Zebrafish भ्रूण आँखों ऊतकों के Microdissection

Summary

इस अनुच्छेद के एक दृष्टिकोण के साथ और बिना रेटिना वर्णक उपकला एक से तीन दिन postfertilization भ्रूण से जुड़ी है, zebrafish retinas microdissect का वर्णन करता है.

Protocol

भाग 1: microdissection पहले तैयारी

1. समाधान
   1. E3 ⁴ मध्यम (5 मिमी NaCl, .17 मिमी KCl, .33 मिमी ₂ CaCl और 0.33 मिमी MgSO _4).
   2. घंटी ^एक समाधान ^{है, 5} (116 मिमी NaCl, 2.9 मिमी KCl, 1.8 मिमी ₂ CaCl, 5 मिमी HEPES, pH7.2), फिल्टर निष्फल.
   3. 5N NaOH.
2. टंगस्टन सुइयों के रासायनिक नक़्क़ाशी
   1. एक छोटे से एक पेट्री डिश पर मिट्टी द्वारा 5N NaOH युक्त बीकर सुरक्षित.
   2. बीकर के पक्ष पर एक पेपर क्लिप संलग्न, ताकि यह NaOH समाधान के साथ संपर्क में आता है.
   3. पेपर क्लिप और टंगस्टन तार के एक छोटे टुकड़े (~ 2cm) के एक अंत करने के लिए सकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए एक डीसी बिजली की आपूर्ति से नकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
   4. टंगस्टन तार के एक छोटे से मिट्टी की गेंद के साथ दूसरे छोर लपेटें और NaOH समाधान में यह अंत डुबकी.
   5. लगभग 3V करने के लिए वोल्टेज बढ़ाने के लिए और तार डुबकी और नीचे NaOH समाधान में जब तक एक अच्छा नक़्क़ाशी दर प्राप्त कर ली है. अच्छी गुणवत्ता में एक सुई आमतौर पर 10 मिनट में etched जा सकता है.
   6. टंगस्टन समाधान के लिए उजागर तार धीरे - धीरे पतली हो जाएगा. जब मिट्टी गेंद बंद बूँदें, तार के दूसरी ओर है कि अभी भी सकारात्मक इलेक्ट्रोड से जुड़ा हुआ है एक तेज सुई के आकार का होगा.
   7. घंटी समाधान या E3 नमक जमा हटाने के साथ तेज सुई कुल्ला.
   8. टेप या आसान से निपटने के लिए एक सुई धारक द्वारा एक लकड़ी के applicator के लिए सुई संलग्न.
3. संस्कृति प्लेटों
   1. फाल्कन 60 x 15 मिमी polystyrene संस्कृति प्लेटों रेटिना microdissection के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं.
   2. RPE-संलग्न रेटिना विदारक के लिए, दो भ्रूण पूरी तरह कुचलने एक संस्कृति घंटी विच्छेदन के पहले 30 मिनट सतह की चिपचिपाहट से छुटकारा पाने के समाधान युक्त थाली में. विच्छेदन से पहले शीघ्र ही, बड़े पैमाने पर थाली धोने ताजा घंटी समाधान के साथ.
4. भ्रूण संग्रह और मचान
   1. वयस्क zebrafish रखा जाता है के ^{रूप में 4,} 5 में वर्णित है.
   2. माता पिता स्थिर प्रजनन टैंक में मछली प्रजनन पहले एक विभक्त द्वारा रात जोड़ो में अलग.
   3. विभक्त के बाद कमरे की बत्ती पर अगली सुबह में बदल जाता है निकालें. माता पिता के 10 मिनट के अंतराल पर पार करने के लिए हर आधे घंटे की अनुमति दें. प्रत्येक पार करने के बाद मछली अलग.
   4. भ्रूण E3 के माध्यम से प्रत्येक पार से एकत्र 28 पर अलग से बनाए रखें डिग्री सेल्सियस
   5. 10 से 12 घंटे के बाद निषेचन (HPF) और restage विशिष्ट समय बिंदुओं पर विच्छेदन होने से पहले तुरंत पर स्टेज ^{भ्रूण स्थापित मापदंड} 1, 6 के अनुसार,.

भाग 2: विच्छेदन - मस्तिष्क हटाने और आंख ^एक जोखिम

• इस खंड में वर्णित प्रक्रियाओं रेटिना (भाग 3A) और RPE संलग्न रेटिना (पार्ट 3B) विदारक के लिए आम हैं.
• सब ठीक dissections Dumont संदंश के एक टिप के द्वारा किया जाता है और ऊतक स्थिति के लिए Dumont संदंश की एक और जोड़ी द्वारा सहायता प्रदान की. टंगस्टन रासायनिक etched सुई यदि आवश्यक हो तो बेहतर जोड़तोड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
• सब ठीक dissections ~ 5 8x बढ़ाई के एक ओलिंप SZX16 एक 1X उद्देश्य या समकक्ष के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
• एक बेंच शीर्ष इनक्यूबेटर में 28 E3 के मध्यम में भ्रूण बनाए रखें ° विच्छेदन के दौरान आसान भ्रूण का उपयोग करने के लिए खुर्दबीन के लिए अगले सी.
• खुर्दबीन मंच थर्मामीटरों प्लेट द्वारा 28 डिग्री सेल्सियस तक गरम है जीन अभिव्यक्ति पर तापमान के उतार - चढ़ाव के प्रभाव को कम.

1. एक विशिष्ट विकास मंच पर एक फाल्कन 60 एक्स 15 मिमी संस्कृति की थाली में घंटी के समाधान के लिए स्थानांतरण एक भ्रूण तैयार पार्ट 1 # 3 में वर्णित के रूप में.
2. पूर्वकाल ट्रंक के भाग के साथ सिर कट जल्दी से शरीर से.
3. सहायता संदंश के साथ संस्कृति की थाली पर इस ऊतक के पीछे अंत पिन.
4. पूर्वकाल माथे से शुरू पृष्ठीय पक्ष पर सिर खोलें.
5. मस्तिष्क इतना है कि आँखों के औसत दर्जे का पक्ष उजागर किया है और आगे जोड़तोड़ के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है निकालें.

पार्ट 3A: रेटिना विच्छेदन ¹

1. तैयार भ्रूण के रूप में भाग 2 में वर्णित.
2. ध्यान से नज़र गेंद कि उर्ध्व संदंश के टिप द्वारा सामना करना पड़ रहा है जब तक रेटिना के लिए एक छोटे से खोलने में देखा जाता है की औसत दर्जे का पक्ष पर उजागर RPE ब्रश.
3. Brushing और कार्रवाई छीलने जब तक रेटिना के औसत दर्जे का पक्ष लगभग सभी संपर्क में है जारी रखें. Scratching और छिद्रण उजागर रेटिना से बचें.
4. रेटिना जो अब नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है, दृष्टिकोण पर पार्श्व RPE निकालने कि और संस्कृति की थाली की सतह से लगभग 45 ° का एक कोण पर ब्रश.
5. RPE कि अपेक्षाकृत मजबूती ग RPE के अलग हिस्से लगाए ora serrata से जुड़ा हुआ है निकालेंulture थाली, विच्छेदन के लिए और फिर धीरे रेटिना लिफ्ट.
6. संस्कृति डिश के तल पर रेटिना रोल अवशिष्ट RPE साफ.
   1. हमने देखा है कि इस विशेष फाल्कन polystyrene संस्कृति की थाली लगभग 20 मिनट के लिए एक RPE के तरजीही पालन किया है एक बार एक भ्रूण कुचल दिया है. इस संपत्ति RPE अवशेष को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, रेटिना की कोशिकाओं को एक हद तक कम है, जो उच्च वृद्धि के तहत बारीकी से निरीक्षण कर सकते हैं करने के लिए सतह के लिए छड़ी नहीं है. RPE हटाने और रेटिना अखंडता की पूर्णता के बीच एक संतुलन है.
   2. लेंस अक्सर संस्कृति की थाली का पालन करता है और रोलिंग प्रक्रिया के दौरान रेटिना से detaches. कभी कभी, यह आवश्यक है एक etched टंगस्टन सुई द्वारा लेंस लेंस की सतह पर एक घूमता कार्रवाई के साथ अलग.
7. इन प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक रेटिना से ऊतक की अखंडता समझौता किए बिना RPE की निकाल सकते हैं. यह एक अच्छा समग्र आकारिकी (चित्रा 1 बी और बी ') और ऊतक विज्ञान (चित्रा 1 बी ") द्वारा संकेत दिया है विशेष रूप से, फोटोरिसेप्टर परत और RPE के बीच में बाह्य मैट्रिक्स के संरक्षण असाधारण अच्छा है (चित्रा 1 बी." तीर; पूरे भ्रूण (चित्रा 1 ए ")) से ऊतक विज्ञान के साथ तुलना.

पार्ट 3B: RPE संलग्न रेटिना ³ विच्छेदन

1. तैयार भ्रूण के रूप में भाग 2 में वर्णित.
2. संस्कृति की थाली के लिए सहायक संदंश द्वारा सिर पिन. आँख धीरे पीछे पार्श्व की ओर से और लिफ्ट पूर्वकाल पक्ष के लिए रोल.
   1. प्रकल्पित और RPE परत के बाहर पर scleral ऊतक रंजित अपेक्षाकृत कस त्वचा से जुड़े होते हैं और ज्यादातर ध्यान से पूर्वकाल ओर आँख रोलिंग द्वारा किया जा सकता से खुली.
3. एक टंगस्टन सुई के साथ लेंस निकालें बाद आँख के पार्श्व की ओर अवगत कराया है और जब आँख अभी भी त्वचा से जुड़ी है.
4. इन प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक रेटिना के साथ पूरे RPE परत की रक्षा कर सकते हैं. प्रकल्पित choroids और scleral ऊतक काफी हद तक हो सकता है (चित्रा 1C, सी और सी ") हटाया जा सकता है.

भाग 4: शाही सेना के काम के लिए ऊतक नमूना संग्रह

1. अनुप्रवाह आरएनए लक्षण वर्णन के लिए एक RNase मुक्त microfuge ट्यूब ^के रूप में 1 पहले वर्णित में TRIzol में dissected नमूने एकत्र किया जा सकता है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 (ए) और पार्श्व (ए) विच्छेदन पहले 52 HPF पर एक zebrafish लार्वा सिर के पृष्ठीय दृश्य. (एक ") (ए) और (ए ') (बी) और पार्श्व (बी) 54 HPF में dissected रेटिना के पृष्ठीय दृश्य. रेटिना की सतह दोनों पार्श्व से बरकरार था इसी लार्वा सिर के histological अनुभाग और पृष्ठीय दृश्य (बी) (बी) और ('बी) में इसी dissected रेटिना के histological अनुभाग. रेटिना और रेटिना फाड़ना की संरचना बरकरार था. विशेष रूप से, फोटोरिसेप्टर परत और RPE (ए के बीच बाह्य मैट्रिक्स "(तीर तीर,) अच्छी तरह से dissected रेटिना बी) में संरक्षित किया गया था". (सी) पार्श्व और (सी) 52 HPF में dissected RPE संलग्न रेटिना की औसत दर्जे का दृश्य. RPE परत बरकरार है और निरंतर था, जो भी dissected ऊतक के histological खंड (सी) ने संकेत दिया था सी 'में सफेद क्षेत्र ऑप्टिक तंत्रिका (तीर) है. ऊतक विज्ञान के लिए, ऊतक के नमूने एकत्र थे और 4% में तय paraformaldehyde. एम्बेडिंग और इन नमूनों की सेक्शनिंग प्लास्टिक के रूप में ³ में वर्णित स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी प्रदर्शन किया गया.

Discussion

Zebrafish आँख के ऊतकों के Microdissection प्रभावी ढंग से बरकरार retinas और RPE-संलग्न retinas प्राप्त कर सकते हैं. यह काफी हद तक अभिव्यक्ति एक विशिष्ट नेत्र ऊतक (यानी रेटिना या RPE) से संबंधित अध्ययन में मदद करता है. वास्तव में, हम सफलतापूर्वक इन प्रक्रियाओं का उपयोग किया है पूरे ¹ रेटिना और ³ RPE की शाही सेना की अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त है . इन प्रोफाइल के उपयोगिता दृढ़ता से हमारे रास्ते और जीन परिवारों कि रेटिना ^{भेदभाव} 2 उत्परिवर्ती में परेशान कर रहे हैं हाल ही में पहचान के द्वारा समर्थित है. रेटिना विच्छेदन की प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम संदंश और ऊतकों RPE अवशेष को हटाने के लिए रोलिंग की नोक से brushing कार्रवाई कर रहे हैं. हम समायोज्य बांह पर कोहनी डाल पाते विच्छेदन के दौरान एक कुर्सी पर टिकी हुई है काफी अवांछित हाथ आंदोलनों को स्थिर कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ RPE अवशेष ora serrata में रह सकती है. यह है क्योंकि इस क्षेत्र विच्छेदन के लिए संस्कृति की थाली का पालन सतह के साथ संपर्क में नहीं आ सकता. बहरहाल, सबसे RPE कोशिकाओं brushing और छीलने कार्रवाई के दौरान बाधित कर रहे हैं और इन RPE अवशेष बरकरार होने की संभावना नहीं हैं. इसके अलावा, रेटिना अखंडता और RPE हटाने की पूर्णता के बीच एक संतुलन मारा जाना चाहिए. RPE संलग्न retinas विदारक, प्रकल्पित रंजित और scleral ऊतकों जो एक पतली पारदर्शी झिल्ली की तरह लग के सबसे से खुली किया जा सकता है के साथ त्वचा के साथ. यह भी संभव है ऊतक की सतह brushing द्वारा इन अवशेष को हटाने, लेकिन एक संतुलन भी RPE अखंडता और ऊतक हटाने contaminating की पूर्णता के बीच मारा जाना चाहिए. हम सफलतापूर्वक 1-3 (24-72 HPF) DPF है, जो zebrafish ^आँख 7 morphogenesis के महत्वपूर्ण चरणों को कवर से विच्छेदन प्रदर्शन किया. औसत में यह सिर विच्छेद से dissected ऊतकों के संग्रह के लिए लगभग 10 से 20 मिनट ले जाएगा. अभ्यास के साथ, एक छात्र एक महीने के भीतर एक अच्छा और लगातार विच्छेदन प्रदर्शन कर सकते हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.