C. elegans Dissezione blastomero: un metodo per rimuovere il guscio d'uovo e dissociare le cellule embrionali

Overview

Questo video introduce un metodo per isolare i blastomeri C. elegans dai primi embrioni.  Le cellule risultanti sono adatte per la coltura cellulare o esperimenti ex vivo.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp.

1. Isolamento del blastomero embrionale
2. Indossare guanti e camice da laboratorio per evitare il taglio e il contatto con la soluzione di sbiancamento.
   1. Tenere ogni estremità di un microcapillare (capacità; 10 μL) con la mano destra e sinistra.
   2. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare sopra un bruciatore per fare due capillari tirati a mano(Figura 1A).
   3. Tagliare le punte dei capillari tirati a mano con le forcep sotto il microscopio sezionante e attaccare il capillare tirato in un apparato di pipettaggio della bocca. Preparare due tipi di pipette. Le dimensioni di apertura della punta per le pipette devono essere di circa 2x e 1x la lunghezza dell'asse corto degli embrioni C. elegans (30 μm) per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo, rispettivamente figura 1B-D).
   4. Pipetta 45 μL di soluzione di sale d'uovo su un pozzo di uno scivolo multiwell(Figura 2A;fondo).
   5. Posizionare 5-10 C. elegans adulti su una soluzione di sale d'uovo ben contenente.
   6. Per ottenere embrioni c. elegans precoci, tagliare gli adulti a pezzi posizionando due aghi a destra e a sinistra del corpo C. elegans e facendo scivolare gli aghi l'uno accanto all'altro(figura 2A;schemi superiori).
   7. Pipetta 45 μL di soluzione di ipoclorito su un pozzo vicino alla soluzione di sale d'uovo ben contenente (Figura 2B).
   8. Pipetta 45 μL del mezzo di crescita di Shelton sui tre pozzi successivi accanto alla soluzione di ipoclorito ben contenente (Figura 2B).
   9. Trasferire embrioni a 1 cella e allo stadio iniziale a 2 cellule nella soluzione di ipoclorito mediante pipettazione orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione (Figura 2B).
   10. Aspetta 40-55 s.
   11. Lavare gli embrioni trasferendo gli embrioni dalla soluzione di ipoclorito nel mezzo di crescita di Shelton mediante pipettazione orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione (Figura 2B).
   12. Lavare nuovamente gli embrioni trasferendo gli embrioni in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton mediante pipettazione orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione (Figura 2B).
   13. Trasferire gli embrioni lavati in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton mediante pipettazione della bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione. Utilizzando il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo, ripetere attentamente lapipettazione ( Figura 2C; schemi intermedi). Se il guscio d'uovo viene rimosso con successo, le cellule embrionali diventeranno più sferiche(Figura 2C;a destra).
   14. Separare i blastomeri embrionali a 2 cellule con pipettando delicatamente e continuamente con il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo (Figura 2D).

Figura 1: Isolamento del blastomero. (A) Trazione a mano del capillare di vetro. (B) Capillare in vetro tradito a mano per il trasferimento dell'embrione. (C) Capillare in vetro tirato a mano per la rimozione del guscio d'uovo. (D) Schemi che mostrano la dimensione appropriata dell'apertura capillare per la rimozione del guscio d'uovo. Le frecce indicano gli embrioni. Le barre di scala mostrano 100 μm.

Figura 2: Flusso di lavoro di isolamento blastomere. (A) Dissezione di C. elegans adulti in tampone di sale d'uovo per ottenere embrioni. Le fotografie mostrano embrioni a 2 e 4 cellule prima della rimozione del guscio d'uovo. (B) Trattamento e lavaggio dell'ipoclorito. (C) Gli schemi rappresentano la tempistica appropriata per la rimozione del guscio d'uovo. La fotografia mostra un embrione a 4 cellule dopo la rimozione del guscio d'uovo. (D) Separazione dei blastomeri. La fotografia mostra un embrione separato a 2 cellule. Le dimensioni delle frecce in C e D indicano le forze relative richieste durante la pipettazione. Le barre di scala mostrano 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.