Summary
Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.
Abstract
Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.
Protocol
1. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- GKD 2 O
- % 0.1 'lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak.
- Otoklav.
- % 4 Paraformaldehit Fix - PBS-DEPC
- Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce
- Sindirim Durdur Tamponu
- Prehybridization Tampon
- 50:50 PBT: Prehybridization Tampon
- Hibridizasyon Tampon
- Çözümler RNaz ücretsiz tutulmalıdır. Ya da pişmiş cam eşya (4 saat 250 ° C) ya da atılabilir plastik kullanın. Serolojik pipetler çözümleri yapmak için çok kullanışlıdır
- PBS içinde kanatları teşrih zaman aşamalı pupa
- Oda sıcaklığında 24 kuyu kültür plaka kuyularda Tampon saptamak için doğrudan kanatları hareket ettirme
- 2 saat için diskler Fix
- PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
- Proteinaz K çözüm, 3 dakika boyunca kanatları inkübe
- Sindirim Durdur Tamponu 2 x durulayın
- PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
- 50:50 PBT 2 x 5 dakika Yıkama: PHB
- PHB olarak 1 x 10 dakika yıkayın
- PHB en az 1 saat inkübe 55 ° C.
- Isı doğasını RNA prob (20 50ng de her ihtiyaç) (80 ° C 5 dakika) ve hibridizasyon tamponu (ul 100 de ortalama gerekli)
- Kuyulara prob ekleyin ve 55 az 48 saat inkübe ° C
3. GÜN
- 4 x 5 dakika yıkayınız 55 ° C PHB
- 55 PHB gece inkübe ° C
4. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Antikor Blok Tamponu
- PHB: 50:50 PBT 1 x 5 dakika yıkayın
- PBT içinde 4 x 5 dakika yıkayın
- 4 Blok Tampon 1 saat inkübe kanatları ° C
- 4 geceleme anti-Kazı antikor 1:2000 dilüsyon kanatları inkübe ° C
5. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Algılama Tampon
- Gelişmekte olan Çözümü - ışığa karşı hassastır (folyo ile sarın)
- Oda sıcaklığında PBT 3 x 5 dakika yıkayın
- PBT yıkayın 7 x 5 dakika
- Algılama Tampon kanatları iki kez durulayın
- Çözüm Geliştirme 1 ml kanatları geliştirin gelişme zamanı her zaman kontrol edilmelidir gelişmekte kez aynı probları ve gelişmekte olan çözümü kullanırken bile değiştirebilirsiniz genellikle gecede aralıklarla kadar artırmaya sonra 5-10 dakika sonra kontrol edin ve. Plaka örnekleri kontrol ışığa maruz önlemek için folyo sarılı olmalıdır.
- Gelişmekte olan Durdur Tampon beş kez durulayın
- Kanatları Dağı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokollerin optimizasyonu
Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil edilmelidir. Protokolünde ilk düzeltme süresi çok daha uzundur ama post-fix adım kaldırıldı. Biz Proteinaz K çözümü 10 kat seyreltme, hala başarılı bir prob penetrasyon için izin verirken kırılgan pupa kanat dokusu için gerekli olduğunu bulundu. Ayrıca kanatları bloke antikor boyama arka plan büyük ölçüde azalır önce, antikor inkübasyon gecede artan ise 4 ° C sinyal gücü artmıştır.
Uygulamalar
Bu protokol uygulamaları çok çeşitlidir. Gelişmekte olan bir pupa kanadında bir aday gen ifadesi yerelleştirmek edememek kanat veya kanat desen gelişimi sırasında bazı fonksiyonel rolü bu genin karıştığı ilk adım olacaktır (Marcus ve ark 2004;. Ramos ve ark 2006). Kanatlarında diğer sistemlerle etkileşim bilinen birçok gen birlikte ortak ifade iseniz bu roman kanat desenleri belirterek, daha ayrıntılı bir gen ağları seçenek saklı (Monteiro ve ark 2006). Kelebek kanadı desen evo-devo ilişkin evo-devo sorular gen ve gen ağ co-seçeneği, yenilik, evrim, evrim, yakınsak ve paralel özelliklerin seri homoloji evrim ve gen süreçleri kapsayan zengin bir sistem sağlar çoğaltma ve alt-işlevsellik entegre bir şekilde incelenebilir. Ayrıca, kelebeklerin kanat desenleri türlerin tanınması, cinsel seçim, taklit, termoregülasyon ve yırtıcı kaçınma bir rol oynayan şaşırtıcı bir çeşitlilik gösterir. Arkasındaki genetik ve gelişimsel olarak bu desenleri, üretim, hem de belirli kalıpları lehine ekolojik faktörleri anlamak, evrim süreci ve bu sürecin gelişim sistemleri tarafından dayatılan önyargıları ve kısıtlamalar bütüncül bir anlayış bize getirebilir.
Farklı türlerin uyum için optimizasyon kuralları
Farklı türlerin kanatları bu protokol adapte, ana endişe doku bütünlüğünü korurken prob doku geçirgen yapıyor olacak. Bu nedenle, fiksasyon ve permeablization adımları optimize edilmesi gerekecektir. Bicyclus pupa kanat için, biz taze PFA tampon ve nazik bir proteinaz K sindirimi oda sıcaklığında 2 saat düzeltme yeterli olduğunu buldular. Dokular 4 ° C gerekirse 12 saat kadar sabit ama sinyal azaltacaktır üzerinde düzeltme doku mümkün olabilir, kısa bir fiksasyon kez tercih edilmektedir. Enzim konsantrasyonu ve sindirim uzunluğu ve sıcaklık her doku için ampirik olarak tespit edilmelidir. Büyük kanat, daha ayrıntılı cuticular yapılara sahip ve daha uzun bir sindirim nay gerektirir kanat sindirimler yaşı da önemli bir faktör olabilir. Piyasada mevcut olan Proteinaz K hazırlıkları bu nedenle, belirli bir faaliyet için standardize değildir ve hatırlamak önemlidir, sindirim koşulları da çok sayıda değişen ayarlanması gerekebilir. Geçirgenliği dokuların da örneğin% 1 Triton-X çözümü, deterjan kuluçka tarafından artış olabilir. Bu prehybridization adıma önce eklenebilir.
Başka bir kaygı prob boyutunu optimize etmek için olacak, başparmak genel kural daha büyük olan daha iyidir. Heliconius de situs geç pupa kanat Bob Reed, bir hedef boyutu (kişisel görüşme) 300 bp önerdi. Büyük probları, sinyal özgüllüğü artırabilir, hücre içine girişini yardım etmek hidrolize olabilir. Diğer sistemlerde, ancak araştırmacılar, rutin hidrolize olmadan 1 kb probları. İşte biz de iyi çalıştı 300bp etrafında problar kullanılır.
Riboprobes ile Çalışma taşıma RNA için kullanılır laboratuvarları için korkutucu olabilir. Biz bu tekniği oldukça sağlam olması ve birkaç adım RNaz aktivite nedeniyle prob kaybını en aza indirmek için bulduk. Proteinaz K sindirimi RNaz kirlenme kaldırmak ve prehybridization / hibridizasyon tamponlar% 50 formamid RNaz aktivite inhibe (Chomczynski 1992). Bu nedenle, insanlar sinyal özgüllüğünü artırmak riboprobes kullanmaya teşvik ve bazı düşünebilirsiniz kadar yıldırıcı değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Jayne Selegue Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadiç Bob Reed, Roche Teknik Destek Bu protokol sorunları giderme konusunda yardım için teşekkür ederim. Biz de film düzenleme William Piel tavsiye için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
