Overview
Questo video descrive il saggio di risposta touch-evoke, che misura la risposta della larva di zebrafish per toccare gli stimoli.
Protocol
1. Test di risposta evocato dal tocco
- Preparazione di 2 embrioni dpf per test di risposta evocati dal tocco
- Assicurarsi che l'ora del giorno in cui viene condotto il test sia coerente tra gli esperimenti perché l'attività può variare notevolmente durante il giorno.
NOTA: L'esperimento deve essere eseguito accecato e l'ordine di prova casuale per ridurre al minimo gli artefatti sperimentali. - Assegnare ai ceppi di pesce un numero, che è sconosciuto all'individuo che effettua l'esperimento. In seguito, l'utilizzo di strumenti online liberamente disponibili genera un elenco casuale che detta l'ordine dei test.
- Almeno un'ora prima del test, dechorionate embrioni strappando un buco nel corone e allontanando delicatamente il corone usando un paio di pinzette fini. Rimuovere eventuali detriti dalla piastra di Petri prima di tornare all'incubatore a 28 °C.
- Assicurarsi che l'ora del giorno in cui viene condotto il test sia coerente tra gli esperimenti perché l'attività può variare notevolmente durante il giorno.
- Esecuzione di test di risposta evocati dal tocco
- Stadio di calore a 28 °C almeno 15 minuti prima di iniziare il test.
NOTA: Questa fase è a temperatura controllata e rimarrà a 28 °C per tutta la durata della prova. La temperatura influenzerà l'attività ed è quindi importante mantenere una temperatura costante. Se non è disponibile uno stadio riscaldato, la temperatura dell'acqua deve essere monitorata e tutti gli esperimenti devono essere condotti alla stessa temperatura. - Posizionare una piastra di petri riempita con mezzo embrionale (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 in acqua) su uno stadio illuminato e montare la telecamera ad alta velocità sopra la piastra di Petri.
- Avviare il software di registrazione della videocamera (come Stream Pix 5, descritto qui) e nella scheda "workspace" selezionare 1.000 fotogrammi al secondo (1.000 fps) come velocità di acquisizione per garantire che l'azione di nuoto veloce del pesce sia registrata.
- Lavorando con un embrione alla volta, posizionare l'embrione al centro della piastra di Petri con il pesce zebra chiaramente visibile nel campo visivo.
NOTA: Se l'embrione nuota via prima dell'inizio dell'esperimento, sostituirlo con un altro, poiché la riconquista e il posizionamento dell'embrione possono comportare che diventi desensibilizzato allo stimolo e risposte ripetute a raffica possono promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia. - Inizia a registrare cliccando sul pulsante "registra" e, consegna lo stimolo meccanosensorie all'embrione toccandolo delicatamente con un ago smussato sulla parte superiore della testa.
- Interrompere la registrazione dopo che l'embrione è uscito dal campo visivo o è tornato a riposare.
NOTA: I picchi di accelerazione entro i primi 0,2 secondi della risposta di fuga di scoppio a seguito dello stimolo meccanico. Pertanto, assicurarsi che almeno durante i primi 0,2 secondi della risposta di fuga che registra il pesce sia nel campo visivo. Utilizzando il software Stream Pix 5, i dati verranno salvati automaticamente come file .avi file video. Potrebbero essere utilizzati anche software alternativi di acquisizione video come Free Video Capture o Softonic, entrambi liberamente disponibili per il download. - Riportare l'embrione in una nuova piastra di Petri e selezionare un altro embrione per il test. Eseguire test su un minimo di 15 pesci.
- Stadio di calore a 28 °C almeno 15 minuti prima di iniziare il test.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products | PT S90001 | |
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2 |