Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Colocar dos peces hembra y dos machos en un tanque de cría dividido una noche antes de la inyección. La mañana siguiente, retire el divisor y deje que los peces se reproduzcan hasta que observe huevos en la parte inferior del tanque.
Mantenga 10 embriones en una placa de Petri separada como controles no inyectados. Usando una pipeta de transferencia, alinee los embriones en la vaguada de una placa de microinjección a temperatura ambiente y colóquela bajo el microscopio.
Después de la inyección, cultivar los embriones en medio E3 con azul metileno a 28 grados centígrados. Seguir comprobando la salud de los embriones. Retire cualquier embrión muerto o anormalmente en desarrollo y cambie el medio diariamente. En el siguiente protocolo, usaremos microinyecto para suministrar una ribonucleoproteína, o complejo RNP, en embriones de pez cebra.
- En primer lugar, preparar los sujetos de pez cebra para la cría de la noche antes de realizar las inyecciones como se describe en el protocolo de texto. A continuación, combine la proteína Cas9 y el sgRNA en una relación de dos a uno. Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras que el Cas9 y el SgRNA forman un complejo de ribonucleoprotein.
Para preparar la aguja de inyección, utilice un tirador de micropipette para tirar de un capilar de vidrio de un milímetro. A continuación, corte la punta de la aguja de vidrio resultante con una cuchilla de afeitar para obtener una abertura en ángulo. Coloque la aguja en un micromanipulador unido a un microinyector.
- Antes de realizar la microinyección embrionaria, practique la preparación de agujas y la inyección de embriones de control utilizando una solución solo con tinte y registre la supervivencia después de 24 horas de desarrollo.
- A continuación, seleccione de 10 a 15 embriones como población de control y colóquelos en una placa de Petri etiquetada separada. Bajo un microscopio de disección, inyecta un nanolitro de la solución en el saco de yema de cada embrión. Luego devuelve los embriones inyectados a una placa petri etiquetada y cúbrelos con medios 1X E3 con azul metileno.
