Microiniezione embrionale: una tecnica per consegnare un composto nel tuorlo zebrafish

Overview

Questo video descrive una tecnica di microiniezione embryo per fornire composti nel sacco tuorlo Zebrafish.

Protocol

1. Microiniezione di componenti CRISPR in embrioni zebrafish

1. Impostare i serbatoi di riproduzione la notte prima dell'iniezione posizionando il numero di maschi e femmine desiderati (in genere 2 femmine e 1 o 2 maschi) in un serbatoio di riproduzione con un divisore in posizione.
2. Preparare una piastra di microiniezione con 1,5% di agarosio in 1x mezzi E3 (vedi Tabella dei materiali) con blu di metilene allo 0,01% (un fungicida) versando 35 mL dell'agarosio fuso in una piastra di Petri di 10 cm e posare delicatamente uno stampo di plastica per creare trogoli a forma di cuneo nella soluzione, toccando lo stampo per eliminare le bolle d'aria.
3. Lasciare impostare l'agarosio e conservare il piatto con una piccola quantità di supporto e avvolto in pellicola di paraffina per evitare che il piatto si asciughi a 4 °C.
   NOTA: Le piastre di iniezione sono riutilizzabili per diverse settimane, fino a quando i pozzi si deformano o si asciugano o la piastra inizia a coltivare muffa.
4. La mattina dell'iniezione, scongelare lo sgRNA purificato e la proteina Cas9 sul ghiaccio. Ricordarsi di maneggiare tutti i materiali con guanti per prevenire la contaminazione da RNasi e di utilizzare punte e tubi senza RNasi.
5. Generare una soluzione di iniezione da 5 μL combinando la proteina Cas9 e lo sgRNA in un rapporto 2:1 di Cas9:sgRNA per ottenere concentrazioni finali di 400 pg/nL proteina Cas9 e 200 pg/nL sgRNA. Incubare la soluzione Cas9/sgRNA a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire al Cas9 e allo sgRNA di formare un complesso di ribonucleoproteina. Aggiungere 0,5 μL di soluzione rosso fenolo 2,5% wt/vol (vedi Tabella dei materiali)e acqua priva di RNasi ad un volume finale di 5 μL.
   NOTA: La forza ionica della soluzione ha dimostrato di influenzare la solubilità del complesso Cas9/sgRNA, quindi l'aggiunta di KCl può aumentare l'efficienza di taglio degli sgRNA che mostrano una bassa formazione di indelebili.
6. Fare un ago di iniezione tirando un capillare di vetro da 1,0 mm utilizzando un estrattore di micropipette. Tagliare la punta dell'ago appena fatto utilizzando una nuova lama di rasoio o pinziere per ottenere un'apertura angolata che perforerà facilmente il coro e il sacco del tuorlo.
7. Posizionare l'ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore con la sorgente d'aria accesa. Al microscopio leggero utilizzando l'ingrandimento adatto alla taratura determinata per il particolare apparecchio, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle costantemente una soluzione da 1 nL in una piastra di Petri piena di olio minerale.
   NOTA: La qualità dell'ago è fondamentale. Esercitati a produrre un ago e iniettare nel sacco del tuorlo degli embrioni fino a quando questa è abilità viene padroneggiata prima di tentare ulteriori esperimenti.
8. Rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riprodutti per circa 15 minuti.
   NOTA: Tempi di riproduzione più lunghi produrranno più embrioni, tuttavia l'iniezione dovrebbe essere completata mentre gli embrioni sono allo stadio di 1 cella per massimizzare la possibilità che il taglio cas9 avvenga presto e quindi ridurre il mosaicismo genetico. Gli embrioni possono essere iniettati in fasi successive (2-4 stadi cellulari), ma questo potrebbe ridurre la velocità di trasmissione della linea germinale dell'allele modificato.
9. Raccogliere le uova con un colino e sciacquarle in una piastra di Petri di 10 cm utilizzando 1 supporto E3 con blu di metilene allo 0,0001%. Esaminare la salute delle uova al microscopio leggero, rimuovendo eventuali uova e detriti non fecondati.
10. Mettere da parte 10-15 embrioni come controllo non iniettato in una piastra di Petri separata e etichettata.
11. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare delicatamente le uova sulla piastra di iniezione riscaldata a temperatura ambiente.
12. Al microscopio a dissezione con ingrandimento 2,5X, iniettare 1 nL della soluzione nel sacco vitellino di ogni embrione per iniettare un totale di 400 pg di proteina Cas9 e 200 pg di sgRNA.
    NOTA: Per aumentare il taglio se lo si desidera o necessario, aumentare la concentrazione finale della proteina Cas9 a 800 pg/nL e di sgRNA a 400 pg/nL nella soluzione di iniezione; tuttavia, ciò può anche aumentare il taglio fuori bersaglio e/o ridurre la salute degli embrioni. L'efficienza di taglio può anche essere aumentata iniettando direttamente nella cella. Tuttavia, l'iniezione nel sacco di tuorlo è tecnicamente meno impegnativa e fornisce un taglio sufficiente per produrre pesci ad alta trasmissione germinale (>70% della prole contenente un allele modificato).
13. Riportare gli embrioni iniettati in una piastra di Petri correttamente etichettata, coprirli con 1x mezzi E3 con blu di metilene e metterli in un'incubatrice embrionale impostata a 28 °C.
14. A 24 ore dopo la fecondazione (HPF), ispezionare la salute degli embrioni iniettati, rimuovere gli individui morti o in via di sviluppo anomala e cambiare i mezzi (vedere figura 1). Controllare il tasso di sopravvivenza rispetto al controllo non iniettato.
    NOTA: Quando si prende di mira un gene non essenziale, si prevede meno del 10% di letalità rispetto al controllo non iniettato. Se si osservano elevati livelli di letalità nelle popolazioni iniettate dalla guida rispetto al controllo non iniettato, può indicare che il gene mirato è essenziale per lo sviluppo, o gli effetti fuori bersaglio stanno portando a uno sviluppo fallito. Potrebbe essere necessario ridurre la quantità di reagenti CRISPR iniettati o potrebbe essere necessaria la generazione di un nuovo sgRNA con effetti off-target ridotti.
15. Restituire gli embrioni all'incubatore e continuare a far crescere gli embrioni a 72 hpf, cambiando quotidianamente i media per mantenere la salute degli embrioni.

Representative Results

Figura 1: Confronto della salute degli embrioni iniettati da 24 HPF. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, si distingue facilmente da un embrione che ha abortito lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano (B) o hanno caratteristiche drasticamente modificate in (A), come la curvatura spinale o lo sviluppo alterato della testa e degli occhi devono essere rimossi dal piatto

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-free water	Any brand		Synthesis of guide RNAs. Thermo  Fisher and Qiagen both carry  suitable water.
E3 embryo media	Made in house		Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140	Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish	Thermo Fisher	FB0875711Z	Store embryos, cast injection plate
Agarose	Denville	CA3510-8	Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	To create wells to hold embryos during injection
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290	Dye for visualization of injection
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes	Any brand		Moving embryos
Razor blade	Thermo Fisher	11295-10	Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator			Maintaining embryos at 28.5 C.
Verticle pipette puller	David Kopf Instruments	700C	Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10	Geneate needles for injection.
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Load solution into injection needles
Microinjector	World Precision Instruments	PV 820	Injecting embryos.
Disecting microscope	Leica		Injecting embryos.
Microwave	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Scale	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Gloves	Any brand		For all aspects of the protocol.
N2	Any brand		To expell liquid from the capillary for embryo injection
PCR strip tubes	Any brand		For all aspects of the protocol.
200 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
10 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
Micropipettes	Any brand		For all aspects of the protocol.