog-Nr. 116A0100) wird auf die Probe, die dann gespült und versiegelt unter CO 2 durch eine inerte Septum zugegeben.
- Die Probe wird bei 37 ° C für 30 Minuten mit mehr Kohlendioxid aufgenommen Abstand von 15 Minuten, um den Druck aufrecht zu erhalten.
- 20 pl mehrere der Urease-Lösung zugegeben, die Flasche mit Kohlendioxid gespült, und die Probe bei 37 ° C für weitere 15 Minuten gehalten.
- 500 ul von 30:70 Aceton: Methanol versetzt, das Gummiseptum ist mit einer Teflon beschichteten Septum ersetzt, und die Probe wird bei -20 ° C für 15 Minuten gekühlt.
- Die Feststoffe werden durch Zentrifugation bei 1500 rpm x 10 Minuten, dann in ein sauberes 2,0 ccm Reactivial (Supelco / Sigma) dekantiert entfernt
- Add triethylammonium Trifluoracetat (TEA / TFA) (Sigma) wie folgt:
- 20 pl für 1,00 ml-Proben
- 40 pl für 0,5 ml oder weniger Proben
- Top off mit Acetonitril und unter einem Stickstoffstrom bei 70 ° C bis zum konstanten Volumen erreicht ist (TEA / TFA bleiben) (~ 15 Minuten).
- Wiederholen Sie Schritt 13, bis zu 4 mal, bis sich ein Niederschlag bildet (~ 10 Minuten).
- Lassen Sie für etwa 2 Minuten abkühlen lassen. Top off mit Methylenchlorid, wobei darauf geachtet von überkochen und trocken (~ 4:00 Minuten).
- Wiederholen Sie Schritt 15.
- Add MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyl) (Thermal Scientific) zu folgenden Konditionen:
- 150 mu l für 1,00 ml-Proben
- 200 ul für 0,50 ml oder weniger Proben
- Cap unter einer Stickstoffatmosphäre und Inkubieren bei 70 ° C für 1 Stunde.
- Transfer zum Mikrolitergefäßen, unter Stickstoffatmosphäre, für die Analyse auf Gaschromatograph / Massenspektrometer.
- Legen Sie Mikrolitergefäßen für die automatisierte Injektion von der Agilent 5975 GC / MS: Instrument Temperaturen sind: Injektor 200 ° C, Schnittstelle 250 ° C, Backofen 80 ° C für 1 Minute; Rampe bei 4 ° C / Minute 80-130 ° C, Rampe 6 ° C / Minute 130-200 ° C, Rampe bei 12 ° C / Minute 200-285 ° C für 10 Minuten halten. Column: 25 m, 320 micron ID, 0,5 Mikron Schichtdicke DB-5. Massenspektrometrie: Quelle 230 ° C, Quad 150 ° C, Scan 50-650 amu bei 2,46 Scans / Sek. Solvent Delay 3,5 Minuten.
Repräsentative Ergebnisse
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Discussion
Die Urease-Methode (1) wurde 62 Mal in der medizinischen Literatur mit verschiedenen Modifikationen zitiert. Matsumoto Gruppe (2,3) vereinfacht das Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening bei Neugeborenen und berichtete über die Ergebnisse von 16000 Patienten. Kuhara und andere (4-7) haben die Verwendung der Methode in mehreren Fällen von angeborener Diagnose gemeldet und Follow-up. Rhead (8) bestätigte auch die Methode der Nutzen für die klinische Diagnostik und Follow-up von angeborenen Fehlern. Die Methode hat den Urin von Bären angewendet wurde, knock-out Mäuse, Elefanten und Homogenaten von ganzen Fruchtfliegen und deren Larven (9). Kulturmedien von Cryptococcus vor und nach der Mutagenese wurden ebenfalls analysiert, ohne die Urease Schritt (10). Das Verfahren wurde für die menschliche Ernährung Beurteilung wurde in Medizinstudenten angewendet, Down-Syndrom-Patienten und dementen älteren Veteranen nach dem Laden der Patienten mit oraler Gabe von Aminosäuren Tryptophan, Methionin und Isoleucin (11). Alle acht B-Vitamine wurden durch Quantifizierung der Abbauprodukte der drei Aminosäuren, die, unter ihnen verlangen, dass alle 8 Vitaminen zu irgendeinem Zeitpunkt in ihrem Abbau bewertet. Die toxischen Wirkungen von Arzneimitteln und deren Minderung durch Vitamin-Supplementierung ist berichtet worden (12). Fruchtwasser Proben von normalen und Down-Syndrom Schwangerschaften wurden analysiert und berichtet (13-15).
Disclosures
Das Stoffwechsel-Screening-Labor ist ein CLIA-lizenzierten klinischen Labor durch Saint Louis University, einer Non-Profit Corporation. Dr. Shoemaker nicht direkt profitieren von Labor-Umsätze, kann aber indirekt profitieren die Produktivität im Labor. Keine der Methoden, Techniken, Ergebnisse, normal reicht, Makros, Software, Bibliotheken oder Schlussfolgerungen sind als proprietäre und sind frei interessierten Kreisen zur Verfügung.
Acknowledgments
Die Lage der technischen Hilfe von Anthony Thomas wird dankbar anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
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