メタボロミクスのサンプル調製: 代謝物プロファイリング用の細胞サンプルを準備する方法

Overview

このビデオでは、代謝産物プロファイリングのために乳癌細胞サンプルを調製する手法について説明します。乳癌細胞はエストラジオールで治療され、エストロゲン受容体αに結合し、代謝産物組成物の変化を引き起こす。

Protocol

1. メタボロミクスアッセイサンプル調製

1. 細胞培養と治療
   1. シード 400,000 成長培地の 10 cm プレートあたり MCF7 細胞。各治療に対して3つのサンプルを調製する。検出に十分なセルを受け取るために、各サンプルに2枚のプレートを使用します。3日目に培地を取り出し^、10-8 MエストラジオールまたはE2を使用するか、または含まない5mlの新鮮な培地を細胞に加えます。細胞を24時間(加湿5%CO2雰囲気中37°C)にして処理します。
2. サンプル コレクション
   1. プレートに5mlの氷冷1x PBSを加え、プレートを数回短時間傾けた後にPBSを吸引する。2回繰り返し、最後の洗浄後にできるだけ多くのPBSを取り除きます。
   2. 各プレートに750μlのプレコールドアセトンを加え、細胞を削ります。2つのプレートからアセトンの細胞を氷の上の2mlチューブに組み合わせます。
   3. 正規化のためのセル数
      1. 各処理に対して、細胞定量のために2枚のプレートを使用します。プレートから細胞を取り付け解除するには、2 ml の HE バッファー (1x HBSS、10 mM HEPES、0.075% NaHCO 3、および 1 mM EDTA) を各プレートに加え_、5分間インキュベートします。
      2. HEバッファー内の細胞をピペット処理して細胞を収集し、よく混合します。合計20 μlの細胞溶液を使用して、ヘモサイトメーターを使用して細胞数をカウントします。
3. サンプルを-80 °Cで保存してからメタボロミクスセンターに送り、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)分析を使用して代謝産物を同定および定量化します。