Microinyección embrionaria: una técnica para entregar un compuesto en la yema de pez cebra

Overview

Este video describe una técnica de microinyección embrionaria para entregar compuestos en saco de yema de pez cebra.

Protocol

1. Microinjeción de componentes CRISPR en embriones de pez cebra

1. Instalar tanques de cría la noche antes de inyectar colocando el número de machos y hembras deseados (típicamente 2 hembras y 1 o 2 machos) en un tanque de cría con un divisor en su lugar.
2. Prepare una placa de microinjeción con 1,5% de agarose en 1x medios E3 (ver Tabla de Materiales) con 0,01% azul metileno (un fungicida) vertiendo 35 ml de la agarose derretida en una placa Petri de 10 cm y colocando suavemente un molde de plástico para crear vaguadas en forma de cuña en la solución, tocando el molde para eliminar las burbujas de aire.
3. Deje que la agarose se ajuste, y guarde el plato con una pequeña cantidad de medios y envuelto en película de parafina para evitar que el plato se seque a 4 °C.
   NOTA: Las placas de inyección son reutilizables durante varias semanas, hasta que los pozos se deforman o se secan, o la placa comienza a crecer moho.
4. En la mañana de la inyección, descongelar el sgRNA purificado y la proteína Cas9 en el hielo. Recuerde manejar todos los materiales con guantes para evitar la contaminación por RNase y utilizar puntas y tubos libres de RNase.
5. Genere una solución de inyección de 5 μL combinando la proteína Cas9 y el sgRNA en una relación de 2:1 de Cas9:sgRNA para obtener concentraciones finales de proteína Cas9 de 400 pg/nL y esgRNA de 200 pg/nL. Incubar la solución Cas9/sgRNA a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el Cas9 y el SgRNA formen un complejo de ribonucleoprotein. Añada 0,5 μL de solución roja de fenol wt/vol del 2,5% (véase Tabla de materiales)y agua libre de RNase a un volumen final de 5 μL.
   NOTA: Se ha demostrado que la resistencia iónica de la solución afecta a la solubilidad del complejo Cas9/sgRNA, por lo que la adición de KCl puede aumentar la eficiencia de corte de los sgRNAs que exhiben baja formación de indel.
6. Haga una aguja de inyección tirando de un capilar de vidrio de 1,0 mm usando un tirador de micropipette. Corte la punta de la aguja recién hecha usando una nueva cuchilla de afeitar o fórceps para obtener una abertura en ángulo que perforará fácilmente el saco de coral y yema.
7. Coloque la aguja en un micromanipulador unido a un microinyector con la fuente de aire encendida. Bajo un microscopio de luz utilizando la ampliación adecuada para la calibración determinada para el aparato en particular, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja expulse constantemente una solución de 1 nL en una placa Petri llena de aceite mineral.
   NOTA: La calidad de la aguja es crítica. Practique la producción de una aguja y la inyección en el saco de yema de embriones hasta que se domine esta habilidad antes de intentar más experimentos.
8. Retire el divisor y deje que los peces se reproduzcan durante aproximadamente 15 min.
   NOTA: Los tiempos de reproducción más largos producirán más embriones, sin embargo, la inyección debe completarse mientras los embriones están en la etapa de 1 célula para maximizar la posibilidad de que el corte de Cas9 ocurra a tiempo y, por lo tanto, disminuya el mosaicismo genético. Los embriones se pueden inyectar en etapas posteriores (2-4 etapas celulares), pero esto posiblemente puede disminuir la tasa de transmisión de la línea germinal del alelo modificado.
9. Recoge los huevos usando un colador y enjuáguelos en una placa Petri de 10 cm usando medios E3 1x con azul metileno 0.0001%. Examine la salud de los huevos bajo el microscopio de luz, eliminando los huevos y desechos no fertilizados.
10. Reserva de 10 a 15 embriones como un control no inyectado en una placa de Petri separada y etiquetada.
11. Con una pipeta de transferencia, alinee suavemente los huevos en la placa de inyección calentada a temperatura ambiente.
12. Bajo un microscopio de disección a 2,5X de aumento, inyecte 1 nL de la solución en el saco de yema de cada embrión para inyectar un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de esgRNA.
    NOTA: Para aumentar el corte si lo desea o es necesario, aumente la concentración final de la proteína Cas9 a 800 pg/nL y del sgRNA a 400 pg/nL en la solución de inyección; sin embargo, esto también puede aumentar el corte fuera del objetivo y/o disminuir la salud de los embriones. La eficiencia de corte también puede aumentarse inyectando directamente en la célula. Sin embargo, la inyección en el saco de yema es técnicamente menos exigente y da suficiente corte para producir peces con alta transmisión de gérmenes (>70% de la descendencia que contiene un alelo modificado).
13. Devuelve los embriones inyectados a una placa Petri correctamente etiquetada, cúbrelos con medios E3 1x con azul metileno y colócalos en una incubadora de embriones situada a 28 °C.
14. A las 24 h posterior a la fertilización (HPF), inspeccione la salud de los embriones inyectados, eliminando a individuos muertos o en desarrollo anormal y cambie los medios (Ver Figura 1). Compruebe la tasa de supervivencia contra el control no inyectado.
    NOTA: Cuando se dirige a un gen no esencial, se espera menos del 10% de letalidad en relación con el control no inyectado. Si se observan niveles elevados de letalidad en las poblaciones inyectadas por guía en comparación con el control no inyectado, puede indicar que el gen objetivo es esencial para el desarrollo, o los efectos fuera del objetivo están llevando al desarrollo fallido. Puede ser necesaria la reducción de la cantidad de reactivos CRISPR inyectados o la generación de un nuevo sgRNA con efectos fuera de objetivo reducidos.
15. Devolver los embriones a la incubadora y seguir creciendo los embriones a 72 CV, cambiando los medios de comunicación diariamente para mantener la salud del embrión.

Representative Results

Figura 1: Comparación de la salud de 24 embriones inyectados por HPF. Un embrión vivo (A) desarrollado a 24 CV, se distingue fácilmente de un embrión que ha abortado el desarrollo (B). Los embriones que se asemejan a (B) o tienen características drásticamente alteradas a (A), como la curvatura espinal o el desarrollo alterado de la cabeza y los ojos deben ser retirados del plato

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-free water	Any brand		Synthesis of guide RNAs. Thermo  Fisher and Qiagen both carry  suitable water.
E3 embryo media	Made in house		Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140	Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish	Thermo Fisher	FB0875711Z	Store embryos, cast injection plate
Agarose	Denville	CA3510-8	Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	To create wells to hold embryos during injection
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290	Dye for visualization of injection
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes	Any brand		Moving embryos
Razor blade	Thermo Fisher	11295-10	Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator			Maintaining embryos at 28.5 C.
Verticle pipette puller	David Kopf Instruments	700C	Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10	Geneate needles for injection.
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Load solution into injection needles
Microinjector	World Precision Instruments	PV 820	Injecting embryos.
Disecting microscope	Leica		Injecting embryos.
Microwave	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Scale	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Gloves	Any brand		For all aspects of the protocol.
N2	Any brand		To expell liquid from the capillary for embryo injection
PCR strip tubes	Any brand		For all aspects of the protocol.
200 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
10 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
Micropipettes	Any brand		For all aspects of the protocol.