Summary
Bu yazıda, tavuk embriyo merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde insan kök hücrelerinin nakli için bir yöntem mevcut. Bu bir
Abstract
Tavuk embriyo normal embriyonik ve fetal gelişim eğitim ve xenotransplantation deneyler için standart bir hücre davranışlarını incelemek için klasik bir hayvan modeli
Protocol
1. İzolasyon ve embriyolar içine insan kök hücreleri ve enjeksiyon için hazırlık kültürü
- Bu protokol örnekleri (beyin, yağ, kemik iliği) olarak kullanılan insan kök hücreleri, farklı dokulardan farklı şekillerde izole edilmiştir. Örneğin, yetişkin nöral kök hücreler, sonra tek tek hücrelerin in vitro kültürü ayrışmış endoskopik nöroşirürji sırasında beynin ventrikül duvar alınan doku parçalarından izole edilmiştir . Nöral kök hücreler kendiliğinden diğer hücre tipleri 7 çanak alt uymak kültür ortamı float neurospheres oluşturur. Adipoz elde edilen mezenkimal kök hücreler, fibröz doku kaldırmak için enzimatik sindirilir ve gergin ve daha sonra olgun adipositlerin kaldırmak için santrifüj liposuction malzeme elde edilir. Ortaya çıkan hücreler diğer hücre türleri üzerinde 8 Hematopoetik kök ve progenitör hücreler kemik iliği aspiratlar manyetik partiküller (Myltenyi Biotec, Almanya konjuge özel antikorları kullanarak olumlu seçim izole edilebilir kök hücrelerin çoğalmasını teşvik etmek serumu kültür ortamında yeniden süspanse veya Dynal-Invitrogen, ABD) ve manyetik hücre ayırma ve / veya fluorophores ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) 9 konjuge antikorları kullanarak.
- Tavuk embriyoları içine implantasyon öncesinde floresan işaretleyici ile daha sonra kimlik, etiket, kök hücreler kolaylaştırmak. Kök hücreler, implantasyon öncesi kısa bir süre ya da kirlenmesine neden olan ana hücreler aslında hiçbir tehlike ile kalıcı bir etiket kadar tedarikçi önerilen protokolleri kullanarak DII (Invitrogen, ABD) veya PKH26 gibi lipofilik floresan boyalar (Sigma, ABD) etiketli olabilir hala kültür 10 iken, lentiviral vektörleri kullanılarak, Yeşil Floresan Protein gibi bir flüoresan protein geni taşıyan transduced olabilir.
- Insan kök hücrelerin kültür ve yayılma için protokolleri değişir. Detaylı protokolleri literatürde bulunabilir. Kısaca, yapışık kök hücreler genellikle petri kaplarına kültüre ise küre oluşturan kök hücreleri genellikle uygun bir ortamda, (yarma, aşağıya bakınız öğütme kolaylaştırmak), matara kültürü vardır. Bölme veya hasat için, pelet küre oluşturan hücreleri en fazla 5 dakika süreyle 37 º C önceden ısıtılmış tripsin / EDTA çözeltisi 1200rpm ve tekrar süspansiyon az 5 dakika santrifüj. Yapışık hücreler petri tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve 5 dakika sonunda çiğnemek için. Ca 2, bazen albümin ile tamamlanmaktadır orta, + içeren ekleyerek trypsinization sonlandırın . Tripsin / EDTA kaldırmak hücreleri (1200rpm az 5 dakika) santrifüj için, soğuk enjeksiyon araç içinde tekrar süspansiyon (genellikle orta veya fosfat tamponlu salin solüsyonu), süpernatant kaldırmak ve tekrar santrifüj (1200rpm az 5 dakika). Bu supernatant en kaldırın ve yavaşça, oldukça konsantre bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- Birkaç saat önce enjeksiyon için, buz üzerinde, küçük, kapaklı flakon veya mikrofuge'de tüp insan kök hücreleri süspansiyon tutun. Bu durumda Survival hücre tipine bağlı olabilir. Enjeksiyon araç adhesivity (örneğin bir düşük Ca 2 + araç topaklanma önlemeye yardımcı olabilir) ve hipoksi ve pH değişiklikleri direnci de dahil olmak üzere, hücrelerin özelliklerine göre optimize edilmelidir.
2. Yumurta kuluçka ve hazırlık
- ° C inkübasyon için önce 14-15: Mağaza bir soğutma odası (Termaks, Bergen, Norveç gibi) yumurta döllenir. Inkübasyon başlayana kadar bu sıcaklık geliştirme tutuklandı. Yaklaşık 10 gün daha fazla veya daha düşük sıcaklıklarda saklanan döllenmiş yumurta daha düşük bir sonraki gelişim ve hayatta kalma oranına sahip.
- Istenilen gelişme aşamasında ulaşılana kadar (evreleme için bkz. Ürün, 38-39 ° C ve inkübe 11: geliştirme yeniden başlatmak için, yumurta, zorla nemlendirilmiş bir taslak inkübatör (Binder, New York, ABD gibi) yerleştirin. .)
- Yumurta açmadan önce, (Şekil A) yumurta kabuğu (çok derinden sarısı piercing önlemek için) ile 18 gauge bir şırınga iğnesi takılması ve 4 ml albümin tahliye embriyo üzerinde bir hava cebi oluşturun. Bu, birkaç dakika içinde gözenekli kabuğun hava yoluyla giriş eşitledi bir basınç düşüşü oluşturur. Hava girerken, böylece kabuk iç yüzeyine embriyo ayıran kabuk içinde en yüksek noktada toplar.
- Şırınga iğnesi ile geleneksel plastik bant ile oluşturulan delik Seal.
3. Cam mikropipetler Çekme
- Borosilikat cam, cam mikropipetler çekin (örneğin, 1.2mm OD x 0.94 mm kimliği, Harvard Apparatus, ABD), geleneksel bir elektrot çektirmesi (örneğin, Model P-2000, Sutter Instruments, ABD). Microel olarak kullanılan, yüksek giriş direnci mikropipetler elde etmek için çektirmenin ayarlarını yapınectrodes. İpuçları yaklaşık 1-1.5 cm uzunluğunda olması gerekir. Milleri çıkarılır hacimleri hesaplamak için 1 mm aralıklarla işaretlenmiş olabilir.
- Bükme veya bir forseps ile mikroskop altında izlerken sağlam bir zemine karşı iterek uygulanabilir bir boyutu mikropipet ipuçları kırın. Break cam çevresinde mümkün olduğunca düz olmalı ve ucunda ortaya çıkan iç çapı tıkanmış almak alınmadan kullanılamaz hücrelerin boyutuna uyması gerekir. Genellikle 20-30 mikron iç çapı iyi çalışır.
4. Hızlı Yeşil boya solüsyonu (zıt reaktif) hazırlanması
- Hızlı Yeşil boya (Sigma-Aldrich, ABD) bir tavuk serum fizyolojik (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM eriterek% 0,1 (w / v) solüsyonu hazırlayın Na- fosfat, 5 mM Hepes, 11 mM glikoz, pH 7.4).
- 0.22 mikron Millex GP filtresi (Millipore Co, Bedford, ABD) ile Hızlı Yeşil çözüm Filtre.
5. Açılış yumurta ve embriyo zıt
- Hava cebinin boyutları kapsayan iki adet yumurtanın üstüne bant yerleştirin. Yumurta odaklı tutulması bantlanmış alan (ve dolayısıyla hava cebinde) üst olduğunu, sağlam bir diseksiyon makas kullanarak bantlanmış alanının sınırları içinde küçük bir pencere kesmek. Bant desteği ekler ve kabuğu parçaları embriyo üzerine düşmesini önlemeye yardımcı olur. Hava cebi ile ilişkili hava kabarcıkları, plastik bir pipet veya diğer künt prob arka uç kullanarak attı.
- 25 gauge iğne ile 1 ml şırınganın içine bazı Hızlı Yeşil çözüm çizin. Şırınga ve iğne herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. 45 derecelik bir açı ile iğne Bend, embriyonik plaka (bu çemberle kan damarlarının halka tarafından belirlenen, embriyonik plaka artar ölüm içinde piercing) dışında bir noktada nüfuz ve embriyo dikkatle altında nakış kılavuzu. Arzu edilen kontrast elde edilinceye kadar boya enjekte edilir. Normalde şeffaf olan embriyo, koyu yeşil renkli (Şekil B) karşı beyazımsı bir hayalet olarak göze çarpıyor. Birçok araştırmacı, Hindistan Mürekkep (% 10 v / v seyreltilmiş) Hızlı Yeşil yerine kullanın. Bu durumda Pelikan Fount Hindistan Mürekkep gibi toksik olmayan Hindistan Mürekkep, kullanılması önemlidir.
6. Beyin ve omurilik nöral tüp lezyonları
- Bilenmiş tungsten iğneler üretin alev gravür asetilen / oksijen meşale ile 100 mikron çapında tungsten çubuk (katalog numarası 719.000, A & R Sistemleri, Seattle, Washington) kısa (2-3 cm) adet. Bu meşale alev içine keskin bir ucu geride bırakarak, patlayıcı erozyon tungsten dış katmanları temsil eden bir kıvılcım, görüldüğü kadar çok kısa çubuğun sonuna ekleme yapılır.
- Yoluyla, bilenmiş bir tungsten iğne, dilim kullanma ve mikrocerrahi alanında kapsayan vitellin membran saptırmak.
- Ikinci bilenmiş bir tungsten iğne (vitellin zarından dilimleme sonra ilk iğne ucu genellikle zarar görmüş ve daha sonraki mikrocerrahi için uygun değil) kullanarak, nöral tüp örten epitel ile dikkatlice kesilmiş ve saptırmak, sonra etrafını kesin ve parçanın altında nöral tüp kullanarak, kısa, hızlı yukarı doğru hareketlerle (Şekil C) kaldırılacak. Genellikle uzunlamasına keser sonra enine keser ilk ve en başarılı. Çok derin kesmeyin ya da genellikle ölümcül penetran yatan kan damarları, riske.
- Nazikçe çevirin veya tungsten iğne ile lezyon yerinde uzak rezeke edilen doku parçası sürükleyin. Bu zor görünüyorsa, aynı zamanda esnek borular bağlı bir cam mikropipet kullanarak ağız emme kaldırılmış olabilir.
7. Insan kök hücre enjeksiyonu
a. Nöral tüp bir lezyon içine enjeksiyon
, Plastik bir tüp kullanarak ağız emme ucu bir cam mikropipet içine küçük bir miktar hücre çizin. Hücre süspansiyonu çalışma konsantrasyonu enjekte edilecek hücre tipi için optimize edilmiş olmalıdır. Mount bir micromanipulator mikropipet ve mikroenjektör pompası (örneğin: PV830 Pnömatik PicoPump, TEFE, Washington, ABD) bağlayın. Diseksiyon mikroskobu kullanılarak görsel kontrol altında, lezyon içine mikropipet ucu kılavuzu ve hava basıncı (ya sabit basınç darbe veya basınç yavaş yavaş yukarı Ramping) (Şekil C) artırarak hücreleri dikkatli bir şekilde sınırdışı. Lezyon yerinde istenilen miktarda hücre içinde yatırılır, mikropipet dikkatlice geri çekin.
b. Nöral tüp lümeni içine enjeksiyon
Hücreleri, sinir doku lezyonlarının yokluğu erişmek için yeterli invaziv, bazı durumlarda bu, örneğin, gelişmekte olan beyinde ventriküller içine hücreleri enjekte etmek istenebilir. Herhangi bir br lümenine hücre Enjeksiyondeğil bölgesi lümen yeterince büyük bir priz sağlar ve kolayca erişilebilir olduğu bir gelişimsel aşaması gerektirir; 12 ila 18 HH aşamalarında, bu konuda olumlu. Bir lezyon gerekli değildir. Sadece nöral tüp cam mikropipet önce hücre enjeksiyonu ile duvar delmek. Bu yöntemin başarısı için kilit unsurları mikropipet ve penetrasyon abruptness keskinliğini, çok yavaş bir hareket ve mikropipet ucu sadece nöral tüp duvar delmeden Köşelerini olabilir.
c. Sistemik enjeksiyon
Sistemik enjeksiyonları (bu gemiler iyi gelişmiş, HH aşamada 15 itibaren) ekstra embriyonik kan damarları aracılığıyla yapılabilir. Bu müstesna bir miktar kanama ile birlikte, çok sayıda küçük arterlerin ve daha az büyük damarlar vardır çünkü embriyonun hayatta kalması için söz konusu olduğunda, intra-arteriyel enjeksiyonlarının genellikle güvenli değildir. Öte yandan, intravenöz enjeksiyonlar hücrelerin daha eşit dağılımı ve böylece muhtemelen kalp hücrelerinin daha hızlı erişim sağlamak ve. Başarılı bir enjeksiyon hedeflenen gemi daha küçük bir çapa ile keskin bir mikropipet gerektirir. Küçük bir açıyla (30 derece) yatay ekseni boyunca gemi Yaklaşım. Gemi karşı mikropipet gemi kapamak için başlayana kadar itin. Sonra daha da nüfuz etmek için bir firma, ani hareket itin. Kan kapiller eylem mikropipet ucu içine çekmek görüldüğü kadar yavaşça geri çekin. Hücre enjeksiyonu sonra mikropipet hızlı bir hareket ile geri çekilir sonra, sabit basınç kullanarak olmalıdır.
8. Yumurta Sızdırmazlık
- Enjeksiyondan sonra, yumurta enjekte edilen hücrelerin yerleşmek ve uyması için birkaç dakika için hala ayakta. Dehidratasyon (hızlı oluşabilir ve ölümcül) önlemek için, bir parça, bu dinlenme döneminde pencere üzerinden, doku ya da filtre kağıdı nemlendirilmiş yatıyordu.
- Bir kaç dakika ve hücrelerin yerleştikten sonra, pencerenin etrafında kabuk kuru ve geleneksel plastik bant ile pencere mühür. Bu mühür sıkı ve açıklıktan ya da kabuk ve bant (bu genellikle sonraki kuluçka sırasında ölümcül kanıtlıyor) arasında hiçbir albümin kaçağı emin olun.
- Daha da geliştirilmesi için zorunlu taslak inkübatör yumurta değiştirin. Gözlem penceresi üzerine bandı kaldırarak aralıklarla yapılabilir.
9 - Embriyo diseksiyonu
- Sonra embriyo istenilen aşamaya ulaşmıştır, buz gibi soğuk serum fizyolojik veya fosfat tamponlu salin (pencere bandı kapsayan iki yarısı kabuğu ayırmak için izin vermek için ilk kesilmiş olmalıdır). Bir kase içine yumurta açık çatlamak Buz gibi soğuk salin hipotermi embriyo uyutmak için hizmet vermektedir. Kalp hızlı, yavaş ve birkaç dakika içinde durması gerekir.
- Extraembryonic membranlar embriyo ayırın ve ref kullanarak sahne. 11.
- Silikon kauçuk zemin ve glikoz (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-fosfat, 5 ile desteklenmiş oksijenli serum fizyolojik içeren bir diseksiyon çanak transferi, embriyo başını kesmek mM HEPES, 11 mM glukoz, pH 7.4) ve hızlı ventral tarafta pin up. Abdominal ve torasik organlar çıkarın. Açılı bir makas kullanarak, vertebral kolonun her ventrolateral yönü boyunca uzunlamasına insizyonlar olun. Özellikle ileriki aşamalarında (gelişim 6 gün sonra), omurga ve omurilik arasındaki boşluğu büyük lumbosakral bölgede bulunan en iyi ilk kesi yapılır. Vertebral kolonun ventral omurilik ortaya çıkarın. Serum fizyolojik saf medikal oksijen ile yaklaşık 10 dakikalık aralıklarla köpürme oksijenli kaldığından emin olun.
- Dikkatli bir şekilde, her iki tarafta doğmakta olan dorsal ve ventral kökleri kesmek istenilen düzeyde omurilik transect ve vertebral kanal yavaşça dışarı çıkarın. Omurilik bu durumda kaç saat boyunca hayatta ve anatomik ve fizyolojik 12 13,14 deneyler tabi tutulabilir.
Albumin tahliye edilmesi için Şekil 1 A) uygun bir yaklaşım. Embriyonun konumu ve iğne yerleştirilmesi unutmayın. B) embriyo Karşıt. Embriyonik diskin dışında iğne penetrasyon noktası unutmayın. C), tek taraflı spinal nöral tüp lezyon için prosedür şematik hücre nakli izledi.
Discussion
Tavuk embriyo xenotransplantation deneyler için uygun ve çok yönlü bir hayvan modeli. Embriyonik ve fetal gelişim sırasında fonksiyonel bir bağışıklık sistemi eksikliği inkübasyon sıcaklığı tolere bir tür hücrelerin hayatta kalma ve gelişme izin verir. Tavuk embriyolar kök hücreler (ref yorumlanan 15) çeşitli türleri rejeneratif potansiyelini test etmek için kullanılmaktadır. Memeli kök hücrelerin, merkezi sinir sistemi, aksonal projeksiyonlar nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir de dahil olmak üzere tavuk embriyo dokuları içine entegre edebilirsiniz, sinaptik bağlantı ve elektrofizyolojik özellikleri fonksiyonel nöral devreleri 1,2 bağlamında değerlendirilebilir.
Cerrahi işlemler nispeten kolay ve enjeksiyonlar yerine stereotaksik kontrolü görsel altında yapılır için, embriyo sayısı kolayca tek bir deney içinde farklı deneysel koşullara uyum sağlamak için arttırılmış olabilir. Genelde hücrelerin içinde 20-30 embriyolar 4 saatlik deneme içine enjekte edilebilir. Embriyoların enjeksiyon sonrası ölüm başlıca sınırlayıcı faktör. Önlemler, kanama ve dehidratasyonu önlemek için alınmalıdır. Doğal ölüm oranı artar bazı kritik gelişim evreleri vardır farkında olun. Sıcak, steril tavuk zil sesi aşağıdaki enjeksiyon ve kritik gelişim evreleri bir gün önce bir kaç mL embriyo ilave yanı sıra yumurta pencere, sızıntıyı önlemek için mühürlü ve odaklı bir hayatta kalma geliştirir sağlamak. Bant mühür aracılığıyla sızıntı meydana gelirse, yüzeyler ve yeniden-teyp bandı çıkarın kuru. Bazı araştırmacılar, pencere mühür, mum ve cam veya plastik lamelleri kullanın. Mortalite plasebo çalışan embriyolar karşı enjekte önemli ölçüde farklı olmamalıdır.
Biz burada insan kök hücreleri, beyin ve omurilik anlage içine enjeksiyon odaklı olmasına rağmen, kök hücreleri de diğer organların anlage (örneğin ref 4) içine enjekte edilir. Her organ kendi zorlukları teşkil etmektedir. Örneğin, kalp içine enjeksiyon çünkü penetrasyon pipetle yüksek mekanik direnci ve diğer yandan embriyoların enjeksiyonu önce oda sıcaklığına soğutma önlenebilir hareketleri, çünkü zor olabilir. Lümen eksikliği Organları yeterli miktarda enjeksiyon uygun olmayabilir ve bu nedenle bir priz oluşturmak için cerrahi lezyon gerekebilir. Insan kök hücreleri, doku içine entegrasyonu teşvik çünkü deneyimlerimiz, lezyon sonrası doku rejenerasyonu bir avantajdır. Hücreler aynı zamanda nöral krest-türetilen periferal ganglionlarda 16,17 mezenkimal türevleri de dahil olmak üzere, içine dahil ulaşmak için bir yol olarak dispersiyon somitic mezenşimin veya göç eden nöral krest gibi embriyonik mezenşimin içine enjekte edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Helse og Rehabilitering (JLB), Norveç Araştırma Konseyi (GH ve JCG) ve Oslo Üniversitesi (NK ve JCG) hibe tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Sigurjonsson, O. E., Perreault, M. C., Egeland, T., Glover, J. C. Adult human hematopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 5227-5232 (2005).
- Pochampally, R. R., Neville, B. T., Schwarz, E. J., Li, M. M., Prockop, D. J. Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9282-9285 (2004).
- Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells to the chick embryo. Methods Mol. Biol. 331, 137-151 (2006).
- Lee, H., Shamy, G. A., Elkabetz, Y., Schofield, C. M., Harrsion, N. L., Panagiotakos, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Wichterle, H., Peljto, M., Nedelec, S. Xenotransplantation of embryonic stem cell-derived motor neurons into the developing chick spinal cord. Methods Mol. Biol. 482, 171-183 (2009).
- Westerlund, U., Svensson, M., Moe, M. C., Varghese, M., Gustavsson, B., Wallstedt, L., Berg-Johnsen, J., Langmoen, I. A. Endoscopically harvested stem cells: a putative method in future autotransplantation. Neurosurgery. 57, 779-784 (2005).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol. Biol. 325, 35-46 (2006).
- Smeland, E. B., Funderud, S., Kvalheim, G., Gaudernack, G., Rasmussen, A. M., Rusten, L., Wang, M. Y., Tindle, R. W., Blomhoff, H. K., Egeland, T. Isolation and characterization of human hematopoietic progenitor cells: an effective method for positive selection of CD34+ cells. Leukemia. 6, 845-852 (1992).
- Zhang, X. Y., La Russa, V. F., Bao, L., Kolls, J., Schwarzenberger, P., Reiser, J. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol. Ther. 5, 555-565 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88 (1), 44-92 (1951).
- Glover, J. C. Retrograde and anterograde axonal tracing with fluorescent dextrans in the embryonic nervous system. Neuroscience Protocols. 30, 1-13 (1995).
- O'Donovan, M. J., Bonnot, A., Mentis, G. Z., Arai, Y., Chub, N., Shneider, N. A., Wenner, P. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Mendelson, B., Frank, E. Specific monosynaptic sensory-motor connections form in the absence of patterned neural activity and motoneuronal cell death. J. Neurosci. 11, 1390-1403 (1991).
- Glover, J. C., Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N. Chimeric Animal Models in Human Stem Cell Biology. ILAR Journal. 51, 62-73 (2009).
- Lee, G., Kim, H., Elkabetz, Y., Al Shamy, G., Panagiotakos, G., Barberi, T., Tabar, V., Studer, L. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Jiang, X., Gwye, Y., McKeown, S. J., Bronner-Fraser, M., Lutzko, C., Lawlor, E. R. Isolation and characterization of neural crest cells derived from in vitro differentiated human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 18, 1059-1070 (2008).
