FITC-Dextran האכלה: שיטה לכמת חדירות מעיים C. אלגנים

Overview

וידאו זה מציג שיטה של לדמיין ולמדוד את השלמות של לומן המעי C. elegans על ידי האכלת תולעים FITC שכותרתו dextran.  פרוטוקול הדוגמה מציג את ההסתעפות שנעשתה עם תולעים 3,3'-diindolylmethane (דים) מטופלים ופתוגן.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מ Le et al, מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעיים של אלגנים Caenorhabditis, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנת לוחות NGM לבדיקת ההשפעות של כימיקל (דים) על חדירות המעיים של C. elegans הפד עם P. aeruginosa
   1. מוסיפים 0.5 גרם של פפטון, 0.6 גרם של NaCl, 195 מ"ל של מים מזוקקים, stirrer מגנטי, ו 6.8 גרם של אגר לבקבוק זכוכית 500 מ"ל (NGM אגר).
   2. מוסיפים 0.5 גרם של פפטון, 0.6 גרם של NaCl, 195 מ"ל של מים מזוקקים, ו stirrer מגנטי ללא אגר לבקבוק זכוכית אחר 500 מ"ל (מרק NGM).
   3. מובלעת אוטומטית את שני הבקבוקים (ממדרגות 1.1-1.2), בקבוק זכוכית ריק אחד 100 מ"ל, ובקבוק זכוכית ריק אחד 500 מ"ל במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאפשר את הבקבוקים המכילים בינוני להתקרר ל 55 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך 30 דקות. שמור את מדיום אגר באמבט המים ולהסיר את הבקבוק המכיל מרק (משלב 1.2) לשלב הבא.
   4. הוסף את הכימיקלים תוסף מרק NGM: 0.4 מ"ל של 1 M CaCl₂, 0.4 מ"ל של כולסטרול באתנול (מ"ל), 0.4 מ"ל של 1 M MgSO₄ ו 10 מ"ל של 1 M KPO₄ (כל הרכיבים האלה חייבים להיות מעוקרים מלבד הכולסטרול באתנול). לאחר מכן, מערבבים את התערובת ביסודיות עם stirrer מגנטי ב 55 מעלות צלזיוס.
   5. תווית בקבוק זכוכית ריק autoclaved 500 מ"ל עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואת בקבוק זכוכית ריק autoclaved 100 מ"ל עם דים.
   6. העבר 50 מ"ל של מרק NGM לתוך בקבוק DIM-labeled 100 מ"ל. מוסיפים 500 μL של 20 מ"מ דים לבקבוק ומערבבים היטב.
      שים לב: דים מומס ב-DMSO (20 מ"מ דים).
   7. מוציאים במהירות את מדיום אגר NGM מאמבט המים, מוסיפים 50 מ"ל של מדיום אגר NGM לבקבוק DIM-labeled ומערבבים ביסודיות.
   8. מניחים aliquot 20 מ"ל של מדיום NGM המכיל DIM לתוך כל צלחת פטרי 90 מ"מ x 15 מ"מ. כחמישה לוחות NGM המכילים DIM יכולים להתבצע משלב זה.
      שים לב: הריכוז הסופי של דים בכל צלחת NGM יהיה 100 μM.
   9. כדי להכין את צלחת ה- NGM המכילה DMSO, העבר 150 מ"ל של מרק NGM לבקבוק DMSO שכותרתו 500 מ"ל. מוסיפים 1.5 מ"ל של DMSO לבקבוק ומערבבים היטב.
   10. הוסיפו 150 מ"ל של מדיום אגר NGM לבקבוק עם תווית DMSO וערבבו היטב.
   11. מניחים aliquot 20 מ"ל של מדיום NGM המכיל DMSO בכל צלחת פטרי 90 מ"מ x 15 מ"מ. כחמישה עשר לוחות NGM המכילים DMSO יכולים להתבצע משלב זה.
       שים לב: הריכוז הסופי של DMSO בכל צלחת NGM יהיה 0.5%.
   12. לחזק את הצלחות בטמפרטורת החדר לפחות 3 שעות ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
       שים לב: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   13. הסר את תרבות E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 מהמקרר 4 מעלות צלזיוס ומערבולת את התרבות כראוי לפני התפשטות על לוחות NGM.
   14. שים 800 μL של E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 תרבות חיידקים על כל צלחת אגר NGM טרי ולאפשר את הצלחות להתייבש באינקובטור 20 מעלות צלזיוס לילה.
       שים לב: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לניסוי השלישי (איור 1), הוכנו שתי לוחות NGM המכילים DMSO מצופים ב- E. coli OP50 חי, צלחת NGM אחת המכילה DMSO מצופה ב- PAO1 חיה של P. aeruginosa, ולוחית NGM אחת המכילה DIM מצופה ב- PAO1 חיה של P. aeruginosa.
2. טיפול בחיידקים או דים והאכלת דקסטרן FITC
   1. דגירה ביצים מסונכרן גיל ב 20 מעלות צלזיוס עבור 64 שעות על צלחות NGM בתוספת חי E. coli OP50 כמזון.
   2. שטפו את זחלי L4 המסונכרנים לגיל עם S-buffer והעבירו אותם (יותר מ-500 תולעים) לצלחות הטיפול ב-NGM המכילות חיידקים וכימיקלים שונים. דגירה אותם ב 20 מעלות צלזיוס עבור 48 שעות.
      שים לב: זמן הטיפול יכול לנוע בין 24 ל 72 שעות, על פי חיידקים וכימיקלים המשמשים. ההשפעה הטיפולית או המניעתית של דים יכולה גם להיות מוערכת על ידי טיפול מראש בתולעים עם פתוגנים ולאחר מכן טיפול בתולעים עם דים (האפקט הטיפולי) או על ידי טיפול מראש בתולעים עם דים ולאחר מכן טיפול עם פתוגנים (האפקט המונע).
   3. כדי להכין את הלוחות בתוספת FITC-dextran, יש לערבב 2 מ"ל של E. coli OP50 עם 4 מ"ג של FITC-dextran. לאחר מכן, לחלק 100 μL של FITC-dextran ו E. coli OP50 תערובת לתוך עשרים טריים NGM אגר צלחות (60 מ"מ x 15 מ"מ) ולאפשר את הצלחות להתייבש במשך 1 שעה על ספסל נקי.
      שים לב: הריכוז הסופי של FITC-dextran בכל צלחת NGM יהיה 20 מיקרוגרם / מ"ל.
   4. הכינו חמש לוחות NGM המכילים E. coli OP50 ללא FITC-dextran לטיפול בבקרת הרכב. לשם כך, לחלק 100 μL חום מושבת E. coli OP50 לכל צלחות NGM אגר טרי (60 מ"מ x 15 מ"מ) ולאפשר את הצלחות להתייבש במשך 1 שעה על ספסל נקי.
      שים לב: עבור כל ניסוי עצמאי, נדרשים 15 לוחות NGM בתוספת FITC-dextran וחמישה לוחות NGM ללא FITC-dextran.
   5. לאחר 48 שעות של טיפול (משלב 2.2), לשטוף את התולעים עם S-buffer, להעביר את התולעים ללוחות תוספת FITC-dextran ואת לוחות NGM ללא FITC-dextran, ולהדגיר את הצלחות לילה (14-15 שעות).
      שים לב: עבור כל קבוצת טיפול, נדרשים 5 שכפולים של כתמי FITC-dextran (או האכלה לבקרת רכב).
   6. לשטוף את התולעים עם S-buffer ולאפשר להם לזחול בצלחת NGM אגר טרי במשך 1 שעות.
      שים לב: עבור כל ניסוי עצמאי, יש צורך בסך הכל ב-20 לוחות NGM טריים. בשלב זה, באפשרותך להשתמש בלוח NGM בתוספת ללא או עם E. coli OP50.
   7. הוסף 50 μL של 4% פתרון פורמלדהיד לכל באר של צלחת שחורה 96-היטב שטוח התחתון. מעבירים כ-50 תולעים מכל צלחת NGM לכל באר למדידות פלואורסצנטיות. לאחר 1 עד 2 דקות, להסיר ביסודיות את כל פורמלדהיד מכל באר ולהוסיף 100 μL של מדיום הרכבה כדי לצפות את בארות.
      שים לב: פתרון פורמלדהיד (4%) משמש כדי לשתק ולתקן את התולעים. עבור כל קבוצת טיפול, 5 בארות (5 שכפולים) משמשות לניתוח תמונה.
3. הדמיה C. elegans עם מערכת הדמיה Operetta וקביעת חדירות המעי על ידי מדידת ספיגת פלואורסצנטיות FITC-dextran
   שים לב: סטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולה לשמש לניתוח תמונה במקום למערכת אופרטה.
   1. לכוד תמונות פלואורסצנטיות ומדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות מערכת ההדמיה הגבוהה של Operetta ונתח את התמונות באמצעות תוכנת הרמוניה.
   2. בתוכנת הרמוניה, לחץ על הסמל פתח את המכסה כדי לפתוח את המכסה ולהכניס את הצלחת למכונה.
   3. הגדר את הפרמטרים.
   4. לחץ על הגדרה, בחר את סוג הלוח (96 באר corning שטוח למטה) והוסף את הערוצים (שדה בהיר וערוצי EGFP).
   5. התאם את הפריסה. עבור אל הבחירה פריסהולאחר מכן בחר עקוב והתאם את הפרמטרים (תמונה ראשונה ב- μm אחד, מספר המישורים הוא 10, המרחק הוא 1 מיקרומטר).
   6. בחר אחת מבארות הטיפול ושדה לכידה אחד ולחץ על Test כדי לבדוק אם התמונות משביעות רצון במקטע הפעל ניסוי.
   7. אם התמונות משביעות רצון, חזור למקטע הגדרה והקש על סמל איפוס בסוף המסך. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה.
   8. עבור שוב להפעלת הניסוי והזן את שם הלוח ולאחר מכן הקש Start כדי להתחיל בעיבוד.
   9. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, עבור למקטע ניתוח התמונה והזן את התמונה. מצא את התא על-ידי בחירה בערוץ ובשיטה B. התאם את הסף המשותף ל- 0.5, אזור ל- >200 מיקרומטר², פקטור מפוצל ל- 3.0, סף בודד ל- 0.18 ובניגוד ליותר מ- 0.18. לאחר מכן, חשב את מאפייני העוצמה ובחר את הממוצע כפלט. הקש על סמל החל כדי לשמור את הכיוונון.
   10. עבור אל המקטע הערכה כדי למדוד את העוצמה על-ידי קבלת מפת חום וטבלת נתונים. הגדר את הפרמטר Readout לתאים — ממוצע EGFP של תא אינטנסיבי — ממוצע לבאר והתחל את ההערכה.
       שים לב: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   11. כדי לחלץ את הנתונים מאופרטה, לחץ על לחצן הגדרה ובחר ניהול נתונים.
   12. בחר כתוב ארכיוןולאחר מכן פתח את העיון ובחר את הקובץ.
   13. לבחירת הקובץ, לחצו על האות + הקטן בפינה הימנית ולחצו על 'מדידה' ובחרו 'שם לוח'.
   14. בחרו בקובץ ולחצו על הלחצן 'אשר'.
   15. בחר את הנתיב לשמירת הקובץ על-ידי לחיצה על אות עיון בנתיב הפעיל.
   16. לחץ על התחל כדי לשמור את קובץ הנתונים.
       שים לב: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
4. ניתוח סטטיסטי של פלואורסצנטיות FITC-dextran של C. אלגנס
   1. יבא את הנתונים וחשב את הממוצע ואת סטיית התקן (SD) באמצעות תוכנת סטטיסטיקה.
   2. נתח את ההבדל המשמעותי עם ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואה המרובות של Tukey.

Representative Results

איור 1: ההשפעה של דים על חדירות המעיים של C. elegans האכיל P. aeruginosa. מיקרוסקופיה תמונות של תולעים מ (A. coli OP50 ללא האכלה FITC-dextran, (B) E. coli עם האכלה FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 עם האכלה FITC-dextran, ו (ד) P. aeruginosa ו- DIM (100 מיקרומטר) cotreatment עם האכלה FITC-dextran. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ (לבן) ו- 200 מיקרומטר (שחור). זחלי L4 מסונכרנים לגיל היו דגירה במשך 48 שעות בצלחות NGM זרעים עם חי E. coli (A, B),לחיות P. aeruginosa (C),לחיות P. aeruginosa ו דים(D). לאחר מכן, התולעים הועברו ללוחות המכילים FITC-dextran (B-D), למעט בקרת הרכב (A). (ה)עוצמת הפלואורסצנטיות של FITC מציינת כי חדירות המעיים של C. elegans הושפעה מ- DIM. עמודות ופסי שגיאה מציינים את הממוצע ± SD. ***P < 0.001 להבדל משמעותי מבקרת הרכב. ^###P < 0.001 ^{ו# #}P < 0.01 להבדל משמעותי מהתולעים שטופלו ב- FITC-dextran המוזנות עם P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). גרף זה מייצג שני ניסויים עצמאיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N