Microdissection av Zebrafish Embryonala Eye vävnader

Summary

I artikeln beskrivs en metod för microdissect zebrafisk näthinnor med och utan pigmentepitelet bifogade, från en till tre dagar postfertilization embryon.

Abstract

Zebrafisk är en populär djurmodell för forskning om ögats utveckling på grund av dess snabba

Protocol

Del 1: Förberedelser innan microdissection

1. Lösningar
   1. E3 medelstora ⁴ (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂ och 0,33 mm MgSO _4).
   2. Ringers lösning ^{1, 5} (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mm HEPES, pH7.2), filter steriliserat.
   3. 5N NaOH.
2. Kemisk etsning av volfram nålar
   1. Säkert en liten bägare med 5 N NaOH på en petriskål med lera.
   2. Fäst ett gem på sidan av bägaren, så att det kommer i kontakt med NaOH-lösning.
   3. Anslut den negativa elektroden från en DC strömförsörjning till gemet och den positiva elektroden till ena änden av ett kort stycke (~ 2 cm) av volfram tråd.
   4. Vira den andra änden av volfram tråd med en liten lera boll och doppa den här änden i NaOH-lösningen.
   5. Öka spänningen till ca 3V och doppa tråden upp och ned i NaOH-lösning tills en bra etsning takt uppnås. En nål i bra kvalitet kan oftast etsad i 10 minuter.
   6. Den volfram tråden utsätts för lösningen blir gradvis tunnare. När leran bollen sjunker, kommer den andra sidan av kabeln som fortfarande är kopplad till den positiva elektroden har en vass nål form.
   7. Skölj vass nål med Ringers lösning och E3 att avlägsna saltavlagringar.
   8. Fäst nålen till en trä applikator med tejp eller en nål hållare för enkel hantering.
3. Odlingsplattor
   1. Falcon 60 x 15 mm polystyren odlingsplattor är redo att använda för retinal microdissection.
   2. För dissekera RPE-anslutna näthinnan, krossa två embryon helt i en kultur skylt som innehåller Ringers lösning för att bli av vidhäftning av ytan 30 minuter före dissekering. Strax före dissektion, tvätta plattan mycket med färska Ringers lösning.
4. Embryon insamling och iscensättning
   1. Vuxen zebrafisk upprätthålls enligt ^{4, 5.}
   2. Separera förälder fisken i statisk avel tankar parvisa med en avdelare kvällen innan avel.
   3. Ta bort divider efter rummets ljus är påslaget i nästa morgon. Låt föräldrarna ta sig över på 10-minuters mellanrum varje halvtimme. Separat fisken efter varje korsning.
   4. Bibehåll embryon som tas från varje korsning i E3 medelstora separat vid 28 ° C.
   5. Steg embryon vid 10 till 12 timmar efter befruktning (HPF) och restage omedelbart före dissektion vid specifika tidpunkter, enligt fastställda kriterierna ^{1, 6.}

Del 2: Dissection - hjärnan bortforsling och ögonen ¹

• De förfaranden som beskrivs i detta avsnitt är gemensamma för dissekera näthinnan (del 3A) och RPE-anslutna näthinnan (Del 3B).
• Alla fina dissektioner görs genom ett tips av Dumont pincett och bistås av ett annat par Dumont pincett för positionering vävnaden. Ett kemiskt etsade volfram nål kan användas för finare manipulationer vid behov.
• Alla fina dissektioner utförs vid ~ 5-8x förstoring i en Olympus SZX16 mikroskop utrustat med en 1X objektiv eller motsvarande.
• Behåll de embryon i E3 medium i en bänk inkubator vid 28 ° C bredvid mikroskop för enkel embryot åtkomst under dissektion.
• Mikroskopet steget värms till 28 ° C med en termo platta för att minimera inverkan av fluktuationer i temperatur på genuttryck.

1. Överför ett embryo till ett visst utvecklingsstadium till Ringers lösning i en Falcon 60 x 15 mm odlingsplatta bereds enligt anvisningarna i del 1 # 3.
2. Skär av huvudet med en del av den främre stammen snabbt från kroppen.
3. Nåla fast bakre slutet av denna vävnad kultur plattan med den assisterande pincett.
4. Öppna huvudet på ryggsidan med början från den främre pannan.
5. Ta bort hjärnan så att den mediala sidan av ögonen är utsatt och är vänd uppåt för ytterligare manipulationer.

Del 3A: Retinal dissektion ¹

1. Förbered embryot som beskrivs i del 2.
2. Försiktigt borsta utsätts RPE på den mediala sidan av ögat boll som är vänd uppåt, från toppen av pincetten tills en liten öppning på näthinnan ses.
3. Fortsätt att borsta och peeling åtgärder tills den mediala sidan av näthinnan är nästan alla exponerade. Undvik att repa och stansning den exponerade näthinnan.
4. För att ta bort den laterala RPE på näthinnan som nu är riktad nedåt, synsätt som och borste i en vinkel på ca 45 ° från den kultur plattan.
5. Ta bort RPE som sitter ganska fast vid ora serrata genom att nåla fast den avlägsnade delen av RPE till CKULTUR plåt för dissektion, och lyft sedan näthinnan försiktigt.
6. Rulla näthinnan på botten av den kultur maträtt att rensa upp i kvarvarande RPE.
   1. Vi har märkt att just denna Falcon polystyren odlingsplattan har framförallt anslutning av RPE i cirka 20 minuter efter att ett embryo är krossad. Denna egenskap utnyttjas för avlägsnande av RPE rester. Men näthinnans celler fastnar på ytan i mindre utsträckning, vilket kan kontrolleras noga under hög förstoring. Man måste hitta en balans mellan fullständighet RPE borttagning och retinal integritet.
   2. Linsen följer ofta till kulturen plattan och lossnar från näthinnan under valsningsprocessen. Ibland är det nödvändigt att ta loss objektivet med en etsad volfram nål med virvlande åtgärder på objektivets yta.
7. Dessa förfaranden kan framgångsrikt ta bort RPE från näthinnan utan att äventyra integriteten i vävnaden. Detta indikeras med en god allmän morfologi (Figur 1B och B) och histologi (Figur 1B "), pil är särskilt bevarandet av den extracellulära matrisen i mellan fotoreceptor lagret och RPE exceptionellt bra (Figur 1B." jämför med histologi från hela embryot (Figur 1A ")).

Del 3B: RPE-anslutna näthinnan dissektion ³

1. Förbered embryot som beskrivs i del 2.
2. Pin huvudet till odlingsplattan av biträdande pincett. Lyft ögat försiktigt från den bakre laterala sidan och rulla till den främre sidan.
   1. Den presumtiva åderhinnan och skleral vävnad på utsidan av RPE skiktet är fästa relativt hårt på huden och kan oftast skalas av genom att rulla ögat noga för att den främre sidan.
3. Ta bort linsen med en tungsten nålen efter den laterala sidan av ögat är utsatt och när ögat är fortfarande sitter i huden.
4. Dessa förfaranden kan lyckas bevara hela RPE lagret med näthinnan. Presumtiva choroids och skleral vävnad kan i stort sett bort (Figur 1C, C och C ").

Del 4: Tissue provtagning för RNA arbete

1. Den dissekerade prover kan tas på TRIzol i en RNase-fri mikrofugrör nedströms RNA karakterisering som beskrivs före ^1.

Representativa resultat

Figur 1. (A) Lateral och (A) dorsal vy av en zebrafisk larver huvudet vid 52 HPF före dissekering. (A ") Motsvarande histologiska delen av larver huvudet (A) och (A). (B) Lateral och (B) dorsal vy av en dissekerade näthinnan vid 54 HPF. Ytan på näthinnan var intakt från båda sidorna och rygg åsikter. (B ") Motsvarande histologiska delen av dissekerade näthinnan i (B) & (B). Strukturen i näthinnan och retinal laminering var intakt. I synnerhet den extracellulära matrisen mellan ljusmätare lagret och RPE (A "var, pilar) välbevarade i dissekerade näthinnan (B", pilar). (C) i sidled och (C) mediala syn på en dissekerade RPE-ansluten näthinnan vid 52 HPF. RPE lagret var intakt och kontinuerlig, vilket också framgår av den histologiska delen av dissekerade vävnad (C "). Det vita området i C" är synnerven (pilen). För histologi var vävnadsprover som samlats in och fixeras i 4% paraformaldehyd. plast inbäddning och snittning av dessa prover utfördes enligt ^3.. Skala = 50 ìm

Discussion

Microdissection av zebrafisk ögats vävnader effektivt kan få intakt näthinnor och RPE-anslutna näthinnor. Detta hjälper väsentligt uttryck studier som rör en viss ögat vävnad (dvs näthinnan eller RPE). I själva verket har vi använt framgångsrikt dessa förfaranden för att erhålla RNA-uttryck profiler av hela näthinnan ¹ och RPE ^3. Nyttan av dessa profiler får starkt stöd av våra senaste identifiering av vägar och familjer gen som är störs i en näthinnan differentiering mutant ^2. Den mest kritiska stegen i näthinnan dissektion förfaranden är de borsta åtgärd från spetsen av tång och vävnad rullande för RPE rester tas bort. Vi finner att sätta armbågarna på justerbara armstöd på en stol under dissektion kan avsevärt stabilisera oönskade handrörelser. Dessutom kan vissa RPE lämningar kvar i ora serrata. Detta beror på att denna region inte kan komma i kontakt med vidhängande yta odlingsplattan för dissekering. Ändå är de flesta RPE celler störs under tandborstning och peeling åtgärder och dessa RPE kvarlevor är sannolikt inte intakt. Dessutom bör en avvägning mellan retinal integritet och fullständighet RPE bort. För dissekera RPE-anslutna näthinnor, de flesta av de presumtiva åderhinnan och skleral vävnader som ser ut som en tunn genomskinlig membran kan skalas av tillsammans med huden. Det är också möjligt att ta bort dessa rester genom att borsta ytan av vävnad, bör dock en avvägning också göras mellan RPE integritet och fullständighet förorena vävnad. Vi har framgångsrikt utfört dissektion 1-3 DPF (24-72 HPF), som omfattar de kritiska stadierna av zebrafisk ögat morfogenes ^7. I genomsnitt tar det cirka 10 till 20 minuter från huvudet bryta till samlingen av dissekeras vävnader. Med lite övning kan en student göra en bra och konsekvent dissektion inom en månad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.