Sample Preparation for Metabolomics: A Method to Prepare Cell Samples for Metabolitecs(대사체학을 위한 시료 준비: 대사체를 위한 세포 시료 전처리 방법)

Abstract

출처: Zhao, Y. C. et. al., 유방암에서 에스트로겐 수용체 신호에 의한 대사 조절의 시스템 생물학. J. Vis. 특급. (2016).

이 동영상은 대사 산물 프로파일링을 위해 유방암 세포 샘플을 준비하는 기술에 대해 설명합니다. 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 알파에 결합하여 대사 산물 구성에 변화를 일으키는 에스트라디올로 치료됩니다.

Protocol

1. 대사체학 분석 시료 준비

1. 세포 배양 및 치료
   1. 성장 배지에 10cm 플레이트당 400,000개의 MCF7 세포를 파종합니다. 각 처리에 대해 3개의 샘플을 준비합니다. 각 샘플에 두 개의 플레이트를 사용하여 검출에 충분한 세포를 받습니다. 3일차에 배지를 제거하고 ^10-8M 에스트라디올 또는 E2의 유무에 관계없이 5ml의 신선한 배지를 세포에 추가합니다. 세포를 24 시간 (가습 된 37 % CO₂ 대기에서 5 ° C) 동안 처리합니다.
2. 시료 채취
   1. 접시에 얼음처럼 차가운 5ml 1x PBS를 넣고 접시를 짧게 여러 번 기울인 후 PBS를 흡입합니다. 두 번 반복하고 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거하십시오.
   2. 각 플레이트에 750μl의 사전 저온 아세톤을 추가하고 세포를 긁어냅니다. 두 개의 플레이트에서 아세톤의 세포를 얼음 위의 2ml 튜브에 결합합니다.
   3. 정규화를 위한 셀 수
      1. 각 처리에 대해 세포 정량화를 위해 두 개의 추가 플레이트를 사용합니다. 플레이트에서 세포를 분리하려면 각 플레이트에 2ml의 HE 버퍼(1x HBSS, 10mM HEPES, 0.075% NaHCO₃ 및 1mM EDTA)를 추가하고 5분 동안 배양합니다.
      2. HE buffer에서 세포를 피펫팅하여 세포를 잘 수집하고 혼합합니다. 총 20μl 세포 용액을 사용하여 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
3. 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS) 분석을 사용하여 대사 산물을 식별하고 정량화하기 위해 대사체학 센터로 보내기 전에 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.