Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med å tilsette E3 middels til lavt smeltepunkt agarose og oppvarming til agarose helt oppløses. Avkjøl agarose til 37 grader Celsius og tilsett trikainoppløsning. Deretter bedøver du embryoene ved å tilsette trikain til en Petri-tallerken som inneholder embryoer i E3-medium. Virvle Petri-parabolen for å samle embryoene i midten.
Bruk en overføringspipette, trekk opp ett embryo med minimal mengde medium. Hold pipetten i oppreist stilling og sprett embryoet for å plassere det på spissen av pipetten. Plasser nå embryoet i agaroseløsningen uten å legge til overflødig medium, noe som vil fortynne agarose og forhindre gelling. Bland forsiktig embryoet i agarose og overfør løsningen til brønnen til en bildeplate ved hjelp av pipetten.
Plasser platen under et mikroskop og bruk en pipettespiss til å plassere embryoet i ønsket retning. Når agarose størkner, hell E3 medium som inneholder trikain på toppen av det for å holde agaren hydrert og bilde embryoet. I en eksempelprotokoll vil vi montere parabiotiske sebrafiskembryoer for avbildning og analyse.
For å skaffe bilder av de smeltede embryoene, lag 0,8% lavt smeltepunkt agarose. Mens det fortsatt er varmt, aliquot en milliliter av agarose i 1,5 milliliter mikrofuge rør satt i en 37 grader Celsius oppvarming blokk. Bedøvelse parabiotiske embryoer ved å legge til 1 milliliter av 4 milligram per milliliter pH 7.0 tricaine til 25 milliliter av E3 medium som inneholder embryoer. Forsiktig virvle parabolen slik at embryoene basseng i midten.
Deretter bruker du en bred tippet plastoverføringspipette, trekk deretter embryoene opp i så lite væske som mulig. Snu pipetten oppreist og sprett forsiktig embryoene slik at de legger seg helt nederst på pipetten. Deretter overfører du embryoene til en 1 milliliter aliquot av lavt smeltepunkt som oppstår ved å berøre pipettespissen lett på overflaten av agarose.
Deretter, med pipetten, overfør agarose og embryoer til brønnen av en glassbunn seks-brønns plate. Under et stereomikroskop, bruk en gellastespiss festet til enden av en ertende nål for å plassere embryoene nær dekkglasset og i ønsket retning for avbildning. Etter at agarose har satt og medium med trikain er lagt til brønnene, bruk et invertert bredfelt epifluorescence laserskanning konfokal eller spinnende disk konfokalt mikroskop for å skaffe bilder.
For et helt embryo synsfelt, bruk et 4x subjektivt. Bruk et 20x-mål for å avbilde et bestemt vev. Behandle bildene i henhold til tekstprotokollen.
