胚微小注射:ゼブラフィッシュ黄身に化合物を送達する技術

Overview

このビデオでは、ゼブラフィッシュ黄身嚢に化合物を送達する胚微小注射の技術について説明します。

Protocol

1. ゼブラフィッシュ胚へのCRISPR成分のマイクロインジェクション

1. 必要な雄と雌(通常は2つのメスと1または2の雄)の数を所定の位置に仕切りタンクに入れることによって、注入する前の夜に繁殖タンクを設置します。
2. 溶けたアガロース35mLを10cmのペトリ皿に注ぎ、プラスチックモールドをそっとして溶液にくさび状のトラフを作り、気泡を除去するためにモールドをタップして、1x E3培地 (材料表を参照)に 1.5%アガロースを含むマイクロインジェクションプレートを準備します。
3. アガロースをセットし、少量の培地で皿を保存し、4°Cでプレートが乾燥するのを防ぐためにパラフィンフィルムで包みます。
   注: 注入プレートは、ウェルが変形または乾燥するか、またはプレートがカビを成長し始めるまで、数週間再利用可能です。
4. 注射の朝、氷の上に精製されたsgRNAとCas9タンパク質を解凍します。RNase汚染を防止し、RNaseフリーのチップとチューブを使用するために手袋ですべての材料を扱うことを忘れないでください。
5. Cas9タンパク質とsgRNAをCas9:sgRNAの2:1比で組み合わせて5μLの注入溶液を生成し、400 pg/nL Cas9タンパク質および200 pg/nL sgRNAの最終濃度を得ます。Cas9/sgRNA溶液を室温で5分間インキュベートし、Cas9およびsgRNAがリボヌクレオタンパク質複合体を形成できるようにします。0.5 μLの 2.5% wt/vol フェノールレッド溶液 (材料表を参照)を加え、RNase フリーウォーターを最終容積の 5 μL に加えます。
   注: 溶液のイオン強度はCas9/sgRNA複合体の溶解度に影響を与えるため、KClを添加すると、低インデル形成を示すsgRNAの切断効率を高めることが示されている。
6. マイクロピペットプーラーを使用して1.0mmガラスキャピラリーを引っ張って注射針を作ります。新しいカミソリの刃または鉗子を使用して作りたての針の先端を切り取り、コリリオンと黄身嚢を容易に突き刺す斜めの開口部を得ます。
7. マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を入れ、空気源をオンにします。特定の装置に対して決定された較正に適した倍率を用いた光学顕微鏡の下で、針が一貫してミネラルオイルを充填したペトリ皿に1 nL溶液を排出するまで射出圧力を調整する。
   注: 針の質は非常に重要です。さらなる実験を試みる前に、針を製造し、胚の黄身嚢に注入する練習を行います。
8. 仕切りを取り出し、魚が約15分間繁殖できるようにします。
   注: より長い繁殖時間はより多くの胚を産生するが、Cas9切断が早期に起こる可能性を最大限に高め、したがって遺伝的モザイク化を減少させるために胚が1細胞段階にある間に注射を完了すべきである。胚は後の段階(2〜4細胞段階)に注入することができるが、これはおそらく改変アリールの生殖細胞伝達率を低下させるかもしれない。
9. ストレーナーを使用して卵を収集し、0.0001%メチレンブルーで1x E3メディアを使用して10センチメートルペトリ皿にそれらを洗いす。受精していない卵や残骸を取り除き、光顕微鏡で卵の健康状態を調べます。
10. 10~15個の胚を、別のラベル付きペトリ皿に未注入のコントロールとして置きます。
11. トランスファーピペットを使用して、注入プレートの卵を室温にそっと並べます。
12. 2.5倍の解剖顕微鏡の下で、各胚の黄身嚢に1nLの溶液を注入し、Cas9タンパク質の合計400 pgと200 pgのsgRNAを注入する。
    注: 必要に応じて切断を増加させるために、Cas9タンパク質の最終的な濃度を800 pg / nLに、sgRNAの濃度を注射液中の400 pg/nLに増やします。しかし、これはまた、オフターゲット切断を増加させ、および/または胚の健康を減少させる可能性があります。切断効率はまた、細胞に直接注入することによって増加してもよい。しかし、黄身袋への注入は技術的に要求が少なく、生殖系列の伝達が高い魚を生産するのに十分な切断を与える(>修飾されたアレルを含む子孫の70%)。
13. 注入した胚を適切にラベル付けされたペトリ皿に戻し、メチレンブルーで1x E3培地で覆い、28°Cに設定された胚インキュベーターに入れます。
14. 受精後24時間(hpf)で、注入された胚の健康状態を検査し、死亡または異常に発達している個体を取り除き、メディアを変更する( 図1参照)。未注入コントロールに対する生存率を確認します。
    注: 非必須遺伝子を標的とする場合、未注入対照に対して10%未満の致死性が予想される。未注入対照と比較してガイド注入集団で致死性の上昇レベルが観察された場合、標的遺伝子が発達に不可欠であるか、またはオフターゲット効果が開発の失敗につながることを示している可能性がある。注入されたCRISPR試薬の量を減らすことが必要であり、または減少したオフターゲット効果を伴う新しいsgRNAの生成が必要な場合があります。
15. 胚をインキュベーターに戻し、胚を72hpfに成長させ続け、毎日メディアを変えて胚の健康を維持する。

Representative Results

図1:24hpf注入胚の健康状態の比較。 生きている胚(A)は24hpfに発達し、発達を中止した胚(B)と容易に区別される。(B)に似ているか、(A)に大幅に特徴を変えた胚、脊髄湾曲や頭部および眼の発達の変化など、皿から取り除く必要があります

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-free water	Any brand		Synthesis of guide RNAs. Thermo  Fisher and Qiagen both carry  suitable water.
E3 embryo media	Made in house		Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140	Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish	Thermo Fisher	FB0875711Z	Store embryos, cast injection plate
Agarose	Denville	CA3510-8	Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	To create wells to hold embryos during injection
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290	Dye for visualization of injection
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes	Any brand		Moving embryos
Razor blade	Thermo Fisher	11295-10	Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator			Maintaining embryos at 28.5 C.
Verticle pipette puller	David Kopf Instruments	700C	Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10	Geneate needles for injection.
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Load solution into injection needles
Microinjector	World Precision Instruments	PV 820	Injecting embryos.
Disecting microscope	Leica		Injecting embryos.
Microwave	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Scale	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Gloves	Any brand		For all aspects of the protocol.
N2	Any brand		To expell liquid from the capillary for embryo injection
PCR strip tubes	Any brand		For all aspects of the protocol.
200 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
10 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
Micropipettes	Any brand		For all aspects of the protocol.