Molécules simples à l'imagerie du transport nucléaire

Summary

Microscopie à molécule unique Approche fourni de nouvelles connaissances sur le transport nucléaire.

Abstract

L'utilité des approches molécule unique microscopie par fluorescence a été prouvée pour être d'un grand résultat dans la compréhension des réactions biologiques au cours de la dernière décennie. L'enquête sur les interactions moléculaires à haute résolution spatiale et temporelle profonde au sein des cellules est resté difficile en raison de la faiblesse inhérente des signaux provenant de molécules individuelles. Des travaux récents par Yang et al. démontré que la microscopie à champ étroit épifluorescence permet la visualisation de transport nucléocytoplasmique au niveau molécule unique. Par l'approche seule molécule, cinétique importante, comme le temps de transport nucléaire et l'efficacité, pour les molécules de fret signal dépendantes et indépendantes ont été obtenues. Ici, nous avons décrit un protocole pour l'approche méthodologique avec une meilleure résolution spatio-temporelle des nm et 12 ms 0.4. L'amélioration de la résolution nous a permis de capture de transitoires de transport actifs et des événements de diffusion passive à travers les complexes des pores nucléaires (NPC) en semi-intactes les cellules. Nous prévoyons que cette méthode soit utilisée dans l'élucidation d'autres événements de liaison et le trafic intérieur des cellules.

Protocol

1. Préparation du système de pile pour l'expérience seule molécule

1. Au moins une semaine à l'avance, commencer une nouvelle culture de la lignée cellulaire HeLa à partir d'un stock par décongélation à 37 ° C et mettre dans un flacon de ^culture de 25 cm2 avec les médias de 5 ml, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO ₂ incubateur pendant 24 heures et de le diviser au moins 3 fois afin de fournir une condition optimale pour les cellules. Toutefois, les cellules ne doivent pas être divisé plus de 20 fois à cause de la propension de leurs taux de croissance de ralentir de manière significative. Des cellules HeLa ont été préalablement modifiées génétiquement pour avoir la GFP (green fluorescent protein) fusionnée à la protéine de la membrane d'enveloppe pore nucléaire POM 121. Il est nécessaire pour une localisation précise de l'enveloppe nucléaire.
2. Un jour avant l'expérience, les cellules destinées à une expérience de la molécule unique devrait être étalé sur une lamelle autoclavé placés dans une boîte de Pétri stérile. La lamelle devrait être suspendu dans DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, Grand Island, NY) complété avec 4,5 g / L de glucose, 862 mg / L glutamax-I, 15 mg / ml rouge de phénol, 100 U / ml de pénicilline, 100μg/mL streptomycine et 10% de sérum de veau nouveau-né. Le volume d'une culture doit être 1ml par lamelle, répartie uniformément sur toute la surface. Ces boîtes de Pétri avec les lamelles sont ensuite placés dans le CO ₂ incubateur et gardé pendant 24 heures avant l'expérience. Pour une culture de cellules pour être adapté à une expérimentation seule molécule de la cellule confluence sur la lamelle ne doit pas dépasser 70% pour fournir une bonne liberté pour les tampons de lavage et de protéines d'intérêt en cours du transport nucléaire.
3. Le jour de l'expérience, le débit-chambres ont été construites par l'ajout d'un capot supérieur de glissement avec deux lignes de graisse silicone comme entretoises. Il est essentiel de s'assurer que les cellules ne se dessèchent pas pendant la préparation. Nous préfèrent généralement avoir deux chambres effectuées sur une lamelle de permettre à deux conditions différentes pour l'expérience. Le couvercle supérieur se glisse éclats petite lamelle de verre coupé avec un couteau de diamant à environ 6mm2 ont été placés à l'envers sur une Kimwipe. Deux lignes de graisse de silicone ont été finement placées le long des bords de l', il lamelles avec une seringue de 10 ml en plastique qui avait une pointe de pipette solidement attachée avec du Parafilm de contrôler la taille de la perle de la graisse.
4. La diapositive HeLa-cellulaire enduit est ensuite séché au goutte à goutte et monté avec de la graisse comme la colle dans un cadre en aluminium usiné maison - en colère, qui ont servi à maintenir la lame dans le porte-échantillon de microscope.
5. Les lamelles dessus avec les deux lignes de graisse ont ensuite été ramassé avec une pince à épiler a ensuite inversé sur la lame à revêtement cellulaire, formant une chambre de flux. Une pièce jointe a été faite relativement ferme en appuyant doucement sur les bords de la lamelle graissé.
6. Depuis que nous avons fait deux chambres séparées sur une cellule-lame enduite, il est essentiel de fournir une bonne étanchéité pour éviter la contamination croisée. A cet effet, plusieurs lignes de la graisse de silicone ont été appliquées dans entre les chambres du haut vers le bas de la diapositive pour sceller l'intervalle. Plusieurs lignes de graisse ont été également mis sur les côtés extérieurs des chambres.
7. Milieu DMEM est alors ajouté à la chambre d'écoulement pour empêcher les cellules de se dessécher. Débit de la solution a été promu par un papier filtre de petit morceau d'absorber le liquide hors de la face de sortie de la chambre de flux. Avec les mains stables, la solution pourrait être ajouté simultanément par micropipette sur un côté de l'écoulement de chambre avec une seule main, et absorbé de l'autre côté par un papier filtre.
8. Après la construction, le bas de la lame a été lavée avec un tampon humide coton-tige, deux fois avec de l'eau, puis deux fois avec de l'éthanol à 100%.
9. Une fois que la lame est montée sur le microscope, les cellules ont été lavées avec 2 X 25 tampons à l'importation uL (HEPES 20 mM, 110 mM KOAc, 5 mM de NaOAc, 2 mM MgOAc, EGTA 1 mM, pH 7,3). Les cellules ont ensuite perméabilisées ~ 2 minutes avec 2 X 25 uL 40 ug / ml dans le tampon digitonine importation et lavé à nouveau avec 2 X 25 tampons à l'importation uL (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM de NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) additionné de 1,5% de polyvinylpyrrolidone (PVP; kDa 360). Il peut être nécessaire de surveiller la perméabilisation dans un temps réel en utilisant le champ lumineux. PVP a été inclus dans toutes les solutions tampons importation après digitonine pour éviter un gonflement osmotique des noyaux. Le noyau intact, avec un environnement contrôlé cytoplasmique, fournit un système de transport très simplifié qui nous permet d'élucider les étapes de transport complexes nucléaires par étape. Ensemble précédent et une seule molécule expériences menées dans le système ont permis de mieux comprendre grand dans le transport nucléaire.

2. Préparation de protéines essentielles pour l'expérience du transport nucléaire

1. Par le biais d'une transformation bactérienne des souches traditionnelles spéciales de E.coli (JM109) ont été conçus en vue d'une surexpression des gènes responsables dela production des protéines précitées de l'intérêt et sont gardés en stock à -80 ° C. (Pour NLS-2xGFP nous avons utilisé pTrcHisB vecteur par Invitrogen). Une anse ou ~ 50 uL des stocks congelés de la protéine fluorescente ou la cargaison cellules exprimant E. Coli sont transférés à 5ml de milieu LB avec addition de 5uL de l'ampicilline (U 1000) et cultivées en aérobie avec agitation une nuit à 37 ° C à 225 rpm.
2. Après 24 heures 500 ul de culture saturée est transféré dans 500 ml de milieu LB et secoué dans l'incubateur 37 ° C pendant 5-6 heures après l'ajout de 250 uL IPTG (isopropyl-_ D-1-thiogalactopyranoside) et incubée pendant une autre 5-6 heures. Elle est nécessaire parce que l'IPTG est un métabolite du lactose qui déclenche la transcription de l'opéron lac, où le gène lacZ est remplacé par le gène d'intérêt et de l'IPTG est ensuite utilisé pour induire l'expression des gènes.
3. La culture est ensuite filé dans le refroidissement à haute vitesse de centrifugation à 12000 rpm pendant 15 minutes et le surnageant est éliminé. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans 40 ml de CelLytic B (B CelLytic résultats dans l'extraction rapide et efficace de protéines qui sont adaptés pour la purification par affinité et d'analyse.) Le volume devrait être basée sur 10 ml pour 1 gramme d'une pastille. 28 ul de mercaptoéthanol est ajouté à la rupture des liaisons disulfure et 400 ul de fluorure phénylméthanesulfonyle de désactiver les protéases de digérer des protéines d'intérêt après lyse cellulaire. Un «cocktail protéase» est également ajoutée (400 uL de 0,2 mg / ml pepstatine A. 400 ul de 0,2 mg / ml de leupeptine; 400 pi de 2 mg / ml d'inhibiteur de trypsine) pour s'assurer que des extraits de protéines ne se dégradent pas avant l'analyse des cibles d'intérêt. Nous ajoutons ensuite 400 ul 1M imidazole, est utilisé pour éluer les protéines marqués liés aux ions Ni attaché à la surface des billes dans la colonne de chromatographie et de 1mm de DNase I, utilisés pour dégrader indésirables ADN simple et double brin en 5 phosphodinucleotide et oligonucléotide fragments.
4. Incorporer le mélange dans le noir sur la glace pendant 30 minutes pour permettre un temps adéquat pour la réaction, tournent à 10000 rpm pendant 60 minutes dans la centrifugeuse de refroidissement. Récolte du surnageant et en préparation pour la chromatographie effectuer la perfusion avec Ni-NTA (acide Superflow nickel-nitrilotriacétique par Qiagen) en faisant tourner dans des tubes de centrifugeuse microcentrifugeuse à vitesse max pendant 3 minutes et laver avec un tampon de lyse, en répétant la filature et le lavage jusqu'à ce que le mélange est l'écart de toute teinte bleue. Incorporer le mélange obtenu lentement dans un récipient sombre sur la glace pendant 60 minutes.
5. Effectuer la chromatographie sur colonne qui coule à travers 12 fractions comme suit. La première fraction est un flux à travers de 10 ml de surnageant mélangé avec Ni-NTA dans l'étape précédente. La seconde est de 10 mL de tampon de lyse (50 mM de Na-phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8,0), le troisième 10 ml de tampon (10 mM imidazole, NaCl 100 mM, pH 8,0), le quatrième et le reste sont 0,5 mL de tampon d'élution (250 mM imidazole, NaCl 100 mM, pH 8,0)
6. Préparer le gel de polyacrylamide SDS-PAGE et préparer nos échantillons en mélangeant 4 ul d'une fraction et 1 pl de SB 5X (Tris 6,8 300mm, BME 25%, 10% de SDS, glycérol 50%). Pour le standard, nous avons utilisé 100 ko échelle d'ADN par Invitrogen. Avant de charger nous nos échantillons bouillis pendant 5 minutes. Après le chargement nous avons couru le gel à 120V pendant 60 minutes. Ensuite, nous avons taché, décolorés et finalement séché dans un séchoir à gel spécial de 2 heures à 80C.
7. Nous avons ensuite vu les résultats sur le gel et situé les fractions qui a produit le meilleur résultat. Selon les protéines de notre intérêt, les bandes devraient être situés respectivement à la taille d'une protéine. Cette fraction doit être choisi pour la purification de protéines plus loin avec MonoQ et Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. La concentration est réalisée en faisant tourner les fractions les plus concentrées dans Nanosep filtre avec une taille de pores de 10K à 14 tours par minute pendant 5 minutes, le laver avec un tampon d'élution à chaque fois. Il est nécessaire de déterminer la concentration finale en protéines en utilisant le dosage des protéines BSA pour la procédure d'étiquetage supplémentaires.
9. La fluorescence intrinsèque vert de NLS-2xGFP ne peut pas être utilisé pour l'imagerie seule molécule de transport de matières nucléaires en raison de sa mauvaise photo-stabilité et le spectre coïncidé avec l'autofluorescence cellulaire. Ainsi, nous appelons les molécules de fret avec un excès d'un colorant organique réactif en cystéine (Alexa555 ou Alexa 647 maléimide de Molecular Probes) pendant 2 heures à température ambiante dans 50 mM phosphate de sodium, NaCl 150 mM après réduction d'PTCE tris (2 - carboxyéthyl) pendant 20 minutes. Les réactions ont été trempé avec le 2-mercaptoéthanol, et les solutions de protéines ont été dialysée pour éliminer le colorant libre.

3. Microscopie à molécule unique

1. Notre ensemble microscope comprend jusqu'à un Olympus IX81 équipé d'un NA 1.4 100x huile d'objectif à immersion (UPLSAPO 100XO, Olympus), un 35 mW 633 nm laser He-Ne (Melles Griot), une lampe au mercure à la GFP de filtre mis en place, une sur le puce de multiplication gain de dispositif de caméras à couplage de charge (128 + Cascade, Roper Scientific) et epaquet e Slidebook logiciels (Intelligent innovations en imagerie) pour l'acquisition de données et de traitement. Un chopper optique (Newport) a été utilisé pour générer un mode on-off de l'excitation laser. GFP et Alexa647 fluorescence est excitée par une lampe au mercure et 633 nm laser respectivement. L'émission de fluorescence verte et rouge ont été recueillis par le même objectif, filtré par un filtre dichroïque (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) et un filtre d'émission (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) et imagée par une caméra CCD identiques.
2. Dans les expériences de la molécule unique, nous permettons à l'époque de fluorescence photoblanchiment de la molécule seule cargaison d'être plus long que le temps de transport. Pour déterminer le temps de photoblanchiment, 0,1 nM fret molécules sont étalées sur un couvercle en verre glissent et deviennent immobiles après 30 minutes en raison de l'absorption non-spécifique. Ensuite, le cours du temps de la fluorescence est mesurée. Selon les protéines de fois photobleach intérêt sera différent basé sur le nombre de cystéines capables de réagir avec maléimides, donc l'intensité d'éclairage et de la zone d'illumination doivent être ajustés afin de ne pas induire un photoblanchiment préliminaire et s'assurer que les molécules de fret étiquetés avec Alexa 647 d'affichage fluorescence pour plus longtemps que les cargaisons d'interagir avec les PNJ.
3. Pour les expériences à l'importation dans les cellules perméabilisées, le fret et le transport des cofacteurs essentiels ont été additionnées. Typiques des réactions de fret à l'importation contenait 1 mM GTP, 0,5 uM Importin-, 0,5 uM Importin-1, 2 uM Ran et 1 uM NTF2 pour le transport facilité et 0,1 nM de 10KDa Dextran pour le transport passif .. Les concentrations de fret ont été Fluorescent> 100 nM dans des expériences en vrac, et ~ 100 pM pour les dosages seule molécule. A ces concentrations,> 99% de la cargaison a été prévu pour former des complexes avec Importin et Importin. Taux de transport a été contrôlé par épifluorescence (si ce n'est que les taux relatifs ont été importantes) ou microscopie confocale à fluorescence (si les taux absolus étaient souhaités).
4. D'abord la position de l'enveloppe nucléaire a été déterminée par microscopie à champ large épifluorescence en engageant une lampe au mercure HBO avec une série de filtres GFP pour prendre une photo de la NE. Les intensités des pixels dans une ligne ou une colonne sont approximativement perpendiculaire à la NE ont été ajustés avec des gaussiennes. Les positions des pics de la gaussienne pour un ensemble particulier de intensités des pixels a été considéré comme la position NE pour cette ligne et colonne. Les positions des pics d'une série de gaussiennes telles étaient alors l'ajustement à un polynôme du second degré, ce qui donne le chemin du nord au sein de toute l'image.
5. Une fois le NE est localisée, il est essentiel de se débarrasser de tous autofluorescence utilisant un 633 nm laser He-Ne jusqu'à ce qu'il soit complètement photobleached, habituellement plus de 60 secondes est suffisant.
6. Molécules de l'échantillon doit ensuite être conservé dans une solution de 1,5% de PVP et le mélange est ajouté à la chambre de flux dans un volume de 25 L et ensuite traîné dans la chambre de l'application d'une mèche de papier filtre. Un soin extrême doit être pris lors de l'addition des protéines de fret à l'importation pour les cellules perméabilisées à droite après la localisation de l'enveloppe nucléaire, depuis la mise au point peut être facilement perturbé par un mouvement vigoureux.
7. Dès que les molécules de fret sont ajoutés, 633 nm laser He-Ne a été utilisée pour éclairer les trajectoires du transport de molécules transitent. Un chopper optique (Newport) devrait être engagé à environ 5 Hz à éviter le photoblanchiment due à une forte densité de puissance du laser, ainsi que pour permettre à une nouvelle portion de la non-photobleached molécules uniques d'approcher le NE. Une série de vidéos de translocations seule molécule doit être pris avec une caméra CCD à haute vitesse qui peut aller jusqu'à 2500 Hz.

4. Les résultats représentatifs

Effectuée correctement, notre protocole nous a permis de collecter une série de vidéos montrant la translocation de molécules cargo simple interaction avec le complexe du pore nucléaire dans perméabilisées HeLa POM 121 cellules. (Fig 1). Nous avons décidé de l'image et de suivre les étapes du transport transitoire de molécules de dextrane par le NPC dans les cellules HeLa perméabilisées digitonine exprimant de façon stable la GFP POM121. Les cellules ont été incubées avec de faibles concentrations des molécules de dextrane étiquetés. Le plan équatorial du noyau a été mis en évidence avec une image claire de l'anneau vert de fluorescence de la GFP excité par une lumière 488-nm lampe au mercure. Une exposition de longue date de la GFP-NE nous permet d'obtenir un excellent rapport signal-bruit (SNR) Le ratio de localiser l'avion milieu de la NE. Auparavant 10 kDa molécules de dextran ont été trouvés à diffuser à travers le NE au sein d'environ 2 ms avec une résolution spatiale d'environ 20-40 nm par une cadence de détection de 500 ou 1000 Hz.. Une telle résolution spatio-temporelle permet la capture d'un seul à deux étapes de diffusion des molécules de dextrane par le NPC qui n'est pas suffisant pour élucider plus d'information spatiale pour la diffusion passive. Pour capturer des mesures plus fines de molécules de dextrane dans le NPC avec une meilleure spatiRésolution otemporal, nous avons mené deux améliorations majeures: (i) d'adapter un taux de détection plus rapide cadre de 2500 Hz pour capturer étapes de diffusion plus fine, et (ii) d'employer une plus grande densité de l'éclairage optiques pour exciter plus de photons de molécules simples à obtenir une meilleure résolution spatiale. Ces améliorations nous permettent de capter de multiples étapes de la diffusion transitoire de alexa647 molécules marquées dextrane dans le nord par une lumière laser de 633 nm à l'éclairement de 100 kW / cm ² avec une résolution spatio-temporelle de 12 nm et 400 ms.

Comme le montre la figure 1, une série d'images fixes sur les événements de transport typique des molécules de dextrane ont été enregistrés. En suivant les trajectoires spatiales de différents molécules de dextran qui transitent, les étapes amende de diffusion à travers le NE ont été distingués. Nous avons trouvé qu'il ya environ 30% des événements d'interaction avec le NE ont reconnu d'origine et de destination des compartiments. Parmi eux, les molécules de dextran mouvement du cytoplasme vers le NE ont deux destinations: la fin dans le noyau après la diffusion à travers le NE ou revenir vers le cytoplasme, après interaction avec le NE L'situations similaires pour des événements survenus à l'exportation: les molécules de dextrane à partir du noyau pénétrer dans le cytoplasme ou diffuse vers le noyau après l'interaction avec le NE. Ces séries d'images contiennent des informations sur la position spatiale des molécules simples à l'égard de l'APN, ainsi que des informations temporelles sur le temps de séjour des molécules à travers le NPC. En analysant les trajectoires des molécules de dextrane dans le domaine de la NE, la fréquence du temps de transport, d'efficacité et d'entrée peut être déterminée. Le temps de transport dans notre travail peut être identifié comme l'importation ou l'exportation de l'époque. Ils ont été définis comme des temps de séjour moyen des molécules de dextrane dans le PNJ qui subissent l'importation ou l'exportation. L'importation ou l'exportation de l'efficacité a été définie comme le pourcentage de l'importation complète ou les événements d'exportation au cours de la somme des événements complets et abortives. La fréquence d'entrée importation ou l'exportation se réfère au nombre de molécules qui interagissent avec le NE au cours d'une seconde.

Figure 1. Trames vidéo sélectionnées sur les événements de transport typique des molécules de dextrane par la NE. (A) Un événement cytoplasme à noyau. Une seule molécule de dextran (tache rouge) a commencé à partir du cytoplasme, interagi avec le NE (ligne de pixels verts), et a fini dans le noyau. Les trajectoires de l'événement (lignes bleues et les points ouverts) ont été déterminées et superposée à la NE (ligne noire). Les lignes vertes et rouges représentent 100 nm-distance de la NE sur le cytoplasme et du côté du nucléaire. C, le cytoplasme. N, le noyau. Barre d'échelle: 2 mm. (B) Un événement cytoplasme à cytoplasme. (C) Un événement noyau-à-noyau. (D) Un événement noyau-à-cytoplasme.

Discussion

Des précautions doivent être prises pour assurer une bonne colocalisation des molécules NE et unique au cours de l'expérience. Il est également important de fournir un rapport signal bruit de haute, surtout lorsque le signal est faible en raison de mauvais étiquetage ou de photoblanchiment. Précision de localisation est limitée par le bruit de fond (découlant de sortir du flou de fluorescence, bruit de lecture du CCD, sombre facteurs actuels et d'autres).