FITC-デキストラン摂食:C.エレガンスにおける腸透過性を定量化する方法

Overview

このビデオでは、FITC標識デキストランをワームに供給することによって 、C.エレガンス 腸管腔の完全性を視覚化し、測定する方法を紹介します。 このプロトコルの例は、3,3'-ジインドリルメタン(DIM)処理および病原体供給ワームで行われたアッセイを示しています。

Protocol

このプロトコルは、Caenorhabditis elegansの腸透過性に対する細菌および化学物質の影響を測定するLe et alからの抜粋です。(2019).

1. 化学物質(DIM)がP.エルギノーサを有するC.エレガンスの腸透過性に及ぼす影響を試験するためのNGMプレートの調製
   1. ペプトン0.5g、NaCl0.6g、蒸留水195mL、磁気スターラー、寒天6.8gを500mLガラス瓶(NGM寒天)に加えます。
   2. ペプトン0.5g、NaCl0.6g、蒸留水195mL、寒天のない磁気攪拌機を別の500 mLガラス瓶(NGMブロス)に加えます。
   3. 2本のボトル(ステップ1.1~1.2)、1本の空の100mLガラスボトル、121°Cで15分間の空の500 mLガラスボトルをオートクレーブ。 その後、ボトルを含む培地を水浴中で55°Cに30分間冷却させる。水浴中に寒天培地を保管し、次のステップのために(ステップ1.2から)スープを含むボトルを取り除きます。
   4. NGMスープに添加剤を添加剤を添加する:0.4mLの1 M CaCl2、0.4mLのコレステロールエタノール中のコレステロール(mL)、1 M MgSO 4の0.4 mL、1 M KPO₄の10 mL(これらの成分はすべてエタノール中のコレステロールとは別に殺菌されなければならない)。その後、55°Cの磁気攪拌機で十分に撹拌します。
   5. オートクレーブ空の500 mLガラス瓶にジメチルスルホキシド(DMSO)とオートクレーブ空の100 mLガラス瓶にDIMラベルを付けます。
   6. 50 mLのNGMスープを薄暗いラベルの100 mLボトルに移します。ボトルに20 mMの薄暗いストックの500 μLを加え、よく混ぜます。
      注:DIM は DMSO (20 mM DIM ストック) に溶解します。
   7. 水浴からNGM寒天培地を素早く取り出し、NGM寒天培地50mLを薄暗いラベルのボトルに加え、十分に混ぜます。
   8. 薄暗いNGM培地の20 mLアリコートを各90mm x 15 mmペトリ皿に入れます。このステップから約5枚の薄暗いNGMプレートを作ることができます。
      注:各NGMプレートのDIMの最終濃度は100 μMになります。
   9. DMSO含有NGMプレートを調製するには、150 mLのNGMブロスをDMSO標識500 mLボトルに移します。ボトルに1.5mLのDMSOを加え、よく混ぜます。
   10. DMSO標識ボトルにNGM寒天培地150mLを加え、十分に混ぜます。
   11. DMSO含有NGM培地の20mLアリコートを各90mm x 15mmペトリ皿に入れます。約15個のDMSO含有NGMプレートをこのステップから作ることができます。
       注:各NGMプレートにおけるDMSOの最終濃度は0.5%になります。
   12. プレートを室温で3時間以上固め、使用するまで4°Cで保管します。
       注:プロトコルはここで一時停止することができます。
   13. 4°C冷蔵庫から大腸菌OP50またはP.エルギノーサPAO1培養液を取り出し、培養物を適切にボルテックスしてからNGMプレートに広げます。
   14. 大腸菌OP50またはP.緑素吸砂PAO1細菌培養物を新鮮なNGM寒天プレートに800μL入れ、プレートを20°Cインキュベーターで一晩乾燥させます。
       注:プロトコルはここで一時停止することができます。第3実験(図1)では、生きた大腸菌OP50で被覆された2枚のDMSO含有NGMプレート、生生P.緑頭吸砂PAO1で被覆されたDMSO含有NGMプレート1枚、及び生きたP.緑素吸砂PAO1で被覆された薄暗いNGMプレート1枚を調製した。
2. 細菌や薄暗い、FITC-デキストランの供給の治療
   1. 生きた大腸菌OP50を食品として補ったNGMプレート上で20°Cで20°Cで年齢同期卵をインキュベートします。
   2. 年齢同期化されたL4幼虫をSバッファで洗い、異なる細菌や化学物質を含む治療NGMプレートに(約500以上のワーム)を移します。20°Cで48時間インキュベートする。
      注:使用される細菌および化学薬品によると、処理時間は24から72の時間の範囲であり得る。DIMの治療効果または予防効果は、ワームを病原体で前処理し、次にDIM(治療効果)でワームを治療するか、またはワームをDIMで前処理し、病原体で治療することによって評価することもできる(予防効果)。
   3. FITCデキストラン補充プレートを調製するには、2 mLの熱不活性化大腸菌OP50と4mgのFITCデキストランを混ぜます。その後、FITCデキストランと大腸菌OP50混合物の100 μLを20個の新鮮なNGM寒天プレート(60mm x 15 mm)に分け、クリーンベンチで1時間乾燥させます。
      注:各NGMプレートのFITCデキストランの最終濃度は20 μg/mLになります。
   4. 車の制御処理のためのFITC-デキストランなしで5つの大腸菌OP50含有NGMプレートを準備しなさい。この目的のために、100 μLの熱不活性化大腸菌OP50を各新鮮なNGM寒天プレート(60mm x 15 mm)に分け、きれいなベンチで1時間乾燥させます。
      注:独立した実験ごとに、FITCデキストランを補充したNGMプレート15枚と、FITCデキストランを使用しない5枚のNGMプレートが必要です。
   5. 48時間の処理(ステップ2.2から)の後、Sバッファでワームを洗い、FITC-デキストラン補充プレートとNGMプレートにFITC-dextranを補充し、プレートを一晩(14-15時間)インキュベートします。
      注:各治療群に対して、FITC-デキストラン染色(または車両制御給餌)の5つの複製が必要です。
   6. S-バッファでワームを洗浄し、新鮮なNGM寒天プレートで1時間クロールできるようにします。
      注:独立した実験ごとに、合計20個の新鮮なNGMプレートが必要です。このステップでは、大腸菌OP50を使用せずに、または補充されたNGMプレートを使用することができます。
   7. 黒い96ウェルの平底プレートの各ウェルに4%ホルムアルデヒド溶液の50 μLを加えます。各NGMプレートから約50個のワームを各ウェルに移し、蛍光測定を行います。1~2分後、各ウェルからホルムアルデヒドをすべて完全に取り出し、100 μLの取り付け媒体を加えてウェルをコーティングします。
      注:ホルムアルデヒド溶液 (4%)は、ワームを固定化し、修正するために使用されます。各治療群について、5つのウェル(5つの反復)が画像分析に使用されます。
3. FITC-デキストラン蛍光摂取測定によるオペレッタイメージングシステムと腸透過性の測定によるC.エレガンスのイメージング
   注:蛍光ステレオ顕微鏡は、Operettaシステムの代わりに画像解析に使用できます。
   1. 蛍光画像をキャプチャし、Operetta高コンテンツイメージングシステムを使用して蛍光強度を測定し、Harmonyソフトウェアで画像を解析します。
   2. Harmonyソフトウェアで、アイコンの開いた蓋を押して蓋を開け、プレートを機械に入れます。
   3. パラメータを設定します。
   4. [セットアップ] をクリックし、プレートタイプ(96ウェルコーンフラットボトム)を選択し、チャンネル(明視野チャンネルとEGFPチャンネル)を追加します。
   5. レイアウトを調整します。レイアウトの選択に移動し、[トラック] を選択して、パラメータを調整します (最初の画像は 1 μm、平面の数は 10、距離は 1 μm)。
   6. 処理井戸の 1 つとキャプチャ フィールドを 1 つ選択し、[テスト] を押して、[実験の実行] セクションで画像が満足できるかどうかを確認します。
   7. 画像が十分に満足できる場合は、[設定] セクションに戻り、画面の最後にある[リセット] アイコンを押します。次に、ターゲットウェルと適切な数のキャプチャフィールドを選択します。
   8. 実験を実行するにもう一度移動し、プレート名を入力してから、開始を押して処理を開始します。
   9. 蛍光の強度を測定するには、画像解析セクションに移動し、画像を入力します。EGFP チャネルと方法 B を選択してセルを見つける. 共通のしきい値を 0.5 に調整し、面積を >200 μm²に調整し、分割係数を 3.0 に、個別のしきい値を 0.18 に調整し、0.18 以上と対比します。次に、強度プロパティを計算し、出力として平均を選択します。[適用]アイコンを押して、セットアップを保存します。
   10. [評価] セクションに移動して、ヒートマップとデータ テーブルを取得して強度を測定します。読み出しパラメータをセル - 強度セル EGFP 平均 — ウェルあたりの平均値に設定し、評価を開始します。
       注:プロトコルはここで一時停止することができます。
   11. Operetta からデータを抽出するには、[設定]ボタンをクリックして [データ管理] を選択します。
   12. [アーカイブの作成] を選択し、参照を開いてファイルを選択します。
   13. ファイルを選択するには、左隅にある小さな+信号をクリックし、[測定] をクリックして [プレート名] を選択します。
   14. ファイルを選択し、[OK]をクリックします。
   15. アクティブなパスで参照シグナルをクリックして、ファイルを保存するパスを選択します。
   16. [開始] をクリックしてデータ ファイルを保存します。
       注:プロトコルはここで一時停止することができます。
4. C.エレガンスのFITC-デキストラン蛍光の統計分析
   1. 統計ソフトウェアを使用してデータをインポートし、平均と標準偏差(SD)を計算します。
   2. 一方向分散分析(ANOVA)とTukeyの多重比較検定を使用して有意差を分析します。

Representative Results

図1: C.エレガンス供給P.エルギノーザの腸透過性に対するDIMの影響.FITCデキストラン給餌なしの(A)大腸菌OP50(B)大腸菌による顕微鏡画像、(C)FITC-デキストラン給餌付きP.緑内症PAO1、および(D)P.緑分化とDIM(100 μM)の治療によるFITC-dextranによる治療スケールバー= 1 mm (白)、200 μm (黒)。年齢同期化されたL4幼虫は、生きた大腸菌(A、B)、生きたP.緑素吸い(C)、生きたP.緑頭症およびDIM(D)を播種したNGMプレートで48時間インキュベートした。次いで、車両制御(A)を除いて、FITC-dextran(B-D)を含むプレートにワームを移送した。()FITC蛍光強度は、C.エレガンスの腸透過性がDIMによって影響を受けたことを示す ±。^###P < 0.001 および^##P < 0.01 P. 緑素吸除PAO1 (ANOVA, n = 5) を与えられたFITCデキストラン処理ワームとの有意な差について。このグラフは、2つの独立した実験を代表するものである。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N