Overview
이 비디오는 대사 산물 프로파일링을 위한 유방암 세포 견본을 준비하는 기술을 기술합니다. 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 알파에 결합하고 대사 산물 조성물의 변화를 일으키는 estradiol로 치료됩니다.
Protocol
1. 메타볼로믹스 분석 샘플 준비
- 세포 배양 및 치료
- 종자 400,000 MCF7 세포 당 10cm 플레이트 성장 배지. 각 치료에 대해 세 가지 샘플을 준비합니다. 각 샘플에 두 개의 플레이트를 사용하여 검출을 위한 충분한 셀을 수신합니다. 3일째에, 배지를 제거하고10-8 M 에스트라디올 또는 E2의 유무에 관계없이 5ml의 신선한 배지를 세포에 추가합니다. 세포를 24시간 동안 치료한다(가습5%CO2 대기시 37°C).
- 샘플 수집
- 접시에 5 ml 얼음 차가운 1x PBS를 추가하고, 잠시 접시를 여러 번 기울인 후 PBS를 흡인합니다. 두 번 반복하고 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다.
- 각 플레이트에 750 μl의 사전 차가운 아세톤을 넣고 세포를 긁어냅니다. 두 접시에서 얼음에 2ml 튜브에 아세톤에 세포를 결합합니다.
- 정규화를 위한 셀 수
- 각 치료에 대해 세포 정량화에 2 개의 추가 플레이트를 사용합니다. 플레이트에서 세포를 분리하려면 각 플레이트에 HE 버퍼 2ml(HBSS 1x, 10m HEPES, 0.075% NaHCO3 및 1mM EDTA)를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
- HE 버퍼에서 세포를 파이펫팅하여 세포를 수집하고 잘 섞습니다. 총 20μl 세포 용액을 사용하여 혈류계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 메타볼로믹스 센터로 보내기 전에 -80°C에 샘플을 저장하여 가스 크로마토그래피 질량 분광법(GC-MS) 분석을 사용하여 대사산물을 식별하고 정량화한다.
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