Summary
मेढक
Abstract
हम उभयचर Xenopus में विकसित किया है एक अद्वितीय गैर स्तनधारी ऐसे gp96 के रूप में chaperoned प्रतिजनों के पार प्रस्तुति को सुविधाजनक बनाने के लिए और सहज और अनुकूली टी सेल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना. Xenopus त्वचा भ्रष्टाचार अस्वीकृति कुछ गर्मी झटका प्रोटीन (hsps) की क्षमता का अध्ययन मॉडल laevis gp96 की क्षमता शास्त्रीय MHC वर्ग (वर्ग आइए) आइए प्रतिबंधित टी सेल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है. इसके अतिरिक्त, Xenopus मॉडल प्रणाली भी gp96 की क्षमता ट्यूमर है कि उनके वर्ग आइए अणुओं नीचे विनियमित जिससे प्रतिरक्षा निगरानी से बचने के खिलाफ प्रतिक्रियाओं उत्पन्न की खोज के लिए चूहों को एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है. हाल ही में, हम Xenopus प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) के रूप में peritoneal leukocytes का उपयोग कर क्लोनों में एक दत्तक सेल हस्तांतरण परख विकसित किया है, और दिखाया कि gp96 प्रधानमंत्री CD8 मामूली उतक अनुरूपता त्वचा प्रतिजनों के खिलाफ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Xenopus thymic 15 ट्यूमर के खिलाफ vivo में कर सकते हैं टी सेल प्रतिक्रिया 0 / है कि कक्षा आइए अणुओं व्यक्त नहीं करता है. हम यहाँ peritoneal leukocytes निकालना स्पंदन, और दत्तक हस्तांतरण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से त्वचा भ्रष्टाचार और ट्यूमर प्रत्यारोपण assays सहित इन assays के प्रदर्शन के लिए शामिल पद्धति का वर्णन. इसके अलावा हम भी और परिधीय रक्त प्रवाह cytometry और प्रसार assays जो effector त्वचा अस्वीकृति और विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रियाओं में शामिल आबादी के आगे लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं के लिए इस्तेमाल किया leukocytes की कटाई जुदाई का वर्णन कर रहे हैं.
Protocol
1. पशु
एक्स laevis एक्स एक्स गिल्ली संकर एलजी-6 और एलजी-15 isogenetic 1 क्लोन रोचेस्टर (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm) के विश्वविद्यालय में हमारे प्रजनन कॉलोनी से कर रहे हैं. एलजी-6 और एलजी-15 शेयर ही विषमयुग्मजी MHC (एक / ग) haplotype लेकिन मामूली (एच) उतक अनुरूपता loci में अलग. इन क्लोनों से संतान gynogenesis द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, जिसमें द्विगुणित महिला द्वारा उत्पादित अंडे यूवी विकिरणित शुक्राणु (नहीं डीएनए संतान के लिए अपने योगदान) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं.
दस्ताने के उपयोग ऐच्छिक है. कुछ लोगों को पहनने के क्योंकि यह अधिक कठिन है मेंढ़कों संभाल (फिसलन) और वास्तव में यह मेंढक को असहज कर प्रतीत होता है उन्हें नहीं पसंद करते हैं.
2. Gp96 के 15 / 0 ट्यूमर (दोनों ट्यूमर और एच AGS माइनर एक्सप्रेस) से शोधन
Gp96 शुद्धि पहले किया गया है 2, 3 में वर्णित है . संक्षेप में, gp96 50-70% अमोनियम सल्फेट fractionation, conA sepharose और DEAE क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा से शुद्ध होता है. प्रोटीन के बारे में 20-50 μg ट्यूमर ऊतक के एक एमएल प्रति प्राप्त किया जा सकता है. तैयारी की पवित्रता एसडीएस PAGE और ज़ुल्फ़ धुंधला द्वारा निर्धारित किया जाता है.
3. निकालना और माइनर एच एजी-असमान एलजी-6 मेंढक से Peritoneal leukocytes (PLS) के हार्वेस्ट
- एक 25 एमएल रातोंरात ई. आगे बढ़ें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 37 कोलि संस्कृति ° सी झटकों के साथ.
- अगले दिन यह 1 घंटे के लिए उबलते द्वारा गर्मी जीवाणुओं को मारने.
- ई. मारे गर्मी अपकेंद्रित्र 4 में 2,000 rpm (1500 ग्राम) डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोलि
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1 / 10 वें APBS में मूल संस्कृति मात्रा (2.5 एमएल) में बैक्टीरिया गोली resuspend. इस बिंदु पर बैक्टीरिया संस्कृति उपयोग के लिए तैयार है और 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- (आईपी) intraperitoneally 200 (2 इंच मेंढक के लिए) या गर्मी के मारे मेंढक प्रति बैक्टीरियल तैयारी 25 5 गेज / 8 सुई का उपयोग करते हुए (3 इंच मेंढक के लिए) की 300 μL इंजेक्षन.
- इंजेक्शन Pls के तीन दिन बाद intraperitoneal lavage द्वारा harvested रहे हैं.
- पीएल कटाई से पहले, वयस्क मेंढ़कों 0.1% tricaine मीथेन (टीएमएस, MS-222) sulfonate सोडियम बिकारबोनिट के साथ 5 मिनट के लिए बफर के जलीय घोल में विसर्जन के द्वारा anesthetized हैं जब तक सभी आंदोलन रहता है (अवधि के आकार और उम्र पर निर्भर करता है). पशु उपचार के बाद 10-20 मिनट के भीतर जगा.
- मेंढक की 70% इथेनॉल की एक छोटी राशि के साथ पेट कीटाणुरहित.
- 5 (2 इंच मेंढक के लिए) एमएल या बाँझ 18 1 गेज आधा सुई का उपयोग peritoneal गुहा में पहले कमरे के तापमान पर गरम APBS के 10 एमएल (3 इंच मेंढक के लिए) इंजेक्षन. सुई निकालें और धीरे से एक मिनट के लिए बीमा है कि बफर इंजेक्शन शरीर गुहा में तरल पदार्थ के साथ equilibrates के लिए मेंढक मालिश.
- एक peritoneal तरल पदार्थ है कि सुई के पीछे से एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ड्रिप इकट्ठा सिरिंज के बिना एक नया 18 1 गेज आधा सुई का प्रयोग करें. संभव के रूप में के रूप में प्रारंभिक इंजेक्शन की मात्रा का ज्यादा पुनः प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें. पेट क्षेत्र के मध्य क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए सावधान रहें.
- एक बार pls उथले पानी के साथ एक कंटेनर में मेंढक डाल harvested रहे हैं जब तक यह जाग रहा है पर जो बात वह अपने पिंजरे में वापस रखा जा सकता है.
4. अनुभवहीन Lg-6 प्राप्तकर्ता में Lg-6 Pls के स्पंदन और दत्तक स्थानांतरण
- Pls एक बार ठंड APBS के साथ और धो १,००० rpm (750 ग्राम) पर उन्हें 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और APBS में Pls resuspend.
- 5 x 10 5 Pls प्रति 1 gp96 μg की एकाग्रता पर gp96 साथ Pls पल्स.
- एक बार gp96 की उचित राशि के pls के लिए जोड़ा जाता है, 1 घंटे के लिए उन्हें मिश्रण और बर्फ पर pipeting सेते द्वारा.
- कोशिकाओं को या तो 10 मिनट के लिए 4 में 1,000 आरपीएम ° सी या 1 मिनट के लिए 14,000 rpm पर किसी भी gp96 अनबाउंड हटायें अपकेंद्रित्र.
- ठंडा करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ कोई अवशिष्ट gp96 बाईं APBS 3X Pls धो.
- 5 एक्स 5 10 300 μL प्रति Pls की एकाग्रता पर स्पंदित Pls Resuspend.
- Adoptively आईपी इंजेक्शन द्वारा 25 गेज 5 / 8 सुई का उपयोग Pls हस्तांतरण. जानवर प्रति स्पंदित Pls (5 x 10 5 कोशिकाओं) के 300 μL इंजेक्षन.
- मेंढक के लिए कम से कम 3 दिनों के primed होने से पहले त्वचा भ्रष्टाचार या ट्यूमर चुनौती प्रयोगों के साथ जारी रखने की जरूरत है.
5. त्वचा भ्रष्टाचार परख
त्वचा भ्रष्टाचार अस्वीकृति Xenopus 4, 5, 6 में एक अच्छी तरह से स्थापित परख है. Xenopus में एक प्राप्तकर्ता 21-22 दाता 18-22 दिनों के भीतर 1 या 2 MHC haplotype बेमेल प्रदर्शित त्वचा डिग्री सेल्सियस को खारिज कर दिया इसके विपरीत में, एलजी-6 और एलजी-15 क्लोन है कि केवल मामूली एच AGS द्वारा अलग त्वचा grafts के बीच और अधिक धीरे - धीरे खारिज कर रहे हैं (और 30 दिन है कि). हालांकि, इस अस्वीकृति प्राप्तकर्ताओं था में त्वरितटी दाता एच AGS नाबालिग के खिलाफ किया गया है या तो primed पिछले एक त्वचा भ्रष्टाचार या gp96 के साथ प्रतिरक्षण दाता से शुद्ध द्वारा. सब पर कोई अस्वीकृति तब होता है जब दाता और प्राप्तकर्ता आनुवंशिक समान है (उदाहरण के लिए, क्लोन या पूरी तरह से सहज पशुओं) हैं. इसलिए, इस सरल तकनीक vivo में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में निस्र्पक gp96 द्वारा हासिल करने के लिए बहुत शक्तिशाली है .
- दाता के रूप में 3.7 में वर्णित मेंढक anesthetize.
नोट: केवल न्यूनतम सावधानियों ले जाया जा जरूरत है के बाद से त्वचा है कि कुल सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं के लिए की जरूरत है obviates में Xenopus प्रबल विरोधी माइक्रोबियल पेप्टाइड्स ( जैसे, magainin) का उत्पादन. वास्तव में, किसी भी निस्संक्रामक के साथ मेंढक की उपचार त्वचा के लिए हानिकारक होगा. इसके अलावा, Xenopus किसी भी रोगज़नक़ों कि मनुष्य के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है है नहीं है . इसलिए, दस्ताने का उपयोग वैकल्पिक है. हालांकि, सभी विच्छेदन प्रयुक्त उपकरणों को autoclaved की जरूरत है और सभी समाधान के लिए बाँझ होने की जरूरत है. - काटें और एक छोटे से हटायें (20 मिमी एक्स 5 मिमी) उदर त्वचा के एक दाता एलजी-15 कैंची का उपयोग मेंढक से टुकड़ा (पेट की त्वचा है जो irridophore pigmented कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से चांदी प्रकट होता है).
- Petridish युक्त APBS में त्वचा प्लेस और बर्फ पर रख. त्वचा के ऊतकों को बहुत धीरे हेरफेर, यह संदंश के बीच में धारण से बचने के.
- एक उस्तरा या कैंची का प्रयोग 5 मिमी में व्यक्तिगत grafts के एक्स 5 मिमी टुकड़े काट. बर्फ पर APBS में टुकड़े रखें.
- इस बिंदु पर दाता मेंढक उथले पानी के साथ एक कंटेनर में रखा जाता है जब तक यह जाग और तब यह एंटीबायोटिक दवाओं (5 मिलीग्राम / एल की एकाग्रता पर Penstrep) से युक्त पानी में रखा गया है. मेंढक बिंदु जो यह सामान्य पानी में वापस आ रहा है पर दो दिनों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पानी में रखा जाता है. साइट जहां त्वचा हटा दिया गया था पर छोटा सा घाव को सिला होने की जरूरत नहीं करता है और एक सप्ताह के भीतर भर देता है.
- प्राप्तकर्ता मेंढक एलजी-6 anesthetize.
- प्राप्तकर्ता (वापस) के पृष्ठीय त्वचा पर एक छोटा सा चीरा और 5 मिमी एक्स 5 त्वचा के नीचे चांदी पक्ष के साथ मिमी भ्रष्टाचार सम्मिलित. त्वचा के नीचे बड़े हवाई बुलबुले परिचय नहीं है कि क्योंकि विस्थापन या यहाँ तक कि भ्रष्टाचार के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सावधान रहो.
- सुनिश्चित करें कि आप grafts पर कैंची और संदंश चिह्नों ध्यान दें क्योंकि उन भ्रष्टाचार अस्वीकृति के रूप में गिनती नहीं है एक बार स्कोरिंग शुरू कर रहे हैं.
- 24 घंटे बाद overlaying मेजबान त्वचा के एक हिस्से को भ्रष्टाचार से हटा दिया जाना चाहिए.
- प्राप्तकर्ता मेंढक एलजी-6 anesthetize. जानवर के रूप में 5.1 में वर्णित संभाल.
- Autoclaved कैंची का प्रयोग भ्रष्टाचार के आसपास बाहर एक खिड़की में कटौती इतनी है कि भ्रष्टाचार आज़ादी visualized किया जा सकता है. दाता त्वचा को छू नहीं या खून बह रहा प्रेरित करने के लिए सावधान रहें. मेंढक पुनर्प्राप्त 5.5 में वर्णित के रूप में.
- एक स्केच लेकर भ्रष्टाचार सही दूर स्कोरिंग शुरू करो. त्वचा भ्रष्टाचार अस्वीकृति grafted त्वचा पर irridophores के विनाश के प्रतिशत के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- grafts करने के लिए हर 2-3 दिनों में जाँच की जानी चाहिए, लेकिन पशुओं के लिए इस के लिए anesthetized की जरूरत नहीं है. Grafts कल्पना करने के लिए, मेंढ़क petridish में एक विदारक खुर्दबीन के नीचे रखा जाना चाहिए.
6. प्रत्यारोपित त्वचा के पूरे माउंट Immunohistology
मेंढक माउंट immunohistology पूरे पहले 6 में वर्णित किया गया है. संक्षेप में, मेंढक anesthetized है और एक बाँझ पूर्व मेंढक पानी (कार्य क्षेत्र भी aseptically तैयार किया जाता है) के साथ गीला कागज तौलिया पर खुर्दबीन के नीचे रखा है. त्वचा प्रत्यारोपित तो मेजबान त्वचा के आसपास की एक छोटी राशि के साथ एक साथ काटा है और यह एंटीबॉडी के साथ दाग प्रवाह cytometry 6 विश्लेषण के लिए सेल धुंधला के लिए इसी तरह. Autoclaved उपकरणों और बाँझ बफ़र्स के लिए इस्तेमाल किया जा जरूरत है. त्वचा धुंधला हो जाना करने के बाद एक खुर्दबीन स्लाइड पर रखा गया है और धीरे से एक कवर पर्ची के साथ दबाया. इस बिंदु पर त्वचा अलग सेल आबादी है कि भ्रष्टाचार में घुसपैठ की है के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग visualized किया जा सकता. प्रक्रिया के बाद मेंढक पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ रखा जाता है खंड 5.5 में वर्णित के रूप में. और सामान्य पानी में लौट आए. छोटे घाव छोड़ दिया है जहां त्वचा हटा दिया गया था एक सप्ताह के भीतर भर देता है.
7. रक्त leukocytes की विशेषता
- मेंढक से रक्त निकालने से पहले, एक लौ से अधिक बाँझ पाश्चर pipettes खींच द्वारा "काँच की सुइयों" तैयार की जरूरत है. विंदुक के ठीक सिरा stereomicroscope तहत बढ़ाई है. विंदुक तो एक आकांक्षा प्लास्टिक की ट्यूब से जुड़ा है.
संदंश और कैंची जैसे सभी उपकरणों के लिए उपयोग करने से पहले autoclaved होने की जरूरत है. - इसके अलावा 50 इकाइयों APBS के 1 एमएल प्रति हेपरिन जोड़कर बर्फ APBS और हेपरिन समाधान की ठंड 10 एमएल तैयार. बर्फ पर समाधान रखें. सभी इस्तेमाल समाधान करने के लिए बाँझ होने की जरूरत है.
- मेंढक anesthetize के रूप में 3.7 में वर्णित है, और वही जानवर से निपटने के रूप में 5.1 में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करें. .
- कट पीछे पैर ऊपर त्वचा को बेनकाबपृष्ठीय टैसास नस.
- APBS + हेपरिन समाधान के 1-2 एमएल के साथ पाश्चर विंदुक भरें.
- नस में "काँच की सुई" डालें और धीरे धीरे मुँह के साथ aspirating द्वारा रक्त संग्रह शुरू. यह महत्वपूर्ण है "काँच की सुई" में APBS + हेपरिन समाधान के बाद से यह थक्के और सुई की नोक clogging से खून रोकने जाएगा.
- 1 से 2 एमएल रक्त की एक औसत आकार के मेंढक से प्राप्त किया जा सकता है.
- मेंढक पैर पर छोटा सा चीरा के लिए सिल दिया हो जरूरत नहीं है और घाव एक सप्ताह के भीतर भर देता है.
- 4 में 10 मिनट के लिए 1000 rpm पर रक्त अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंड APBS के 10 एमएल के साथ 1X कोशिकाओं धो लो.
- ओवरले ficoll Histopaque 1.077 (सिग्मा) कमरे के तापमान पर पूर्व गरम क्रम में लाल रक्त कोशिकाओं से अलग रक्त leukocytes के 1 एमएल पर खून की 2 एमएल (1-5 एक्स 10 6 कोशिकाओं).
- कमरे के तापमान पर कोई ब्रेक के साथ 1,000 rpm पर 20 मिनट अपकेंद्रित्र, और तब ल्युकोसैट बैंड इकट्ठा.
- 4 में 10 मिनट के लिए 1400 rpm पर centrifugation द्वारा APBS साथ 2X कोशिकाओं धो डिग्री सेल्सियस अवशिष्ट ficoll हटायें.
- इस बिंदु पर कोशिकाओं प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग बनने के लिए तैयार हैं, या इन विट्रो संस्कृति assays में के लिए इस्तेमाल हो .
8. ट्यूमर ट्रांसप्लांटेशन परख
- 15 / 0 ट्यूमर कोशिकाओं की एक ताजा बैच और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से बढ़ शुरू से बाहर के बारे में एक सप्ताह के प्रयोग पिघलना पहले. संस्कृति मध्यम संक्षेप अगले भाग में और 3 में और अधिक विस्तार में वर्णित है .
- 15 / 0 ट्यूमर कोशिकाओं का विस्तार करें.
- प्रयोग के दिन, कोशिकाओं की गिनती और Trypan नीले अपवर्जन द्वारा कोशिका मृत्यु का निर्धारण. कोशिका मृत्यु कम से कम 5% होना चाहिए. १,००० rpm पर ठंड APBS में 1X कोशिकाओं, और अपकेंद्रित्र 4 ° C 10 मिनट के लिए धो.
- 5 एक्स 5 10 300 μL प्रति 15 / 0 कक्षों की एक घनत्व में ट्यूमर मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं Resuspend.
- प्रत्यारोपण 5 x 10 उपचर्म इंजेक्शन जानवर (वापस) के पृष्ठीय पक्ष के एक तरफ एक 25 5 गेज / 8 सुई का उपयोग 5 300 मेंढक प्रति μL मात्रा में कोशिकाओं.
- ट्यूमर के विकास को 2-3 सप्ताह के भीतर ट्यूमर चुनौती के बाद शुरू होगा. प्रारंभिक ट्यूमर की उपस्थिति और ध्यान दिया जाना चाहिए मात्रा ट्यूमर के लिए हर 2-3 दिनों में दर्ज की जरूरत है. कैलिपरस ट्यूमर मात्रा (ऊँचाई एक्स लंबाई एक्स चौड़ाई) का उपयोग करके मापा जाता है.
- एक बार ट्यूमर 3500 3 मिमी के लिए बढ़ता है या मेंढक सुस्त तलाश शुरू होता है, यह असुविधा को रोकने के euthanized होने की जरूरत है.
9. अभिकर्मकों की आवश्यकता:
- 6.6 छ / एल NaCl, 1.15 छ / एल ना 2 HPO 4, 0.2 छ / एल के.एच. 2 पीओ: एम्फ़िबियाई फास्फेट (APBS) खारा buffered. पीएच 7.5 10N NaOH और फिल्टर का उपयोग कर 0.2 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से निष्फल.
- Tricaine मीथेन sulfonate (टीएमएस, MS-222) (अर्द्धचंद्र अनुसंधान रसायन कैस 886-86-2 #).
- सोडियम बिकारबोनिट (फिशर साइंटिफिक एस-233-500).
- Histopaque 1077 (सिग्मा Aldrich एमएल 10771-100)
- हेपरिन सोडियम साल्ट (सिग्मा Aldrich H3149 - 50KU)
- Xenopus 15 / 0 ट्यूमर के लिए संस्कृति माध्यम [3 अधिक जानकारी के लिए देखें.]: 1 Iscove DMEM बेसल मध्यम (Gibco - Invitrogen 11,965) के साथ 10 एमएल इंसुलिन, 10 एमएल गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 10 एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन एल, 10 μg / एमएल Kanamycin की, primatone (शेफील्ड उत्पाद प्रभाग), β2 - mercaptoethanol के 1 एमएल, और पानी में 3.02 छ NaHCO 3 (7.0 पीएच) के 3 एमएल. इस माध्यम के 30% दोहरा आसुत जल जोड़कर उभयचर osmolarity पतला है, और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम Xenopus गुर्दे सेल लाइन A6 से 20% superantant, और सामान्य Xenopus सीरम के 0.25% के साथ पूरक.
10. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 त्वचा भ्रष्टाचार अस्वीकृति 12 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के Stereomicroscopic विश्लेषण. एलजी 6 क्लोन मेंढक या तो (ए) एक MHC-समान एलजी 6 से एक त्वचा भ्रष्टाचार प्राप्त (कोई अस्वीकृति से पता चलता है) या (बी) एक MHC-असमान outbred दाता (80% अस्वीकृति). तीर चांदी iridophore pigmented कोशिकाओं को स्वस्थ ऊतक (गैर खारिज कर दिया) grafted अंकन से पता चलता है. (*) के मार्क अस्वीकृति के कारण नहीं संदंश.
चित्रा 2. Gp96 Xenopus में ट्यूमर प्रतिजनों के पार प्रस्तुति की सुविधा एलजी-15 Pls (5 x 10 5). थे APBS (नकारात्मक नियंत्रण), 1 gp96 पुनः संयोजक के μg एक ई. से शुद्ध के साथ बर्फ पर 1 घंटे के लिए या तो स्पंदित Gp96 के कोलि संस्कृति, या 1 या 0.5 μg 15 / 0 ट्यूमर ऊतक से शुद्ध. 3 washes के बाद, कक्षों adoptively एलजी-15 वयस्क प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित कर दिया गया (1 x 6 व्यक्ति / 10). तीन दिन बाद, 15 / 0 ट्यूमर कोशिकाओं (5 x 10 5) रहते हैंसुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन द्वारा प्रतिरोपित. प्रत्येक वक्र में एक मेंढक में ट्यूमर के विकास के कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व करता है. दिन पोस्ट चुनौती जब ट्यूमर पहले दिखाई पर नजर रखी थे, और ट्यूमर का आकार एक नली का व्यास (लम्बाई चौड़ाई एक्स एक्स मोटाई) के साथ समय - समय पर निर्धारित किया गया था.
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Discussion
उभयचर Xenopus एक अद्वितीय बहुमुखी गैर स्तनधारी मॉडल के अध्ययन के लिए प्रतिरक्षा है . जैव चिकित्सा और प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुसंधान में इसका व्यापक उपयोग MHC परिभाषित एलजी-6 क्लोन और एलजी-15 के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिन्न सेल लाइनों और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में कई महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण में झुकेंगे. हम इन विट्रो में और vivo में assays में विभिन्न gp96 रूप में गर्मी झटका प्रोटीन की क्षमता को प्रबल एजी विशिष्ट विरोधी - मामूली एच एजी और विरोधी ट्यूमर टी सेल प्रतिक्रिया 7 मध्यस्थता अध्ययन की स्थापना की है इन उपकरणों का उपयोग करना. इस मॉडल प्रणाली हमें आगे प्रतिरक्षाविज्ञानी भड़काना और effector कोशिका चरणों के दौरान gp96 गुणों की जांच करने के लिए अनुमति देता है.
भड़काना चरण, इन प्रतिक्रियाओं उपचर्म प्रतिरक्षण gp96 शुद्ध के साथ प्रयोग किया जाता के प्रारंभिक अध्ययन है कि जैसे कलम बांधने का काम त्वचा या ट्यूमर प्रत्यारोपण 2, 8 vivo assays में पहले दो सप्ताह के अंतराल पर 10 gp96 μg के दो इंजेक्शन की आवश्यकता के संबंध में. इसकी तुलना में, विधि पार प्रस्तुति हम 7 विकसित किया है और वर्तमान में उपयोग कर रहे हैं और अधिक सुविधाजनक और कुशल है. इस भड़काना रणनीति के कई फायदे समय और प्रोटीन की मात्रा एक प्रयोग के लिए आवश्यक शामिल हैं. उदाहरण के लिए आदेश में यह 4 हफ्तों और gp96 के 20 μg लेता है, जबकि पी एल भड़काना के साथ हम केवल 3 दिन और प्रोटीन के 0.5 से 1 μg की जरूरत है एक जानवर छुटकारा. इसके अलावा वहाँ कम परिवर्तनशीलता है क्योंकि भड़काना gp96 के साथ स्पंदित pls के केवल एक इंजेक्शन के होते हैं. यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि अगर सुई सुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन, प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अंश द्वारा टीकाकरण के दौरान बाहर निकाला जाता है इसलिए अधिक से अधिक व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के कारण भी जल्दी खो दिया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, इस पार प्रस्तुति परख gp96 की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र की जांच करने के लिए आगे के लिए रास्ता प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, हम भी gp96 के साथ स्पंदन gp96 मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और टी सेल भड़काना में उनकी भूमिका की जांच पहले Pls की सतह पर ऐसे वर्ग आइए के रूप में कुछ अणुओं की अभिव्यक्ति न्यूनाधिक कर सकते हैं. gp96 internalization की प्रक्रिया भी एंटीबॉडी या 7 endocytic रिसेप्टर्स के साथ हस्तक्षेप प्रतियोगियों के साथ पूर्व incubating Pls द्वारा अध्ययन किया जा सकता है.
Effector चरण के संबंध में, Xenopus मॉडल केवल इन विट्रो में प्रवाह cytometry, हत्या और प्रसार 8 assays, 9 द्वारा प्रतिरक्षा सेल effectors विशेषताएँ उपयुक्त नहीं है, लेकिन यह भी मामूली एच एजी असमान त्वचा कलम बांधने का काम और ट्यूमर जैसे vivo assays में शक्तिशाली प्रदान करता है प्रत्यारोपण assays. इन दोनों assays के Xenopus मॉडल में अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं लेकिन वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि पालन किया जाना चाहिए रहे हैं. त्वचा कलम बांधने का काम परख विशेष ध्यान में उदाहरण के लिए जब भ्रष्टाचार से निपटने खासकर जब overlaying मेजबान त्वचा की खिड़की काटने भुगतान किया जाना चाहिए. खिड़की करने के लिए भ्रष्टाचार ही तो यह है कि भ्रष्टाचार से बाहर नहीं गिर जाएगी की तुलना में थोड़ा छोटा हो गया है. इसके अलावा, ट्यूमर प्रत्यारोपण के दौरान यह महत्वपूर्ण है पहले नियंत्रण खत्म करने की तुलना में प्रयोगात्मक और नियंत्रण मेंढक की दूसरी छमाही के साथ लोगों द्वारा पीछा किया पशुओं के आधे इंजेक्षन. इससे यह सुनिश्चित होगा कि ट्यूमर इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान आर्थिक रूप से व्यावहारिक है और अधिक संगत डेटा का उत्पादन होगा. तथ्य यह है कि इस मॉडल प्रणाली क्लोन जानवरों पर निर्भर करता है और effector दत्तक सेल 10 हस्तांतरण का उपयोग hsps द्वारा प्रेरित कोशिकाओं के अध्ययन का विस्तार करने की अनुमति देता है.
सारांश में, तरीकों को यहाँ प्रस्तुत एक असाधारण मॉडल गैर स्तनधारी प्रणाली प्रतिरक्षा निगरानी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में gp96 भूमिका जैसे hsps के अध्ययन के रूप में मेंढक Xenopus पर प्रकाश डाला.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
विशेषज्ञ पशु पालन टीना मार्टिन और डेविड अलब्राइट द्वारा प्रदान की कृतज्ञता की सराहना की है. इस शोध T32 - ऐ - 07,285 (हेमवती) अनुदान, एनआईएच R25 2GM064133 (टीसीएल), NIH से 1R03-HD061671-01, R24 - ऐ - ०,५९,८३०-06 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents needed: | |||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | |||
| NaCl, 1.15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | |||
| Iscove DMEM basal medium | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Non-essential amino acids | |||
| Penicillin-streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-mercapt–thanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% double distilled water | |||
| 5% featal bovine serum | |||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | |||
| 0.25% of normal Xenopus serum | |||
| Materials and Equipment: | |||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | |||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | |||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon BD | ||
| Razor blades | |||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | ||
| 10 cm glass petri dishes | |||
| 9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR international | ||
| Tygon tubing | |||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios calipers | |||
| Dissecting microscope | |||
| High intensity illuminator | |||
| Hemacytometer | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| Centrifuge |
References
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