Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Summary

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.

Abstract

Zebravis is een populair diermodel voor onderzoek op het oog ontwikkeling als gevolg van de snelle

Protocol

Deel 1: Voorbereidingen voor het microdissectie

1. Oplossingen
   1. E3 medium ⁴ (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂ en 0,33 mM MgSO _4).
   2. Ringer-oplossing ^{1, 5} (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH7.2), filter gesteriliseerd.
   3. 5N NaOH.
2. Chemisch etsen van wolfraam naalden
   1. Secure een klein bekerglas met 5N NaOH op een petrischaaltje met klei.
   2. Bevestig een paperclip aan de kant van de beker, zodat het in contact komt met de NaOH-oplossing.
   3. Sluit de negatieve elektrode van een DC-voeding naar de paperclip en de positieve elektrode op een uiteinde van een kort stukje (~ 2 cm) van wolfraam draad.
   4. Wikkel het andere uiteinde van wolfraam draad met een klein balletje klei en duik dit uiteinde in de NaOH-oplossing.
   5. Verhoog de spanning tot ongeveer 3V en dompel de draad op en neer in de NaOH-oplossing tot een goede ets tarief is bereikt. Een naald in goede kwaliteit kan meestal worden geëtst in 10 minuten.
   6. De wolfraam draad blootgesteld aan de oplossing zal geleidelijk dunner. Als de klei bal daalt, zal de andere kant van de draad die nog aan de positieve elektrode hebben een scherpe naald vorm.
   7. Spoel de scherpe naald met Ringer's of E3 om zout afzettingen te verwijderen.
   8. Bevestig de naald op een houten applicator met tape of een naald houder voor gemakkelijk gebruik.
3. Kweekplaten
   1. De Falcon 60 x 15 mm polystyreen cultuur platen zijn klaar om te gebruiken voor het netvlies microdissectie.
   2. Voor het ontleden van RPE-aangesloten netvlies, volledig verpletteren twee embryo's in een cultuur plaat met Ringer's oplossing om zich te ontdoen van de kleverigheid van het oppervlak van 30 minuten voor dissectie. Kort voor dissectie, uitgebreid wassen van de plaat met verse Ringer's oplossing.
4. Embryo's verzamelen en staging
   1. Volwassen zebravissen worden onderhouden, zoals beschreven ^{4, 5.}
   2. Scheid de ouder vis in statische kweken tanks paarsgewijze door een scheidingswand de avond voor de fokkerij.
   3. Verwijder de verdeler na de kamer licht wordt ingeschakeld in de volgende ochtend. Laat de ouders om cross op 10-minuut intervallen van elk half uur. Scheiden de vissen na elke kruising.
   4. Apart te houden van de embryo's van elke kruising in E3-medium bij 28 ° C.
   5. Stage embryo's bij 10 tot 12 uur na de bevruchting (HPF) en de nieuwe tijdelijke onmiddellijk vóór versnijding op de specifieke tijdstippen, volgens vastgestelde criteria ^{1, 6.}

Deel 2: Dissection - de hersenen verwijderen en blootstelling van de ogen ^een

• De procedures beschreven in dit gedeelte zijn gemeenschappelijk voor het ontleden van het netvlies (deel 3A) en RPE-aangesloten netvlies (deel 3B).
• Alle fijne dissecties worden gedaan door een tip van de Dumont pincet en bijgestaan ​​door een ander paar Dumont forceps voor het positioneren van het weefsel. Een chemisch geëtst wolfraam naald kan worden gebruikt voor het fijnere manipulaties indien nodig.
• Alle fijne ontledingen worden uitgevoerd op ~ 5-8x vergroting onder een microscoop SZX16 Olympus uitgerust met een 1X objectief of gelijkwaardig.
• Behouden de embryo's in E3 medium in een bench top incubator bij 28 ° C naast de microscoop voor gemakkelijke toegang tot embryo tijdens de dissectie.
• De microscoop stadium is opgewarmd tot 28 ° C door een thermo plaat aan de invloed van temperatuur schommelingen op genexpressie te minimaliseren.

1. Overdracht een embryo bij een bepaalde ontwikkelingsfase naar de Ringer-oplossing in een Falcon 60 X 15 mm cultuur plaat bereid zoals beschreven in deel 1 # 3.
2. Snijd het hoofd met een deel van de voorste romp al snel uit het lichaam.
3. Pin het achterste einde van dit weefsel op de cultuur plaat met de assisterende tang.
4. Open het hoofd op de dorsale zijde vanaf de voorste voorhoofd.
5. Verwijder de hersenen, zodat de mediale zijde van de ogen is blootgesteld en is naar boven gericht voor verdere manipulaties.

Deel 3A: het netvlies dissectie ^een

1. Bereid de embryo, zoals beschreven in deel 2.
2. Voorzichtig borstel de blootgestelde RPE aan de mediale zijde van het oog bal die naar boven wordt geconfronteerd met de punt van de tang tot een kleine opening aan het netvlies wordt gezien.
3. Ga verder met de poetsen en peeling actie tot aan de mediale zijde van het netvlies is bijna alle blootgesteld. Voorkom dat er krassen en ponsen de blootgestelde netvlies.
4. Aan de laterale RPE te verwijderen op het netvlies die nu naar beneden is gericht, dat de aanpak en de borstel onder een hoek van ongeveer 45 ° ten opzichte van de cultuur plaatoppervlak.
5. Verwijder de RPE dat is relatief stevig aan de ora serrata bevestigd door pinnen de vrijstaande gedeelte van de RPE op de cCULTUUR plaat voor dissectie, en til het netvlies zachtjes.
6. Rol het netvlies aan de onderkant van de cultuur schotel naar de sanering van de resterende RPE.
   1. We hebben gemerkt dat deze specifieke Falcon polystyreen cultuur plaat een preferentiële hechting van RPE voor ongeveer 20 minuten heeft eens een embryo wordt verpletterd. Deze eigenschap wordt gebruikt voor het verwijderen van de RPE overblijfselen. Echter, de retinale cellen kleven aan het oppervlak, in mindere mate, die nauw kan worden ingezien onder hoge vergroting. Men moet een evenwicht vinden tussen de volledigheid van de RPE verwijderen en het netvlies integriteit.
   2. De lens houdt zich vaak tot de cultuur plaat en los van het netvlies bij het walsen verkregen. Af en toe, is het noodzakelijk om de lens los te koppelen van een geëtst wolfraam naald met een wervelende actie op het lensoppervlak.
7. Deze procedures kunnen succesvol te verwijderen RPE van het netvlies, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van het weefsel. Dit wordt aangegeven door een goede algemene morfologie (Figuur 1B en B ') en histologie (Figuur 1B "), pijl in het bijzonder, het behoud van de extracellulaire matrix in tussen de afdrukband laag en de RPE is uitzonderlijk goed (Figuur 1B."; vergelijken met de histologie van het hele embryo (Figuur 1A ")).

Deel 3B: RPE-aangesloten netvlies dissectie ³

1. Bereid de embryo, zoals beschreven in deel 2.
2. Pin het hoofd naar de cultuur plaat door de assistent tang. Til de ogen van de achterste laterale zijde en rol aan de voorste zijde.
   1. De vermoedelijke vaatvlies en sclerale weefsel aan de buitenkant van de RPE-laag zijn relatief stevig bevestigd aan de huid en kan meestal worden afgepeld door rollen de ogen voorzichtig naar de anterieure zijde.
3. Haal de lens met een wolfraam naald na de laterale zijde van het oog wordt blootgesteld en wanneer het oog is nog aan de huid.
4. Deze procedures met succes kan het behoud van de hele RPE laag met het netvlies. Vermoedelijke choroids en sclerale weefsel kan grotendeels worden verwijderd (figuur 1C, C 'en C ").

Deel 4: Tissue monstername voor RNA werk

1. De ontlede monsters kunnen worden verzameld in TRIzol in een RNase-vrij microfugebuis voor downstream-RNA karakterisering zoals eerder ^{beschreven: 1.}

Representatieve resultaten

Figuur 1. (A) en laterale (A ') dorsaal aanzicht van een zebravis larvale head op 52 hpf voor dissectie. (A ") De overeenkomstige histologische deel van de larvale hoofd in (A) & (A '). (B) Laterale en (B'), dorsaal aanzicht van een ontleed netvlies bij 54 hpf. Het oppervlak van het netvlies intact was van beide laterale en dorsale uitzicht. (B ') De overeenkomstige histologische deel van het netvlies ontleed in (B) & (B'). De structuur van het netvlies en retina lamineren was intact. In het bijzonder, de extracellulaire matrix tussen de fotoreceptor laag en RPE (A "was, pijlen) goed bewaard gebleven in de ontleed netvlies (B", pijlen). (C) laterale en (C ') mediaal aanzicht van een ontleed RPE-aangesloten netvlies op 52 hpf. RPE laag was intact en continu, die ook werd aangegeven door de histologische deel van de ontlede weefsel (C "). Het witte vlak in C 'is de oogzenuw (pijl). Voor histologie, weefselmonsters werden verzameld en gefixeerd in 4% paraformaldehyde. Plastic inbedding en snijden van deze monsters werden uitgevoerd zoals beschreven ^3. Schaal bar = 50 pm.

Discussion

Microdissectie van de zebravis oogweefsels effectief kan krijgen intact netvlies en de RPE-aangesloten netvlies. Dit helpt aanzienlijk expressie studies met betrekking tot een specifieke oogweefsel (dat wil zeggen het netvlies of RPE). In feite hebben we met succes gebruik gemaakt van deze procedures om RNA-expressie profielen te verkrijgen van de hele retina ¹ en RPE ^3. Het nut van deze profielen wordt sterk ondersteund door onze recente identificatie van paden en gen-families die worden verstoord in een netvlies differentiatie mutant ^2. De meest kritische stappen in de retina dissectie procedures zijn het borstelen het optreden van de tip van de pincet en weefsel rollen voor de RPE restanten te verwijderen. We vinden waardoor de ellebogen op de verstelbare armleuningen in een stoel tijdens de dissectie aanzienlijk kan het stabiliseren van de ongewenste handbewegingen. Ook kunnen sommige RPE restanten blijven in de ora serrata. Dit is omdat deze regio kan niet in contact komen met de hechtende oppervlak van de cultuur plaat voor dissectie. Toch zijn de meeste RPE cellen verstoord tijdens het poetsen en peeling actie en deze RPE overblijfselen zijn waarschijnlijk niet intact. Ook moet een evenwicht worden gevonden tussen het netvlies integriteit en de volledigheid van de RPE verwijdering. Voor het ontleden van RPE-aangesloten netvlies, de meeste van de vermoedelijke vaatvlies en sclerale weefsels die er uitzien als een dunne transparante membraan, kan worden afgepeld, samen met de huid. Het is ook mogelijk om deze resten te verwijderen door borstelen het oppervlak van het weefsel, moet echter een evenwicht worden gevonden tussen de RPE integriteit en de volledigheid van verontreinigende weefsel verwijderd. We hebben met succes uitgevoerd dissectie 1-3 DPF (24 tot 72 HPF), die de kritieke fasen van de zebravis oog morfogenese ⁷ te dekken. Gemiddeld duurt het ongeveer 10 tot 20 minuten van het hoofd verbreken om de collectie van het ontleed weefsels. Met de praktijk, kan een student een goede en consistente dissectie uit te voeren binnen een maand.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.