Summary
Ureas metoden för provberedning för GC / MS-analys av mellanhand metaboliter presenteras av dess uppfinnare. Metoden möjliggör ett steg uppföljning av nyfödda screening för medfött fel genom tandem masspektrometri genom att kvantifiera kolhydrater, organiska och aminosyror allt i en enda process.
Abstract
Varje barn föds i USA är nu kontrolleras för upp till 42 sällsynta genetiska sjukdomar kallas för "medfödda metabolism". Den screeningmetod är baserad på tandem masspektrometri och kvantifierar acylcarnitines som en skärm för ekologisk acidemias och även åtgärder aminosyror. Alla stater utför även enzymatiska tester för kolhydrater sjukdomar som galaktosemi. Eftersom resultaten kan vara ospecifika, uppföljning testning av positiva resultat krävs med hjälp av en mer definitiv metod. Den här rapporten beskriver "ureas" metoden för provberedning för medfödda fel screening. Kristallina ureas enzym används för att ta bort urea från kroppsvätskor som tillåter de flesta andra vattenlösliga metaboliter vara uttorkad och derivatiserade för gaskromatografi i ett enda förfarande. Uttorkning genom indunstning i kvävgas underlättas genom att lägga acetonitril och metylenklorid. Sedan tar trimethylsilylation rum i närvaro av en unik katalysator, triethylammonium trifluoroacetate. Automatiserad injektion och kromatografi följs av makro-drivna anpassade kvantifiering av 192 metaboliter och semi-kvantifiering av varje större komponent med hjälp av specialiserade bibliotek massa spektra av TMS derivatiserade biologiska föreningar. Analysen kan utföras på den utbredda Chemstation plattform med hjälp av makron och bibliotek kan erhållas från författaren. I vårt laboratorium har över 16.000 patientprover har analyserats med hjälp av metoden med en diagnostisk avkastning på ca 17% - dvs 17% av proverna resultaten visar fynd som bör åtgärdas av den beställande läkaren. I dessa finns över 180 bekräftade medfödda, varav ca 38% inte skulle ha kunnat diagnostiseras med hjälp av tidigare metoder.
Protocol
Förfarande för behandling av urinprov
- Tina urinprovet i ett 37 ° C vattenbad. Häll i en ny behållare om originalet är äventyras.
- Ta en maximal delmängd av 13 ml av provet och förvara det vid -20 ° C i en märkt koniskt centrifugrör.
- Mät och anteckna den optiska densiteten av provet genom att placera ett par droppar urin i refraktometer.
- Filtrera provet genom en 0,2 um filter.
- Mät ut provvolym nedan enligt den optiska densiteten
1,000-1,009 1,00 ml 1,010-1,019 0,50 ml 1,020-1,050 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O - Den angivna volymen är överförs sedan till en Reactivial innehåller följande interna normer: 500 nanomoles (nmoles) 3 Kreatin, 10 nmoles d 3 metylmalonsyra, 100 nmoles vardera av följande 13 C 3 laktat, 13 C 3 pyruvat, 13 C 2 15 N glycin, d 3 serin, d 5 fenylalanin, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d 4 sebacinsyra, 13 C 6 glukos, D 6 inositol och d. 5 tryptofan.
- 20 mikroliter (l) i en 7,5 enheter / l lösning av ureas (Calzyme Laboratories katalog nr. 116A0100) tillsätts provet, som sedan spolas och förseglas under CO 2 genom ett inert septum.
- Provet hålls vid 37 ° C i 30 minuter med mer koldioxid added at 15 minuters intervaller för att upprätthålla trycket.
- 20 l mer av ureas lösningen tillsätts flaskan spolas med koldioxid, och provet hålls vid 37 ° C i ytterligare 15 minuter.
- 500 ìl 30:70 aceton: metanol, gummiproppen ersätts med en teflonbelagd septum, och provet kylt vid -20 ° C i 15 minuter.
- Fasta ämnen avlägsnas genom centrifugering vid 1500 rpm x 10 minuter sedan dekanteras i en ren 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma)
- Lägg triethylammonium trifluoroacetate (TEA / TFA) (Sigma) enligt följande:
- 20 l till 1,00 ml prov
- 40 l för 0,5 ml eller mindre, prover
- Toppa med acetonitril och rum under en kvävgas vid 70 ° C tills konstant volym uppnås (TEA / TFA förblir) (~ 15 minuter).
- Upprepa steg 13, upp till 4 gånger tills en fällning (~ 10 minuter).
- Låt svalna i cirka 2 minuter. Toppa med metylenklorid, var försiktig med koka över, och torr (~ 4:00 minuter).
- Upprepa steg 15.
- Lägg MSTFA (N-metyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Termisk vetenskapliga) på följande satser:
- 150 l för 1,00 ml prov
- 200 l för 0,50 ml eller mindre, prover
- Cap under en kväveatmosfär och inkubera vid 70 ° C i 1 timme.
- Transfer till microvials under kväveatmosfär, för analys på gaskromatograf / masspektrometer.
- Placera microvials för automatiserad injektion av Agilent 5975 GC / MS: Instrument temperaturer: Injektor 200 ° C, gränssnitt 250 ° C ugn 80 ° C under 1 minut, ramp vid 4 ° C / minut 80-130 ° C, ramp vid 6 ° C / minut 130-200 ° C, ramp vid 12 ° C / minut 200-285 ° C, håll i 10 minuter. Kolumn: 25 m, 320 micron ID, 0,5 micron tjocklek DB-5. Mass Spec: Source 230 ° C, quad 150 ° C, Scan 50-650 AMU på 2,46 scanningar / sek. Lösningsmedel försening 3,5 minuter.
Representativa resultat
Vänligen klicka här för att se representativa resultat.
Discussion
Ureas metod (1) har blivit citerad 62 gånger i den medicinska litteraturen med olika modifikationer. Matsumoto grupp (2,3) förenklat förfarande för high-throughput neonatal screening och rapporterade resultat från 16 tusen patienter. Kuhara och andra (4-7) har rapporterat att använda metoden i flera fall av medfödda fel diagnos och uppföljning. Rhead (8) bekräftade också metodens verktyg för klinisk diagnos och uppföljning av medfödda fel. Metoden har tillämpats på urinen hos björnar, knock-out möss, elefanter och homogenat av hela bananflugor och deras larver (9). Kultur media från Cryptococcus före och efter site-directed mutagenes analyserades också, utan att ureas steg (10). Metoden har tillämpats på människans näringsmässiga bedömning i läkarstuderande, Downs syndrom patienter och dementa äldre veteraner efter lastning av patienter med orala doser av aminosyrorna tryptofan, metionin och isoleucin (11). Alla åtta B-vitaminer bedömdes genom att kvantifiera nedbrytningsprodukter av de tre aminosyror som bland dem, kräver att alla åtta vitaminer någon gång i sin förnedring. De toxiska effekter av läkemedel och deras begränsning av vitamintillskott har rapporterats (12). Fostervatten prov från det normala och Downs syndrom graviditeter har analyserats och rapporterats (13-15).
Disclosures
Den Metabola Screening Lab är ett CLIA-licensierad kliniska laboratorium som ägs av Saint Louis University, ett icke vinstdrivande företag. Dr Skomakare inte direkt vinst från laboratoriet intäkter, men kan indirekt dra nytta laboratorium produktivitet. Ingen av de metoder, tekniker, resultat, normala värden, makron, programvara, bibliotek eller slutsatser anses egenutvecklade och är fritt tillgängliga för berörda parter.
Acknowledgments
Den kan tekniskt bistånd från Anthony Thomas är tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
