Summary
青蛙
Abstract
我们已经开发的两栖类爪蟾蟾一个独特的非哺乳动物模型来研究在一定的热休克蛋白（HSP的）的能力，如GP96，以方便陪护抗原交叉呈现，引起先天免疫和适应性的T细胞反应。爪蟾的皮 肤移植排斥反应研究的GP96引出经典MHC Ia类（Ia类）的有限制的T细胞反应的能力提供了一个极好的平台。此外， 非洲爪蟾模型系统还提供了一个有吸引力的替代小鼠探索的GP96反应生成对肿瘤有下调他们的Ia类分子，从而逃避免疫监视的能力。最近，我们开发了一种使用腹腔白细胞抗原提呈细胞（APCs）在爪蟾克隆收养细胞转移实验，并表明，GP96可以首相CD8 + T细胞在体内对未成年人的组织相容性皮肤抗原， 以及对非洲爪蟾胸腺肿瘤15反应/ 0，这并不表示Ia类分子。我们在这里描述，涉及到执行这些包括腹腔白细胞的启发，脉冲和收养的转移，以及皮肤移植和肿瘤移植实验的实验方法。此外，我们还描述的收获外周血白细胞使用流式细胞仪和增殖实验皮肤排斥和抗肿瘤反应的效应人口的进一步鉴定和分离。
Protocol
1。动物
非洲爪蟾祥煦gilli杂交LG - 6和LG - 15 isogenetic克隆是从我们的繁殖地在罗切斯特大学（http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm） 。 LG - 6和LG - 15的份额相同的杂合的MHC单倍型（A / C），但不同的次要组织相容性位点（H）。从这些克隆后代，是由雌核发育，女性所产生的二倍体卵子是由紫外线照射精子（无DNA的贡献后代）被激活。
使用手套兼。有些人喜欢不穿，因为它是更难处理的青蛙（滑），实际上它似乎使青蛙不舒服。
2。纯化的GP96 15 / 0肿瘤（对两种肿瘤和次要的H - AGS）
GP96净化先前已经描述2，3。简单地说，GP96是50-70％硫酸铵盐析，由ConA琼脂糖凝胶层析和DEAE纯化。蛋白质约20-50微克，可每1毫升的肿瘤组织。该制剂的纯度是由SDS - PAGE电泳和银染。
3。从轻微的H - AG -不同的LG - 6青蛙腹腔白细胞（PLS）的启发和收获
- 长出了25毫升的隔夜大肠杆菌大肠杆菌文化在50 mL锥形管在37℃用颤抖的彗星。
- 第二天，加热煮沸1小时杀死细菌。
- 离心杀害大肠杆菌热大肠杆菌为2,000 RPM（1500克）在4 ° C 15分钟
- 去除上清，重悬细菌沉淀在1 / 10的原始文化在APBS量（2.5毫升） 。此时细菌培养就可以使用了，必须在24小时内使用。
- 注入腹腔（IP）200（2英寸青蛙）或300μL（3英寸青蛙）的热量杀死细菌每青蛙准备使用25号5 / 8针。
- 3天注射后PLS收获腹腔灌洗。
- PL收获之前，成年青蛙tricaine甲烷磺酸钠碳酸氢钠缓冲长达5分钟，MS - 222（TMS）在0.1％水溶液浸泡麻醉停止，直到所有的运动（持续时间的大小和年龄而定）。动物治疗后10-20分钟内醒来。
- 用少量70％乙醇消毒青蛙腹部。
- 注入5毫升（2英寸青蛙）或10毫升（3英寸青蛙），在室温下预热使用一个18针1个半针进入腹膜腔的无菌APBS。取出针，轻轻按摩一分钟，以保证注入的缓冲区，体腔液达到平衡的青蛙。
- 没有收集腹腔液针背面滴水成一个干净的50 mL锥形管的注射器，使用一个新的18针1个半针。确保检索尽可能多的初始注入量。要小心，以避免在中部地区的腹部地区的血管。
- PLS是收获后在浅水的容器中放青蛙，直到它是清醒的，此时它可以被放置在笼子里。
4。 LG - 6 PLS朴素LG - 6收件人脉冲和过继转移
- PLS一次洗净冷APBS和离心机在1000转（750克），在4 ° C 10分钟
- 去除上清，重悬在APBS PLS。
- 在浓度为1微克每5 × 10 5 PLS GP96与GP96脉冲PLS。
- 一旦添加适量的GP96的PLS，混合pipeting和冰上孵育1小时。
- 在1000转10分钟在4 ° C或1分钟14000转离心细胞，以消除任何未绑定的GP96。
- 洗净的薪酬水平调查，以确保没有残留的GP96左边用冷水APBS 3X。
- 重悬浓度在5 × 10 5每300μL的PLS脉冲PLS 。
- 过继转移PLS IP使用25计5 / 8针的注射。注入300μL的动物（5 × 10 5细胞）脉冲PLS 。
- 青蛙必须要植皮或肿瘤的挑战实验持续至少3天前催芽。
5。皮肤移植实验
皮肤移植排斥反应是在4，5，6 爪以及建立检测。在非洲爪蟾 ，收件人拒绝接受捐助者在21日至22日在18-22天的皮肤显示1或2 MHC单体型不匹配° C。相比之下，LG - 6和LG - 15只有轻微的H - AGS不同的克隆之间的皮肤移植将被拒绝更慢（30天）。然而，这种拒绝是加快受助THAT有催芽对未成年人的H - AGS捐助由以前的皮肤移植或从捐赠者的免疫纯化与GP96。根本没有排斥反应发生时，捐助者和接受者是基因完全相同的（例如，克隆或完全近交系动物）。因此，这个简单的技术特征GP96引起体内的免疫反应是非常强大的。
- 麻醉捐助青蛙，如3.7中所述。
注：只有最小的预防措施，需要采取以来爪生产总无菌程序需要在皮肤上，省却了强有力的抗微生物肽（例如，magainin）。事实上，治疗青蛙与任何消毒剂对皮肤不利。此外， 非洲爪蟾没有任何可以转移到人类病原体。因此，手套的使用是可选的。然而，所有的夹层法器需要进行高压灭菌，所有的解决方案必须是无菌的。 - 剪切和删除的小（20毫米× 5毫米）腹侧皮肤一块从一台LG - 15捐款使用剪刀的青蛙（由于存在的irridophore色素细胞，银色的腹部皮肤出现）。
- 放置在一个Petridish APBS的皮肤和保持它在冰上。操纵的皮肤组织非常轻柔，避免控股钳之间。
- 使用剃刀或剪刀个别移植切成5毫米× 5毫米件。保持在上冰APBS的碎片。
- 此时捐助青蛙是放置在浅水的容器中，直到它是清醒的，然后它被置于含有抗生素（浓度为5毫克/升Penstrep）的水。青蛙保存在两天此时它是在正常的水返回水用抗生素。在皮肤被删除的网站的小伤口并不需要缝合和在一个星期内愈合。
- 麻醉收件人LG - 6青蛙。
- 收件人的皮肤上背（背部）的一个小切口插入5毫米× 5毫米的皮肤下移植与银色的方。要小心，不要引进皮肤下的大气泡，因为这可能会导致流离失所，甚至移植的损失。
- 确保您注意移植的剪刀和镊子的标记，因为这些都不是移植排斥反应的得分开始算一次。
- 24小时后的叠加主机皮肤的一部分需要从嫁接。
- 麻醉收件人LG - 6青蛙。处理如5.1中所述的动物。
- 使用高压灭菌剪刀剪出一个窗口，让周围嫁接的嫁接可以自由显示。小心不要触摸捐助者的皮肤或诱发出血。让我们在5.5中所述的青蛙恢复。
- 马上开始得分嫁接草图。皮肤移植排斥反应是由嫁接皮肤销毁irridophores％。
- 移植需要进行检查，每2-3天，但不需要这个麻醉的动物。为了形象化的移植，青蛙必须在petridish放置在解剖显微镜下。
6。全安装移植皮肤的免疫组化
青蛙全挂载免疫组先前已描述6。简单地说，青蛙是麻醉，在显微镜下放在一个无菌纸预湿毛巾与青蛙的水（无菌准备工作区域也）。连同少量的周围宿主皮肤移植的皮肤，然后收获，同样是与抗体染色细胞染色流式细胞仪分析 6 。需要使用蒸压文书和无菌缓冲区。染色后的皮肤是放在载玻片和盖玻片轻轻按下。此时的皮肤可以使用不同的细胞，已经渗透到移植物的种群荧光显微镜可视化。手术后的青蛙是用抗生素，如5.5节所述，在水中保持。并返回正常用水。小伤口，皮肤被删除，在一周内痊愈。
7。血白细胞的表征
- 从青蛙的血之前，需要准备拉火焰无菌巴斯德移液器的“玻璃针”。罚款移液器端削尖的体视显微镜下。然后连接到移液器吸塑料管。
所有仪器，如镊子和剪刀需要使用前必须高压灭菌。 - 还准备增加50个单位，每1毫升的APBS肝素冰冷APBS和肝素溶液10毫升。置于冰上的解决方案。使用所有的解决方案必须是无菌的。
- 麻醉青蛙，如3.7中所述，并遵循相同的动物如5.1中所述的程序处理。 。
- 切割后足以上的皮肤暴露跗背静脉。
- 巴斯德吸管填写APBS +肝素液1-2毫升。
- “玻璃针”插入静脉，慢慢用口吸气，开始收集血液。重要的是有“玻璃针”APBS +肝素的解决方案，因为这将防止血液凝血和堵塞针尖。
- 1至2毫升血液可从一个平均大小的青蛙。
- 青蛙的腿的小切口并不需要缝合伤口愈合一周内。
- 在10分钟1000转离心血液在4 ° C。
- 去除上清，洗细胞10毫升冷APBS 1X。
- 覆盖2毫升血液（1-5 × 10 6细胞）到1毫升Histopaque 1.077的聚蔗糖（Sigma公司），在室温下预热，以单独的血白细胞，红细胞。
- 在室温下在1000 RPM没有刹车离心20分钟，然后收集白细胞乐队。
- 洗净在1400转的细胞与APBS 2X离心10分钟，4 ° C至去除残留的聚蔗糖。
- 此时细胞准备与流式细胞仪分析抗体染色，或在体外培养实验。
8。肿瘤移植含量
- 大约一个星期前出一批新的15 / 0肿瘤细胞，并确保这些细胞开始生长良好的实验解冻。在下一节和3更详细的培养基是简洁的描述。
- 展开15 / 0肿瘤细胞。
- 在实验的当天，细胞计数和台盼蓝拒确定细胞死亡。细胞死亡，应小于5％。洗在1000转冷APBS 1X细胞，并在4 ° C离心10分钟。
- 在肿瘤的培养基重悬细胞密度5 × 10 5月 15日/ 0细胞每300μL。
- 移植5 × 10 5细胞300μL每青蛙数量皮下背侧（背面）的动物的一侧使用25号5 / 8针的注射。
- 肿瘤的生长，将开始在2-3周后肿瘤的挑战。必须指出最初的肿瘤外观和肿瘤体积需要记录每2-3天。用游标卡尺测量肿瘤体积（高X长X宽）。
- 一旦肿瘤生长到3500毫米3或青蛙开始寻找昏昏欲睡，它需要被安乐死，以防止不适。
9。试剂所需：
- 两栖磷酸盐缓冲液（APBS）：6.6 g / L的氯化钠，1.15 g / L的钠2 HPO 4，0.2 g / L的KH 2 PO。 pH值至7.5使用10N氢氧化钠和过滤器消毒过滤到0.2微米。
- Tricaine甲烷磺酸（TMS，MS - 222）（红新月化学研究CAS＃886-86-2）。
- 碳酸氢钠（尔科技的S - 233 - 500）。
- Histopaque - 1077（Sigma - Aldrich公司10771-100毫升）
- 肝素钠盐（Sigma - Aldrich公司的H3149 - 50KU）
- 爪 15 / 0肿瘤的培养基[更多详情参见3]：1 L的10 mL胰岛素，10毫升的非必需氨基酸，10毫升的青霉素，链霉素10微克Iscove DMEM培养基（GIBCO Invitrogen公司11965） / mL的卡那霉素3毫升primatone（谢菲尔德产品事业部），β2-巯基乙醇1毫升，3.02克碳酸氢钠在水中（pH值7.0）。这种介质是通过添加30％的双蒸水稀释至两栖动物渗透压，并辅以5％小牛血清，20％， 从非洲爪蟾肾脏细胞株A6 superantant，和0.25％的正常爪蟾血清。
10。代表性的成果
图1。Stereomicroscopic分析皮肤移植排斥反应的移植后12天。 LG - 6克隆青蛙（一）MHC相同的LG - 6植皮，（无排斥反应）或（B）一个MHC不同的远交捐助者（80％抑制）。箭头显示银色iridophore标志着健康（非拒绝）嫁接组织的色素细胞。 （*）标记的镊子不因拒绝。
图2。 GP96有利于肿瘤抗原的交叉呈现在爪蟾 。脉冲为1小时上冰APBS（阴性对照），1微克一个大肠杆菌纯化重组GP96 LG - 15 PLS（5 × 10 5 ）从15 / 0肿瘤组织纯化大肠杆菌文化，或1或0.5微克的GP96。 3洗涤后，细胞过继转移到LG - 15的成年受助人（1 × 10 6 /个人） 。三天后，现场15 / 0肿瘤细胞（5 × 10 5）通过皮下注射移植。每条曲线代表肿瘤的生长在一个青蛙的动力学。天挑战，当肿瘤最早出现的监测，并定期用卡尺（长x宽x厚）被确定肿瘤的大小。
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Discussion
两栖类爪蟾是一个独特的多功能非哺乳动物模型来研究的免疫力。已经取得了许多重要的研究工具，如MHC的定义克隆LG - 6和LG - 15以及不同的细胞系和单克隆抗体及其在生物医学和免疫学研究中的广泛使用。使用这些工具，我们已经建立了在体外和体内实验研究热休克蛋白GP96如的能力，调解有力银特定抗轻微的H - Ag和抗肿瘤的T细胞反应。这个模型系统，我们可以进一步探讨在吸效应细胞阶段的GP96的免疫学特性。
关于吸的阶段，用纯化的GP96这些皮下免疫反应的初步研究，要求在两个星期前植皮或肿瘤移植2，8， 如体内检测间隔注射10微克GP96 。相比较而言，我们已经开发了 7和目前正在使用的方法是交叉呈现更加便捷，高效。这一吸战略的多重优势，包括时间和每次实验所需的蛋白质的量。例如为了进行免疫接种的动物，它需要4周和20微克GP96，而与PL吸，我们只需要3天，蛋白质0.5至1微克。此外，还有少的多变性，因为吸只有一个注射用GP96脉冲PLS组成。这是关键的一步，因为如果针被拉出在皮下注射，相当一部分的蛋白质免疫过快可能会丢失，因此造成了较大的个体差异。更重要的是，这种跨演示实验提供了一种GP96 -介导的免疫反应的机制，以进一步调查。举例来说，我们还可以调节的PLS脉冲与GP96调查GP96介导的免疫反应和T细胞吸他们的作用之前，表面上的某些分子，如Ia类的表达。 GP96内化的过程也可以研究与抗体或竞争对手的干扰与内吞受体 7预孵化PLS 。
爪蟾模型效应阶段，不仅适合表征体外免疫细胞的效应，流式细胞仪，杀戮和增殖实验8，9，但还提供了强大的体内实验，如轻微的H - AG -不同植皮和肿瘤移植实验。这些实验都建立在爪蟾模型，但有一个必须遵循的几个关键步骤。举例来说，在皮肤移植实验特别注意处理的移植，尤其是切割时覆盖宿主皮肤的窗口时，必须支付。窗口已略比移植，使移植物不会掉馅饼。此外，在肿瘤移植重要的是先注入比完成的实验和控制青蛙下半年的控制动物的一半。这将确保肿瘤是可行的，在注射过程中，会产生更一致的数据。事实上，这个模型系统依赖于克隆动物还可以延长使用收养细胞转移10 HSPS刺激的效应细胞的研究。
总之，这里所提出的方法，突出作为一个特殊的非哺乳动物模型系统研究热休克蛋白GP96在免疫监视和免疫反应的作用等的蛙爪。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
蒂娜马丁和大卫奥尔布赖特提供的专家畜牧业衷心赞赏。这项研究得到了补助的T32 - AI - 07285（HN），美国国立卫生研究院R25 2GM064133（TCL），1R03 HD061671 - 01，R24 - AI - 059830 - 06由美国国立卫生研究院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents needed: | |||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | |||
| NaCl, 1.15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | |||
| Iscove DMEM basal medium | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Non-essential amino acids | |||
| Penicillin-streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-mercapt–thanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% double distilled water | |||
| 5% featal bovine serum | |||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | |||
| 0.25% of normal Xenopus serum | |||
| Materials and Equipment: | |||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | |||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | |||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon BD | ||
| Razor blades | |||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | ||
| 10 cm glass petri dishes | |||
| 9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR international | ||
| Tygon tubing | |||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios calipers | |||
| Dissecting microscope | |||
| High intensity illuminator | |||
| Hemacytometer | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| Centrifuge |
References
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