胚微小注射:ゼブラフィッシュ黄身に化合物を送達する技術

- 注射の1晩前にメスと雄の魚2匹を分別した繁殖タンクに入れて、翌朝、仕切りを取り除き、タンクの底で卵を観察するまで魚を繁殖させる。

10個の胚を未注入のコントロールとして別のペトリ皿に入れておき、移管ピペットを使用して、胚を室温でマイクロインジェクションプレートのトラフに整列させ、顕微鏡の下に置きます。

注射後、メチレンブルーを28°CでE3培地で成長させ、胚の健康状態を確認し続け、死んだ胚や異常に発達している胚を取り除き、毎日培地を変更します。

-まず、テキストプロトコルに記載されているように注射を行う前の夜にゼブラフィッシュの被験者を準備します。その後、Cas9タンパク質とsgRNAを2対1の比率で組み合わせます。

注射針を準備するには、マイクロピペットプーラーを使用して1ミリメートルのガラス毛細管を引っ張り、得られたガラス針の先端をカミソリの刃で切って斜めの開口部を得る。

- 胚マイクロインジェクションを行う前に、ニードルの準備を行い、色素のみの溶液を使用してコントロール胚を注入し、24時間の発達後の生存期間を記録します。

-次に、10~15個の胚を対照集団として選択し、別のラベル付きのペトリ皿に入れます。残りの胚を室温の注入プレートに慎重に並べる。解剖顕微鏡の下で、各胚の黄身嚢に溶液のナノリットルを注入し、注入された胚をラベル付きペトリ皿に戻し、メチレンブルーの1X E3培地で覆う。