Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

Summary

Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Abstract

L'utilità dei singoli approcci di microscopia a fluorescenza molecola ha dimostrato di essere di avvalersi grande nel capire le reazioni biologiche negli ultimi dieci anni. L'indagine delle interazioni molecolari con alta risoluzione temporale e spaziale in profondità all'interno delle cellule è rimasta difficile a causa dei segnali intrinsecamente debole derivanti da singole molecole. Opere recenti di Yang et al. dimostrato che il piccolo campo epifluorescenza permette la visualizzazione di trasporto nucleocytoplasmic a livello di singola molecola. Con l'approccio singola molecola, la cinetica importanti, come il tempo di trasporto nucleare ed efficienza, per le molecole segnale carico-dipendenti e indipendenti sono stati ottenuti. Qui abbiamo descritto un protocollo per l'approccio metodologico con una migliore risoluzione spazio-temporale di 0,4 ms e 12 nm. La risoluzione migliore ci ha permesso di catturare transitori trasporto attivo ed eventi diffusione passiva attraverso i complessi poro nucleare (NPC) in semi-intatte le cellule. Ci aspettiamo che questo metodo da utilizzare per chiarire altri eventi vincolante e il traffico all'interno delle cellule.

Protocol

1. Preparazione del sistema cellulare per l'esperimento di singola molecola

1. Almeno una settimana di anticipo, iniziare una nuova cultura della linea cellulare HeLa da uno stock di scongelamento a 37 ° C e mettendo in un centimetro 25 ² fiasco cultura dei media con 5 ml, Incubare le cellule a 37 ° C entro il 5% di CO ₂ incubatore per 24 ore ed è diviso almeno 3 volte al fine di fornire una condizione ottimale per le cellule. Tuttavia le cellule non dovrebbe essere diviso più di 20 volte a causa della propensione del loro tasso di crescita di rallentare in modo significativo. Cellule HeLa in precedenza erano geneticamente ad avere GFP (green fluorescent protein) fusa alla proteina di membrana poro nucleare busta POM 121. E 'necessario che una localizzazione precisa della busta nucleare.
2. Un giorno prima dell'esperimento, delle cellule destinati ad un esperimento di singola molecola dovrebbe essere diffuso su un vetrino autoclave posto in una piastra di Petri sterile. Il coprioggetto deve essere sospesa in DMEM (Dulbecco medio ha modificato dell'Aquila, Grand Island, NY) integrata con 4,5 g / L di glucosio, 862 mg / L GlutaMAX-I, 15 mg / ml rosso fenolo, 100 U / ml penicillina, 100μg/mL streptomicina e il 10% siero di vitello neonato. Il volume di una cultura dovrebbe essere 1 ml per polizza di copertura, uniformemente distribuiti su tutta la superficie. Queste piastre di Petri con il coprioggetto poi vengono inseriti nella CO ₂ incubatore e mantenuto per 24 ore prima dell'esperimento. Al fine di una coltura cellulare per essere adatto per un esperimento di singola molecola della cellula confluenza sul vetrino non deve superare il 70% per fornire una libertà bene per tamponi di lavaggio e di proteine ​​di interesse in fase di trasporto nucleare.
3. Il giorno dell'esperimento, flow-camere sono state costruite con l'aggiunta di un coperchio superiore scivolare insieme con due righe di grasso al silicone come distanziatori. E 'essenziale assicurarsi che le cellule non si asciugano durante la preparazione. Noi di solito preferiscono avere due camere di fatto su una copertura antiscivolo per consentire a due diverse condizioni per l'esperimento. Il coperchio superiore scivola piccole scaglie di slittamento copertura in vetro tagliato con un coltello di diamante a circa 6mm2 sono stati messi a testa in giù su un Kimwipe. Due linee di grasso al silicone sono state finemente collocati lungo ha bordi del coprioggetto con una siringa da 10 ml di plastica che aveva un puntale strettamente collegata con Parafilm per controllare la dimensione del grasso tallone.
4. Le cellule HeLa-scivolo rivestito è stato poi sgocciolati e montato con grasso come collante in una casa-lavorati telaio in alluminio - temperamento, che serviva per tenere la diapositiva nel porta-campioni microscopio.
5. Le polizze di copertura superiore con le due linee di grasso sono stati poi raccolti con una pinzetta a punta e poi invertita sulla cella rivestita di diapositive, formando una camera di flusso. Un allegato relativamente azienda è stata fatta premendo delicatamente sui bordi unto del coprioggetto.
6. Da quando abbiamo fatto due camere separate da una cellula rivestita scivolo è indispensabile fornire una buona tenuta per evitare la contaminazione crociata. A questo scopo diverse linee del grasso al silicone sono stati applicati in tra le camere da cima a fondo alla diapositiva per sigillare la parte. Diverse linee di grasso sono stati messi in evidenza i lati esterni delle camere.
7. DMEM media è stata poi aggiunta alla camera di flusso per evitare che le cellule si secchi. Flusso di soluzione è stata promossa da un piccolo pezzo di carta filtro per assorbire il liquido verso l'uscita laterale delle camere di flusso. Con mano ferma, la soluzione potrebbe essere aggiunto contemporaneamente micropipetta ad un lato del flusso a camera con una mano, e assorbito dall'altro lato da carta da filtro.
8. Dopo la costruzione, la parte inferiore della diapositiva è stato lavato con una punta di cotone bagnato tampone, due volte con acqua, e poi due volte con il 100% di etanolo.
9. Una volta che la diapositiva è montato sul microscopio, le cellule lavate con 2 X 25 microlitri di buffer importazione (20 Hepes mm, 110 mm KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, EGTA 1 mM, pH 7,3). Le cellule poi permeabilizzate per circa 2 minuti con 2 x 25 microlitri a 40 mcg / mL digitonina nel buffer di importazione e lavate nuovamente con 2 X 25 microlitri di buffer importazione (20 HEPES mm, 110 mm KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) integrata con 1,5% polivinilpirrolidone (PVP; kDa 360). Potrebbe essere necessario monitorare la permeabilizzazione in tempo reale utilizzando il campo luminoso. PVP è stato incluso in tutte le soluzioni tampone di importazione dopo digitonina per prevenire il gonfiore osmotica dei nuclei. Il nucleo intatto, insieme ad un ambiente controllato citoplasmatica, fornisce un sistema di trasporto notevolmente semplificato che ci permette di chiarire la complicata fase di trasporto nucleare dopo passo. Ensemble precedenti e singola molecola esperimenti condotti nel sistema hanno fornito grandi intuizioni nel trasporto nucleare.

2. Preparazione di proteine ​​essenziali per l'esperimento nucleare di trasporto

1. Per mezzo di una trasformazione dei ceppi batterici convenzionale speciale di E.coli (JM109) sono stati progettati in modo da iperespressione dei geni responsabiliproduzione delle proteine ​​di cui sopra degli interessi e sono conservate in magazzino a -80 ° C. (Per NLS-2xGFP abbiamo usato pTrcHisB vettore da Invitrogen). Un un'ansata o ~ 50 ml di scorte congelate di proteine ​​fluorescenti o merci cellule che esprimono E. Coli sono trasferiti al 5 ml di media LB con aggiunta di 5μL di ampicillina (U 1000) e cresciuto aerobico con agitazione overnight a 37 ° C a 225 giri al minuto.
2. Dopo 24 ore 500 ml di cultura satura viene trasferita in 500 ml di mezzi LB e scosso nel 37 ° C incubatore per 5-6 ore dopo l'aggiunta di 250 microlitri IPTG (Isopropyl _-D-1-thiogalactopyranoside) e incubate per un altro 5-6 ore. E 'necessario perché IPTG è un metabolita lattosio che innesca la trascrizione dell'operone lac, in cui viene sostituito il gene lacZ con il gene di interesse e IPTG viene poi utilizzato per indurre l'espressione genica.
3. La cultura è poi filata nel raffreddamento ad alta velocità centrifuga a 12000 rpm per 15 minuti e il supernatante viene scartato. Le cellule sono poi risospeso in 40 mL di CelLytic B (B CelLytic risultati in estrazione rapida ed efficiente di proteine ​​che sono adatti per purificazione di affinità e di analisi.) Il volume dovrebbe essere basata su 10 ml per 1 grammo di pellet. 28 ml di mercaptoetanolo viene aggiunto per rompere i legami disolfuro e 400 l di fluoro phenylmethanesulphonyl per disattivare proteasi da digerire proteine ​​di interesse dopo la lisi cellulare. Un "cocktail proteasi" è anche aggiunto (400 l di 0,2 mg / ml pepstatina A. 400 ml di 0,2 mg / ml leupeptina, 400 ml di 2 mg / ml di inibitore della tripsina) per garantire che gli estratti di proteine ​​non degradano prima analisi per target di interesse. Abbiamo poi aggiungere 400 microlitri 1M imidazolico, viene utilizzato per eluire le proteine ​​tag legati agli ioni Ni attaccato alla superficie delle perle nella colonna cromatografia e 1 mm di DNasi I, usato per degradare indesiderati DNA a singolo e doppio filamento in 5 phosphodinucleotide e oligonucleotidi frammenti.
4. Mescolate il composto in buio in ghiaccio per 30 minuti per consentire un tempo adeguato per la reazione, girano a 10000 rpm per 60 minuti nella centrifuga di raffreddamento. Raccolto il surnatante e in preparazione per la cromatografia eseguire l'infusione con Ni-NTA (nichel-nitrilotriacetico Superflow acido da Qiagen), facendo girare in provette da microcentrifuga alla massima velocità per 3 minuti e lavaggio con tampone di lisi, ripetendo la filatura e lavaggio fino a quando la miscela è chiara di qualsiasi tinta blu. Mescolate il composto risultante lentamente in un contenitore scuro in ghiaccio per 60 minuti.
5. Eseguire la cromatografia su colonna, che scorre attraverso 12 frazioni come segue. La prima frazione è un flusso attraverso di 10 mL di supernatante mescolato con Ni-NTA nel passaggio precedente. Il secondo è di 10 ml di tampone di lisi (50 mM Na-fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 8,0), terzo 10 mL di tampone (10 mM imidazolo, 100 mM NaCl, pH 8,0), il quarto e il resto sono 0,5 mL di tampone di eluizione (250 mM imidazolo, 100 mM NaCl, pH 8,0)
6. Preparare la SDS-PAGE gel di poliacrilammide e preparare i nostri campioni, mescolando 4 ml di una frazione e 1 ml di SB 5X (300mm Tris 6.8, 25% BME, 10% SDS, glicerolo 50%). Per lo standard che abbiamo usato 100 kb DNA ladder da Invitrogen. Prima di caricare i nostri campioni abbiamo bollito per 5 minuti. Dopo aver caricato abbiamo corso il gel a 120V per 60 minuti. Poi abbiamo macchiato, decolorato e infine essiccate in un essiccatoio speciale gel per 2 ore a 80C.
7. Abbiamo poi visto i risultati sul gel e trova le frazioni che ha dato il miglior risultato. A seconda delle proteine ​​di nostro interesse, le bande dovrebbero essere situate rispettivamente alle dimensioni di una proteina. Questa frazione deve essere selezionata per la purificazione di proteine ​​ulteriori MonoQ e Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. La concentrazione è effettuata dal giro delle frazioni più concentrata in Nanosep filtro con dimensione dei pori di 10K a 14 giri per 5 minuti, lavaggio con tampone di eluizione ogni volta. E 'necessario determinare la concentrazione finale di proteine ​​utilizzando il test BSA per ulteriore procedura di etichettatura delle proteine.
9. La fluorescenza intrinseca verde di NLS-2xGFP non possono essere utilizzati per l'imaging singola molecola di trasporto nucleare a causa della sua scarsa fotostabilità e lo spettro sovrapposti con autofluorescenza delle cellule. Così, abbiamo etichetta le molecole cargo con un eccesso di cisteina reattiva colorante organico (Alexa555 o Alexa 647 maleimmide da Molecular Probes) per 2 ore a temperatura ambiente in 50 mM di fosfato di sodio, 150 mM NaCl dopo aver ridotto con TCEP tris (2 - carbossietil) per 20 minuti. Reazioni sono state spento con 2-mercaptoetanolo, e le soluzioni di proteine ​​sono stati dializzati per rimuovere il colorante libero.

3. Microscopia singola molecola

1. Il nostro set di un microscopio comprende Olympus IX81 dotato di un NA 1,4 100x ad immersione in olio obiettivo (UPLSAPO 100XO, Olympus), un 35 mW 633 nm laser He-Ne (Melles Griot), una lampada al mercurio con GFP filtro impostato, una su -chip moltiplicazione guadagno ad accoppiamento di carica fotocamera del dispositivo (Cascade 128 +, Roper scientifico) e THe Slidebook pacchetto software (Intelligent Innovazioni Imaging) per l'acquisizione ed elaborazione dei dati. Un chopper ottico (Newport) è stato utilizzato per generare un on-off di eccitazione laser. GFP e Alexa647 fluorescenza è stato eccitato da una lampada al mercurio e 633 nm rispettivamente laser. L'emissione di fluorescenza verde e rosso sono stati raccolti dal medesimo obiettivo, filtrato da un filtro dicroico (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) e un filtro per le emissioni (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) e ripreso da una telecamera CCD identico.
2. In esperimenti di singola molecola, permettiamo il tempo photobleaching fluorescenza della molecola carico singolo ad essere più lungo di tempo di trasporto. Per determinare il tempo photobleaching, 0,1 molecole cargo nM sono placcati su una copertura in vetro antiscivolo e diventa immobile dopo 30 minuti a causa di assorbimento non specifico. Poi, la durata della fluorescenza viene misurata. A seconda della proteina di volte photobleach interesse sarà diverso in base al numero di cysteins in grado di reagire con maleimides, quindi l'intensità di illuminazione e la zona di illuminazione deve essere regolato in modo da non indurre un fotoscolorimento preliminare e assicurare che le molecole cargo etichettati con Alexa 647 schermo fluorescenza per più i carichi di interagire con gli NPC.
3. Per gli esperimenti importazione in cellule permeabilizzate, il carico e trasporto cofattori essenziali erano cumulabili. Tipiche reazioni merci di importazione contenuta 1 mM GTP, 0,5 mM Importin-, 0,5 mM Importin-1, 2 mM Ran e 1 microM NTF2 per il trasporto agevolato e 0,1 nM di 10KDa Destrano per trasporto passivo .. Concentrazioni di carico fluorescenti erano> 100 nm esperimenti alla rinfusa, e ~ 100 pM per le analisi di singola molecola. A queste concentrazioni,> 99% del carico è stata prevista la formazione di complessi con Importin e Importin. Tasso di trasporto è stato monitorato da epifluorescenza (se solo relative tariffe erano importanti) o di microscopia confocale a fluorescenza (se i tassi assoluti desiderato).
4. In primo luogo la posizione della membrana nucleare è stata determinata dalla grande campo epifluorescenza da coinvolgere un HBO mercurio lampada con una serie di filtri GFP per scattare una foto del NE. Le intensità dei pixel all'interno di una riga o colonna sono approssimativamente perpendicolare alla NE erano idonei con gaussiana. Le posizioni picco della gaussiana per un particolare insieme di intensità dei pixel è stata considerata la posizione NE per quella riga e colonna. Le posizioni di punta di una serie di gaussiane quali sono stati poi adattare con un polinomio di secondo grado, ottenendo il percorso del NE all'interno l'intera immagine.
5. Una volta che il NE è localizzato, è essenziale per sbarazzarsi di tutte le autofluorescenza 633 nm utilizzando un laser He-Ne finché non è completamente fotodecolorate, di solito più di 60 secondi è sufficiente.
6. Molecole del campione dovrebbe essere conservato in una soluzione 1,5% di PVP e la miscela aggiunto alla camera di flusso in un volume di 25 L e poi trascinato attraverso la camera di applicazione di uno stoppino di carta da filtro. Una cura estrema dovrebbe essere presa dopo l'aggiunta di proteine ​​carico l'importazione di cellule permeabilizzate subito dopo la localizzazione dell'involucro nucleare in quanto la messa a fuoco può essere facilmente interrotta da un movimento vigoroso.
7. Non appena le molecole cargo sono aggiunti, 633 nm è stato utilizzato laser He-Ne per illuminare le traiettorie di trasporto delle molecole di transito. Un chopper ottico (Newport) dovrebbe essere impegnato a circa 5 Hz per evitare la causa photobleaching ad una alta densità di potenza del laser, così come per consentire una nuova porzione di singole molecole non fotodecolorate di avvicinarsi al NE. Una serie di video di traslocazioni singola molecola dovrebbe essere presa con una telecamera ad alta velocità del CCD che può andare fino a 2500 Hz.

4. Rappresentante risultati

Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di raccogliere una serie di video che dimostrano la traslocazione di molecole cargo singolo interagendo con il complesso dei pori nucleari nel permeabilizzate HeLa POM 121 cellule. (Fig. 1). Abbiamo deciso di immagine e traccia le fasi di trasporto transitorio di molecole di destrano attraverso la NPC in digitonina-permeabilizzate cellule HeLa che esprimono stabilmente GFP-POM121. Le cellule sono state incubate con basse concentrazioni di molecole marcate destrano. Il piano equatoriale del nucleo è stato messo a fuoco con una chiara immagine di anello verde GFP fluorescenza eccitata da un 488-nm luce lampada al mercurio. Un lungo tempo di esposizione di GFP-NE ci permette di ottenere un eccellente rapporto segnale-rumore (SNR) rapporto di localizzare l'aereo mezzo al NE. In precedenza 10 kDa sono state trovate molecole di destrano a diffondere attraverso il NE nel giro di circa 2 ms con una risoluzione spaziale di circa 20-40 nm con un tasso di rilevamento cornice di 500 o 1000 Hz. Tale risoluzione spazio-temporale permette di catturare solo uno o due passi diffusione di molecole di destrano attraverso l'NPC che non è sufficiente a chiarire ulteriori informazioni spaziali per diffusione passiva. Per catturare fasi più belle di molecole di destrano all'interno della NPC con un Späti migliorerisoluzione otemporal, abbiamo condotto due importanti miglioramenti: (i) di adattarsi più velocemente un frame rate di rilevamento di 2500 Hz per catturare passi diffusione più belle e (ii) di impiegare una densità ottica maggiore illuminazione per eccitare di più fotoni da singole molecole di ottenere una maggiore risoluzione spaziale. Questi miglioramenti consentono di cogliere più passaggi di diffusione transitoria di alexa647 marcata con molecole di destrano in tutto il NE da un 633-nm luce laser ad irraggiamento di 100 kW / cm ² con una risoluzione spazio-temporale di 12 nm e 400 ms.

Come mostrato nella Figura 1, una serie di immagini fisse di eventi di trasporto tipico delle molecole di destrano sono stati registrati. Tracciando le traiettorie spaziali delle singole molecole transito destrano, i passi multa di diffusione attraverso la NE sono stati distinti. Abbiamo scoperto che vi sono circa il 30% degli eventi interazione con il NE hanno riconosciuto di origine e destinazione scomparti. Tra questi, le molecole di destrano passando dal citoplasma al NE hanno due destinazioni: fine nel nucleo, dopo la diffusione attraverso la NE o tornare al citoplasma dopo aver interagito con il NE La situazione simile si è verificato per gli eventi esportazione: le molecole di destrano a partire dal nucleo entrare nel citoplasma o diffusi torna al nucleo dopo aver interagito con il NE. Serie di immagini quali contengono informazioni sulla posizione spaziale delle singole molecole per quanto riguarda l'NPC, nonché informazioni temporale sul tempo di permanenza delle molecole attraverso la NPC. Analizzando le traiettorie delle molecole di destrano intorno alla zona di NE, la frequenza il tempo di trasporto, l'efficienza e l'ingresso può essere determinato. I tempi di trasporto nel nostro lavoro può essere identificato come l'importazione o il tempo di esportazione. Essi sono stati definiti come la media tempo di permanenza delle molecole di destrano all'interno della NPC che subiscono l'importazione o l'esportazione. L'importazione o l'esportazione di efficienza è stata definita come la percentuale di importazione completa o gli eventi esportare oltre la somma degli eventi completo e abortivi. L'ingresso di importazione o esportazione di frequenza si riferisce al numero di molecole che interagiscono con il NE nel corso di un secondo.

Figura 1. Fotogrammi video selezionati di eventi di trasporto tipico di molecole di destrano attraverso il NE. (A) citoplasma-to-nucleo evento. Una singola molecola destrano (macchia rossa) ha iniziato dal citoplasma, hanno interagito con il NE (linea verde pixel), e si è conclusa nel nucleo. Le traiettorie della manifestazione (linee blu e punti aperti) sono stati determinati e sovrapposti con il NE (linea nera). Le linee verdi e rosse rappresentano il 100 nm, distanza dalla NE sul citoplasma e la parte nucleare. C, il citoplasma. N, il nucleo. Scala grafica: 2 mm. (B) Un citoplasma-to-citoplasma evento. (C) Un nucleo a nucleo evento. (D) Un nucleo-to-citoplasma evento.

Discussion

Bisogna fare attenzione ad assicurare un adeguato colocalizzazione di molecole NE e singolo durante l'esperimento. E 'inoltre importante fornire un alto rapporto segnale rumore, specialmente quando il segnale è basso a causa di etichettatura poveri o photobleaching. Precisione di localizzazione è limitata dal rumore di fondo (derivanti da out-of-focus fluorescenza, il rumore di lettura CCD, i fattori di corrente di buio e di altri).