C.エレガンス 芽球体解剖:卵殻を除去し、胚細胞を解離する方法

Overview

このビデオでは、初期胚から C.エレガンス ブラストミアを単離する方法を紹介します。 得られた細胞は、細胞培養または ex vivo 実験に適している。

Protocol

このプロトコルは、   単離されたカエノハブディティスエレガンス胚芽胚芽球と粘着ポリスチレンビーズ、J.Vis.Exp.(2019)を用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成からの抜粋である。

1. 胚芽胞体の単離
2. 漂白液に触れないように手袋とラボコートを着用してください。
   1. マイクロキャピラリーの両端(容量;10 μL)を右手と左手で保持します。
   2. マイクロキャピラリーを両端に引っ張って張力を加え、キャピラリーの中心をバーナーの上に持って来て、2つの手で引っ張られた毛細血管を作ります(図1A)。
   3. 解剖顕微鏡の下で鉗子で手で引っ張られた毛細血管の先端をトリミングし、引っ張られた毛細管を口のピペット装置に取り付けます。2種類のピペットを用意します。ピペットの先端開口部サイズは、それぞれ図1B-Dの胚移植と卵殻除去のためのC.エレガンス胚(30μm)の短軸長約2倍と1倍である必要があります。
   4. ピペット45 μLの卵塩溶液を、マルチウェルスライドのウェル上に(図2A;底)
   5. 卵塩溶液を含む井戸の上に5-10成体C.エレガンスを置きます。
   6. 初期のC.エレガンス胚を得るために、C.エレガンス体の左右に2本の針を配置し、針を互いに滑り合うことによって成人を粉々に切る(図2A;上部回路図)。
   7. ピペット45μLの次亜塩素酸溶液を卵塩溶液を含むウェルの隣のウェルに(図2B)。
   8. シェルトンの成長培地のピペット45 μLは、次亜塩素酸次亜塩素酸溶液を含むウェルの隣にあるその後の3つのウェルに上に置く(図2B)。
   9. 胚移植のために手描き毛細血管で口をピペット化することにより、1細胞段階および初期2細胞段階の胚を次亜塩素酸溶液に移す(図2B)。
   10. 40~55 s を待ちます。
   11. 胚を次亜塩素酸溶液からシェルトンの成長培地に移すことによって胚を洗浄し、胚移植のために手描きの毛細管で口をピペット化する(図2B)。
   12. 胚を再び洗浄するには、胚をシェルトンの成長培地の新しいウェルに移し、胚移植のために手描きの毛細血管で口をピペット化する(図2B)。
   13. 洗浄された胚を、胚移植のために手描きの毛細血管で口をピペット化することによって、シェルトンの成長培地の新しい井戸に移す。卵殻除去のために手描きの毛細管を使用して、ピペッティングを慎重に繰り返します(図2C;中央の回路図)。卵殻が正常に除去されると、胚細胞はより球状になります(図2C;右)。
   14. 卵殻除去のために手描きの毛細管で穏やかに連続的にピペット処理することにより、2細胞段階の胚性ブラストミアを分離する(図2D)。

図1:ブラストミアの分離。(A)ガラス毛管の手引き。(B)胚移植のための手描きガラス毛細管。(C)卵殻除去のための手描きガラス毛細管。(D)卵殻除去のための毛細管開口部の適切なサイズを示す回路図。矢印は胚を示す。スケールバーは100 μmを示します。

図2:ブラストミアの分離ワークフロー(A)胚を得るために卵塩バッファー中の成体C.エレガンスの解剖。写真は、卵殻除去前の2細胞および4細胞段階胚を示す。(B)次亜塩素酸処理及び洗浄。(C)回路図は卵殻除去の適切なタイミングを示す。写真は、卵殻除去後の4細胞期胚を示す。(D) ブラストミア分離。写真は分離された2細胞期胚を示す。CとDの矢印のサイズは、ピペットの間に必要な相対力を示します。スケールバーは50 μmを示します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.