Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Summary

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Abstract

Peixe-zebra é um modelo animal popular para a pesquisa sobre o desenvolvimento do olho por causa de sua rápida

Protocol

Parte 1: Preparativos antes microdissecção

1. Soluções
   1. E3 média ⁴ (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂ e 0,33 mM MgSO _4).
   2. Solução de Ringer com ^{1, 5} (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH7.2), esterilizado por filtração.
   3. 5N NaOH.
2. Ataque químico de agulhas de tungstênio
   1. Garantir um pequeno copo contendo NaOH 5N sobre uma placa de Petri por argila.
   2. Anexar um clipe de papel no lado do copo, para que ele entra em contato com a solução de NaOH.
   3. Conecte o eletrodo negativo de uma fonte de alimentação DC para o clipe de papel eo eletrodo positivo para uma extremidade de uma peça curta (~ 2 cm) de fio de tungstênio.
   4. Enrole a outra ponta do fio de tungstênio com uma bola de barro e mergulhe esse fim na solução de NaOH.
   5. Aumentar a tensão para cerca de 3V e mergulhe o fio para cima e para baixo na solução de NaOH até uma taxa de ataque bom é atingido. Uma agulha de boa qualidade geralmente pode ser gravado em 10 minutos.
   6. O fio de tungstênio expostos à solução se tornará gradualmente mais fino. Quando a bola de barro cai, o outro lado do fio que ainda está ligado ao eletrodo positivo terá uma forma agulha fina.
   7. Lavar a agulha fina com solução de Ringer ou E3 para remover os depósitos de sal.
   8. Coloque a agulha para um aplicador de madeira por fita ou um suporte de agulha para fácil manuseio.
3. Placas de cultura
   1. O Falcon 60 x 15 mm placas de cultura de poliestireno está pronto para uso para microdissecção da retina.
   2. Para dissecar RPE ligado à retina, esmagar dois embriões completamente em uma placa de cultura contendo solução de Ringer para se livrar da adesividade da superfície de 30 minutos antes da dissecção. Pouco antes de dissecação, lavar a placa com solução de Ringer extensivamente fresco é.
4. Embriões de coleta e preparo
   1. Peixe-zebra adulto são mantidas como descrito ^{4, 5.}
   2. Separar os peixes do pai em tanques de criação estática pairwise por um divisor na noite anterior de reprodução.
   3. Remover o divisor após a luz da sala está ligada na manhã seguinte. Permitir que os pais a cruz em intervalos de 10 minutos a cada meia hora. Separar os peixes depois de cada cruzamento.
   4. Manter os embriões coletados de cada cruzamento em meio E3 separadamente a 28 ° C.
   5. Embriões em estágio de 10 a 12 horas após a fertilização (HPF) e resgatá imediatamente antes da dissecação nos pontos de tempo específico, de acordo com critérios estabelecidos ^{1, 6.}

Parte 2: Dissecção - remoção de cérebro e exposição do olho ¹

• Os procedimentos descritos nesta seção são comuns para dissecar retina (parte 3A) e RPE ligado à retina (Parte 3B).
• Todos dissecações fina são feitas por uma ponta da pinça Dumont e assistido por um outro par de fórceps Dumont para o posicionamento do tecido. Uma agulha de tungstênio quimicamente gravadas podem ser usadas para manipulações mais fino, se necessário.
• Todos dissecações finas são realizados em ampliação ~ 5-8x sob um microscópio Olympus SZX16 equipado com um objetivo 1X ou equivalente.
• Manter os embriões em meio E3 em uma bancada incubadora a 28 ° C ao lado do microscópio para o acesso fácil embrião durante a dissecção.
• O estágio do microscópio é aquecida a 28 ° C por uma placa térmica para minimizar a influência da flutuação da temperatura na expressão gênica.

1. Transferência de um embrião em um estágio específico do desenvolvimento de solução de Ringer em um Falcon 60 X 15 milímetros placa de cultura preparado como descrito na Parte 1 # 3.
2. Cortar a cabeça com a parte anterior do tronco rapidamente a partir do corpo.
3. Pinos na extremidade posterior deste tecido na placa de cultura com a pinça auxiliar.
4. Abra a cabeça no lado dorsal a partir da testa anterior.
5. Remover o cérebro de modo que o lado medial dos olhos está exposta e é voltada para cima para manipulações mais.

3A parte: dissecção da retina ¹

1. Prepare o embrião, como descrito na Parte 2.
2. Cuidadosamente a escova RPE expostos no lado medial do globo ocular que é voltada para cima pela ponta da pinça até que uma pequena abertura para a retina é visto.
3. Continue a escovação e peeling de ação até que o lado medial da retina é quase todo exposto. Evitar arranhões e socos na retina exposta.
4. Para remover o RPE lateral na retina que agora está voltado para baixo, a abordagem que e escova em um ângulo de aproximadamente 45 ° a partir da superfície da placa de cultura.
5. Remover o RPE que é anexado relativamente firmemente à ora serrata fixando a parte destacada do RPE ao cplaca ULTURA para dissecção, e levante a retina suavemente.
6. Rolar a retina no fundo do prato de cultura para limpar o RPE residual.
   1. Percebemos que neste particular Falcon placa de cultura de poliestireno tem uma aderência preferencial de RPE por aproximadamente 20 minutos uma vez que um embrião é esmagado. Esta propriedade é utilizada para a remoção de restos RPE. No entanto, as células da retina se ater à superfície, em menor grau, o que pode ser inspecionado de perto sob alta ampliação. Um tem que encontrar um equilíbrio entre a integralidade da remoção do RPE e integridade da retina.
   2. A lente geralmente adere à placa de cultura e se separa do retina durante o processo de laminação. Ocasionalmente, é necessário destacar a lente por uma agulha de tungstênio gravado com uma ação de roda na superfície da lente.
7. Estes procedimentos podem remover com êxito o EPR da retina sem comprometer a integridade do tecido. Isto é indicado por uma boa morfologia geral (Figura 1B e B ') e histologia (Figura 1B "), a flecha, em particular, a preservação da matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores ea RPE é excepcionalmente bom (Figura 1B."; comparar com a histologia do embrião inteiro (Figura 1A ")).

3B parte: RPE ligado à dissecção da retina ³

1. Prepare o embrião, como descrito na Parte 2.
2. Pin da cabeça até a placa de cultura pela forceps assistente. Levante os olhos suavemente do lado lateral posterior e rolar para o lado anterior.
   1. A coróide presuntivo e tecido escleral do lado de fora da camada de RPE estão ligados relativamente bem para a pele e pode ser na maior parte descascada rolando o olho com atenção para o lado anterior.
3. Remova a lente com uma agulha de tungstênio após a lateral do olho é exposta e quando o olho ainda está ligado à pele.
4. Estes procedimentos podem com sucesso preservar a camada RPE inteiro com a retina. Coróide presuntivo e tecido escleral pode ser em grande parte removido (Figura 1C, C 'e C ").

Parte 4: coleta de amostra de tecido para o trabalho RNA

1. As amostras dissecados podem ser coletados em TRIzol em um tubo de microcentrífuga RNase-free para jusante caracterização RNA como descrito anteriormente ^1.

Resultados representante

Figura 1. (A) e lateral (A) vista dorsal de uma cabeça de peixe-zebra larval em 52 hpf antes da dissecção. (A ") A seção correspondente histológica da cabeça larval em (A) e (A '). (B) e lateral (B) vista dorsal de uma retina dissecados aos 54 hpf. A superfície da retina estava intacto de ambos os laterais e vista dorsal. (B ") A seção correspondente histológica da retina dissecada em (B) e (B '). A estrutura da retina e laminação da retina estava intacto. Em particular, a matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores e EPR (A ", setas) foi bem preservada na retina dissecados (B", setas). (C) e Lateral (C ') vista medial de um dissecados retina RPE-anexado aos 52 hpf. RPE camada estava intacta e contínua, que também foi indicada pela secção histológica do tecido dissecado (C "). A área branca no C 'é o nervo óptico (seta). Para histologia, amostras de tecidos foram coletados e fixados em 4% paraformaldeído. plástico incorporação e secção das amostras foram realizados conforme descrito ^3. barra de escala = 50 mm.

Discussion

Microdissecção de tecidos oculares zebrafish pode efetivamente obter retinas intactas e RPE-anexado retinas. Este auxilia substancialmente estudos de expressão que pertencem a um tecido ocular específico (ie retina ou RPE). Na verdade, temos utilizado com sucesso destes procedimentos para obter perfis de expressão de RNA de toda a retina ¹ e RPE ^3. A utilidade destes perfis é fortemente apoiado pelos nossos recente identificação de vias e famílias de genes que são perturbados em uma diferenciação da retina mutante ^2. Os passos mais críticos nos procedimentos de dissecção da retina são a ação de escovar pela ponta da pinça e do tecido rolando para a remoção de restos RPE. Encontramos colocando os cotovelos no braço ajustável repousa em uma cadeira durante a dissecção pode substancialmente estabilizar os movimentos das mãos indesejadas. Além disso, alguns restos RPE podem permanecer na ora serrata. Isto porque a região não pode entrar em contato com a superfície aderente da placa de cultura para dissecção. No entanto, a maioria das células do EPR são interrompidos durante a ação de escovação e peeling e esses restos RPE é improvável que estar intacto. Além disso, um equilíbrio deve ser alcançado entre a integridade da retina e à integralidade da remoção do RPE. Para dissecar RPE-anexado retinas, a maioria dos coróide presuntivo e tecidos escleral que se parecem com uma fina membrana transparente, pode ser retirada juntamente com a pele. Também é possível remover esses restos, escovando a superfície do tecido, no entanto um equilíbrio também deve ser alcançado entre a integridade RPE ea integralidade de contaminar a remoção de tecido. Temos realizado com sucesso de dissecção dpf 1-3 (24-72 hpf), que cobrem as fases críticas do zebrafish morfogênese do olho ^7. Em média, demora cerca de 10 a 20 minutos a partir do rompimento cabeça para a coleta dos tecidos dissecados. Com a prática, um aluno pode realizar uma dissecção bom e consistente dentro de um mês.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.