Microiniezione embrionale: una tecnica per consegnare un composto nel tuorlo zebrafish

- Posizionare due pesci femmine e due maschi in un serbatoio di riproduzione diviso una notte prima dell'iniezione. La mattina seguente, rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riprodusca fino a osservare le uova sul fondo del serbatoio. Raccogliere le uova e lavarle con un mezzo E3 contenente blu di metilene, un fungicida. Osservare le uova al microscopio e rimuovere le uova non fecondate. Le uova non fecondate hanno una membrana di tuorlo chiara, mentre le uova fecondate hanno una membrana di tuorlo scuro.

Tenere 10 embrioni in una piastra di Petri separata come controlli non iniettati. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare gli embrioni nel trogolo di una piastra di microiniezione a temperatura ambiente e posizionarla al microscopio. Spingere delicatamente l'ago di microiniezione attraverso il corrione nel tuorlo e iniettare lentamente un composto di interesse contenente un marcatore come il rosso fenolo. Il flusso citoplasmatico consente al composto di diffondersi nelle cellule embrionali.

Dopo l&iniezione, far crescere gli embrioni in mezzo E3 con blu di metilene a 28 gradi Celsius. Continuare a controllare la salute degli embrioni. Rimuovere eventuali embrioni morti o in fase di sviluppo anomalo e cambiare il mezzo ogni giorno. Nel protocollo seguente utilizzeremo la microiniezione per fornire una ribonucleoproteina, o complesso RNP, in embrioni di zebrafish.

- In primo luogo, preparare i soggetti zebrafish per l'allevamento la notte prima di eseguire iniezioni come descritto nel protocollo di testo. Quindi combinare la proteina Cas9 e lo sgRNA in un rapporto due a uno. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti mentre cas9 e sgRNA formano un complesso di ribonucleoproteina. Aggiungere quindi 0,5 microlitri di soluzioni rosso fenolo al 2,5% in acqua libera RNasi sufficiente per ottenere un volume finale di cinque microlitri.

Per preparare l'ago di iniezione, utilizzare un estrattore di micropipette per tirare un capillare di vetro di un millimetro. Quindi tagliare la punta dell'ago di vetro risultante con una lama di rasoio per ottenere un'apertura angolata. Posizionare l'ago in un micromanipolatore attaccato a un microiniettore. Utilizzando un microscopio leggero, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago inietta costantemente un nanoliter di soluzione nella piastra di Petri.

- Prima di eseguire la microiniezione embrionale, esercitate a preparare aghi e iniettare embrioni di controllo utilizzando una soluzione solo colorante e registrare la sopravvivenza dopo 24 ore di sviluppo. Dovrete essere in grado di ottenere una sopravvivenza superiore al 90% rispetto a un controllo non iniettato.

- Quindi, selezionare da 10 a 15 embrioni come popolazione di controllo e metterli in una piastra di Petri etichettata separata. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare accuratamente gli embrioni rimanenti su una piastra di iniezione a temperatura ambiente. Al microscopio a dissezione, iniettare un nanoliter della soluzione nel sacco vitellino di ogni embrione. Quindi restituire gli embrioni iniettati a una piastra di Petri etichettata e coprirli con mezzi 1X E3 con blu di metilene. Posizionare gli embrioni iniettati in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per 24 ore. Ispezionare quindi gli embrioni iniettati per rimuovere gli individui morti o in via di sviluppo anomali.