Summary
Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.
Abstract
Ogni bambino nato negli Stati Uniti è ora proiettato fino a 42 malattie rare genetiche chiamate "errori congeniti del metabolismo". Il metodo di screening si basa sulla spettrometria di massa tandem e quantifica acilcarnitine come schermo per acidemias organici e misure anche aminoacidi. Tutti gli stati anche eseguire il test enzimatico per i disturbi di carboidrati come la galattosemia. Perché i risultati possono essere non specifici, test di follow-up dei risultati positivi è necessario utilizzare un metodo più definitiva. La presente relazione descrive il metodo "ureasi" di preparazione dei campioni per lo screening errore congenito. Enzima ureasi cristallino è utilizzato per rimuovere l'urea da fluidi corporei che permette maggior parte degli altri metaboliti solubili in acqua da disidratare e derivatizzati per gascromatografia in un unico procedimento. Disidratazione per evaporazione in corrente di azoto è facilitato con l'aggiunta di acetonitrile e cloruro di metilene. Poi, trimethylsilylation avviene in presenza di un unico catalizzatore, trifluoroacetato triethylammonium. Iniezione automatizzato e cromatografia è seguito da macro-driven quantificazione usanza di 192 metaboliti e semi-quantificazione di ogni componente principale utilizzando librerie specializzate di spettri di massa di TMS derivatizzati composti biologici. L'analisi può essere eseguita sul ampiamente utilizzato piattaforma Chemstation utilizzando le macro e librerie disponibili da parte dell'autore. Nel nostro laboratorio, oltre 16.000 campioni di pazienti sono stati analizzati utilizzando il metodo con una resa diagnostica di circa il 17% - vale a dire il 17% dei campioni risultati rivelano che i risultati dovrebbero essere attuate da parte del medico di ordinazione. Inclusi in queste oltre 180 sono gli errori confermata congeniti, di cui circa il 38% non avrebbe potuto essere diagnosticata con metodi precedenti.
Protocol
Procedura per l'elaborazione campioni di urina
- Scongelare il campione di urina in un bagno d'acqua a 37 ° C. Decantare in un nuovo contenitore se l'originale è compromessa.
- Prendete un aliquota massima di 13 ml di campione e conservarlo a -20 ° C in una provetta per centrifuga coniche.
- Misurare e registrare la densità ottica del campione mettendo un paio di gocce di urina nel rifrattometro.
- Filtrare il campione attraverso un filtro da 0,2 um.
- Misurare il volume del campione al di sotto in base alla densità ottica
1,000-1,009 1,00 ml 1,010-1,019 0,50 ml 1,020-1,050 0,25 ml + 0,25 ml di H 2 O - Il volume specificato non è poi trasferito in un Reactivial contenente le seguenti norme interne: 500 nanomoli (nmoli) 3 Creatina, 10 nmoli d 3 acido metilmalonico, 100 nmoli ciascuno dei seguenti 13 C 3 lattato, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 acido sebacico, 13 C 6 glucosio, d 6 inositolo e d 5 triptofano.
- 20 microlitri (microlitri) di un 7,5 Unità / ul di soluzione di ureasi (Calzyme catalogo Laboratori no. 116A0100) viene aggiunto al campione, che viene poi lavata e sigillato in CO 2 attraverso un setto inerte.
- Il campione è a 37 ° C per 30 minuti con il gas di biossido di carbonio aggiunto a intervalli di 15 minuti per mantenere la pressione.
- 20 l più della soluzione di ureasi si aggiunge, il flacone viene lavata con l'anidride carbonica, e il campione mantenuto a 37 ° C per altri 15 minuti.
- 500 ml di acetone 30:70: metanolo viene aggiunto, il setto di gomma viene sostituito con un setto rivestito in teflon, e il campione viene raffreddato a -20 ° C per 15 minuti.
- Solidi vengono rimossi mediante centrifugazione a 1500 rpm x 10 minuti, poi travasata in un ambiente pulito 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma)
- Aggiungi trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) come segue:
- 20 l per 1,00 ml campioni
- 40 microlitri per 0,5 ml, o meno, i campioni
- Top fuori con acetonitrile e di luogo in un flusso di azoto a 70 ° C fino a volume costante si ottiene (TEA / TFA rimarrà) (~ 15 minuti).
- Ripetere il passaggio 13, fino a 4 volte fino a quando si forma un precipitato (~ 10 minuti ciascuno).
- Lasciate raffreddare per circa 2 minuti. Top fuori con cloruro di metilene, facendo attenzione di ebollizione, e secco (~ 4:00 minuti).
- Ripetere il punto 15.
- Aggiungi MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (termica scientifico) alle seguenti tariffe:
- 150 microlitri per 1,00 ml campioni
- 200 ul per 0,50 ml, o meno, i campioni
- Cap in atmosfera di azoto e incubare a 70 ° C per 1 ora.
- Trasferimento a microprovette, in atmosfera di azoto, per l'analisi dei gas cromatografo / spettrometro di massa.
- Microprovette posto per l'iniezione automatizzato dal 5975 Agilent GC / MS: le temperature dello strumento sono: iniettore 200 ° C, l'interfaccia di 250 ° C, forno a 80 ° C per 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenere per 10 minuti. Colonna: 25 m, 320 micron ID, spessore 0.5 micron DB-5. Mass Spec: fonte 230 ° C, quad 150 ° C, Scansione 50-650 amu a 2,46 scansioni / sec. Solvente pausa di 3,5 minuti.
Rappresentante Risultati
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Discussion
Il metodo di ureasi (1) è stato citato 62 volte nella letteratura medica con varie modifiche. Gruppo di Matsumoto (2,3) ha semplificato la procedura per l'high-throughput screening neonatale e riportato i risultati da 16000 pazienti. Kuhara e altri (4-7) hanno riportato l'utilizzo del metodo in diversi casi di diagnosi degli errori congeniti e follow-up. Rhead (8) ha confermato l'utilità del metodo per la diagnosi clinica e follow-up di errori congeniti. Il metodo è stato applicato a urina di orsi, topi knock-out, elefanti e omogenati di mosche frutti interi e le loro larve (9). Terreni di coltura da Cryptococcus prima e dopo la mutagenesi sito-diretta sono stati analizzati, senza il passaggio ureasi (10). Il metodo è stato applicato per la valutazione dei nutrizionale studenti di medicina, pazienti con sindrome di Down e anziani dementi veterani dopo aver caricato i soggetti con dosi orali degli aminoacidi triptofano, metionina ed isoleucina (11). Tutti gli otto vitamine del gruppo B sono stati valutati da quantificare il prodotti di degradazione dei tre aminoacidi che, tra i quali, che tutte le 8 vitamine ad un certo punto della loro degradazione. Gli effetti tossici dei farmaci e la loro mitigazione da supplementazione di vitamina è stata riportata (12). Campioni di liquido amniotico da gravidanze normali e sindrome di Down sono stati analizzati e riportati (13-15).
Disclosures
Il Laboratorio di Screening metabolica è una CLIA con licenza laboratori clinici di proprietà della Saint Louis University, un'organizzazione non-profit. Dr. Shoemaker non un beneficio diretto dal fatturato di laboratorio, ma può beneficiare indirettamente la produttività del laboratorio. Nessuno dei metodi, tecniche, risultati, gamma normale, macro, il software, le librerie o le conclusioni sono considerati di proprietà e sono liberamente a disposizione degli interessati.
Acknowledgments
L'assistenza tecnica in grado di Anthony Thomas Si ringrazia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
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